Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen
Summary
Een protocol voor de generatie van dynamische chemische landschappen door fotolyse binnen microfluïde en millifluïde opstellingen wordt gepresenteerd. Deze methodologie is geschikt om diverse biologische processen te bestuderen, waaronder het motile gedrag, de opname van voedingsstoffen of aanpassing aan chemische stoffen van micro-organismen, zowel op eencellig als populatieniveau.
Abstract
We demonstreren een methode voor de generatie van gecontroleerde, dynamische chemische pulsen-waar gelokaliseerde chemoattractant plotseling beschikbaar wordt op de microschaal- om micro-omgevingen te creëren voor microbiële chemotaxis experimenten. Om chemische pulsen te maken, ontwikkelden we een systeem om aminozuurbronnen bijna onmiddellijk te introduceren door fotolyse van gekooide aminozuren in een polydimethylsiloxane (PDMS) microfluïde kamer met een bacteriële suspensie. We hebben deze methode toegepast op de chemotactische bacterie, Vibrio ordalii, die actief deze dynamische chemische gradiënten kan beklimmen terwijl ze worden gevolgd door videomicroscopie. Aminozuren, biologisch inert (‘gekooid’) door chemische modificatie met een fotoverwijderbare beschermende groep, zijn gelijkmatig aanwezig in de suspensie, maar niet beschikbaar voor consumptie tot hun plotselinge release, die optreedt op door de gebruiker gedefinieerde punten in tijd en ruimte door middel van een bijna UV-A gerichte LED-balk. Het aantal moleculen dat vrijkomt in de puls kan worden bepaald door een kalibratierelatie tussen blootstellingstijd en ontwetelste fractie, waarbij het absorptiespectrum na fotolyse wordt gekenmerkt door het gebruik van UV-Vis spectroscopie. Een nanoporeus polycarbonaat (PCTE) membraan kan worden geïntegreerd in het microfluïde apparaat om de continue verwijdering door stroom van de ontgaardde verbindingen en de verbruikte media mogelijk te maken. Een sterke, onomkeerbare binding tussen het PCTE membraan en de PDMS microfluidic structuur wordt bereikt door het membraan te coaten met een oplossing van 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), gevolgd door plasmaactivering van de te binden oppervlakken. Een computergestuurd systeem kan door de gebruiker gedefinieerde sequenties van pulsen genereren op verschillende locaties en met verschillende intensiteiten, om hulpbronnenlandschappen te creëren met voorgeschreven ruimtelijke en temporele variabiliteit. In elk chemisch landschap kan de dynamiek van bacteriële beweging op individuele schaal en hun accumulatie op populatieniveau worden verkregen, waardoor de kwantificering van de chemotactische prestaties en de effecten ervan op bacteriële aggregaties in ecologisch relevante omgevingen mogelijk wordt.
Introduction
Microben vertrouwen op chemotaxis, het proces van het detecteren van chemische gradiënten en het wijzigen van de beweeglijkheid in reactie1,om chemische landschappen te navigeren, voedingsbronnen en gastheren te benaderen en schadelijke stoffen te ontsnappen. Deze microschaalprocessen bepalen de macroschaalkinetiek van interacties tussen microben en hun omgeving2,3. Recente ontwikkelingen in microfluidica en microfabricage technologieën, waaronder zachte lithografie4,hebben een revolutie teweeggebracht ons vermogen om gecontroleerde micro-omgevingen te creëren waarin de interacties van microben te bestuderen. In het verleden zijn bijvoorbeeld bacteriële chemotaxi’s onderzocht door sterk gecontroleerde, stabiele gradiënten van tussenliggende tot hoge nutriëntenconcentraties te genereren5,6. In natuurlijke omgevingen kunnen chemische gradiënten op microschaal echter van korte duur zijn, verdrijving door moleculaire diffusie en achtergrondomstandigheden zijn vaak sterk verdund7. Om de chemotactische respons van microbiële populaties die voor het eerst werden blootgesteld aan onstabiele chemische omgevingen direct te meten, bedachten en beschrijven we hier methoden om microfluïdetechnologie te combineren met fotolyse, waardoor gradiënten nabootsen die wilde bacteriën in de natuur tegenkomen.
Uncaging technologie maakt gebruik van lichtgevoelige sondes die functioneel biomoleculen in een inactieve vorm inkapselen. Doorstraling komt het gekooide molecuul vrij, waardoor een biologisch proces gericht kan worden verstoord8. Als gevolg van de snelle en nauwkeurige controle van cellulaire chemie die de ontwering biedt9, fotolyse van gekooide verbindingen is traditioneel gebruikt door biologen, fysiologen en neurowetenschappers om de activering van genen te bestuderen10, ionkanalen11, en neuronen12. Meer recent hebben wetenschappers gebruik gemaakt van de aanzienlijke voordelen van fotolyse om chemotaxis13te bestuderen , om de flagella switching dynamiek van individuele bacteriële cellen blootgesteld aan een stapsgewijze chemoattractant stimulus14,15te bepalen en om beweeglijkheidspatronen van enkele zaadcellen in driedimensionale (3D) gradiënten te onderzoeken16.
In onze aanpak implementeren we fotolyse van gekooide aminozuren in microfluïdische apparaten om de gedragsreactie van een bacteriële populatie te bestuderen op gecontroleerde chemische pulsen, die bijna onmiddellijk beschikbaar worden via fotorelease. Het gebruik van een doelstelling met een lage vergroting (4x) (NA = 0,13, diepte van de focus ongeveer 40 μm) maakt zowel de waarneming van de aggregatieve respons op populatieniveau van duizenden bacteriën over een groot gezichtsveld (3,2 mm x 3,2 mm) als de meting van beweging op eencellige niveau mogelijk. We presenteren twee toepassingen van deze methode: 1) het vrijkomen van een enkele chemische puls om bacteriële accumulatie−dissipatiedynamiek te bestuderen vanaf uniforme omstandigheden, en 2i) het vrijkomen van meerdere pulsen om de bacteriële accumulatiedynamiek te karakteriseren onder tijdsvariërende, ruimtelijk heterogene chemoattractante omstandigheden. Deze methode is getest op de mariene bacteriën Vibrio ordalii die chemotaxis uitvoeren in de richting van het aminozuur glutamaat17, maar de methode is in grote lijnen van toepassing op verschillende combinaties van soorten en chemoattractants, evenals op biologische processen buiten chemotaxis (bijvoorbeeld, opname van voedingsstoffen, blootstelling aan antibiotica, quorumsensing). Deze aanpak belooft te helpen de ecologie en het gedrag van micro-organismen in realistische omgevingen te verduidelijken en de verborgen afwegingen te ontdekken waarmee individuele bacteriën worden geconfronteerd bij het navigeren in kortstondige dynamische gradiënten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode stelt onderzoekers in staat om bacteriële chemotaxis te bestuderen onder gecontroleerde, dynamische gradiënten in micro- en millifluïdische apparaten, waardoor reproduceerbare gegevens kunnen worden verkregen. De bijna ogenblikkelijke creatie van chemische pulsen op microschaal door fotolyse heeft tot doel de soorten voedingspulsen te reproduceren die bacteriën in het wild tegenkomen uit een reeks bronnen, bijvoorbeeld de verspreiding van pluimen achter zinkende mariene deeltjes25…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de eerste microfabricagefaciliteit van ETH Zürich. Dit werk werd ondersteund door een Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (aan D.R.B.), een Gordon en Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (aan R.S.), en een Swiss National Science Foundation subsidie 1-002745-000 (naar R.S.).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
