Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens
Summary
Ein Protokoll zur Erzeugung dynamischer chemischer Landschaften durch Photolyse in mikrofluidischen und millifluidischen Setups wird vorgestellt. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, einschließlich des Motilverhaltens, der Nährstoffaufnahme oder der Anpassung an Chemikalien von Mikroorganismen, sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene.
Abstract
Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung kontrollierter, dynamischer chemischer Impulse, bei denen lokalisiertes Chemoattractant plötzlich auf mikroscale verfügbar wird, um Mikroumgebungen für mikrobielle Chemotaxis-Experimente zu schaffen. Um chemische Impulse zu erzeugen, haben wir ein System entwickelt, um Aminosäurequellen nahezu augenblicklich durch Photolyse von Käfig-Aminosäuren in einer polydimethylsiloxanen (PDMS) Mikrofluidkammer einzuführen, die eine bakterielle Suspension enthält. Wir haben diese Methode auf das chemotaktische Bakterium Vibrio ordaliiangewendet, das diese dynamischen chemischen Gradienten aktiv erklimmen kann, während es durch Videomikroskopie verfolgt wird. Aminosäuren, die durch chemische Modifikation mit einer photoabnehmbaren Schutzgruppe biologisch inert (“käfig”) gerendert werden, sind in der Suspension einheitlich vorhanden, können aber bis zu ihrer plötzlichen Freisetzung, die zu benutzerdefinierten Zeitpunkten in Zeit und Raum mit Hilfe eines nahezu UV-A fokussierten LED-Strahls erfolgt, nicht zum Verzehr stehen. Die Anzahl der im Puls freigesetzten Moleküle kann durch eine Kalibrierbeziehung zwischen Belichtungszeit und unkaging fraktion bestimmt werden, wobei das Absorptionsspektrum nach der Photolyse durch UV-Vis-Spektroskopie gekennzeichnet ist. Eine nanoporöse Polycarbonatmembran (PCTE) kann in das mikrofluidische Gerät integriert werden, um die kontinuierliche Entfernung der ungecaged Compounds und der verbrauchten Medien durch den Fluss zu ermöglichen. Eine starke, irreversible Verbindung zwischen der PCTE-Membran und der mikrofluidischen PdMS-Struktur wird durch Beschichtung der Membran mit einer Lösung aus 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) und anschließender Plasmaaktivierung der zu verklebenden Oberflächen erreicht. Ein computergesteuertes System kann benutzerdefinierte Pulssequenzen an verschiedenen Stellen und mit unterschiedlichen Intensitäten erzeugen, um Ressourcenlandschaften mit vorgeschriebener räumlicher und zeitlicher Variabilität zu schaffen. In jeder chemischen Landschaft kann die Dynamik der bakteriellen Bewegung auf der individuellen Skala und ihre Akkumulation auf Populationsebene erreicht werden, wodurch die Quantifizierung der chemotaktischen Leistung und ihrer Auswirkungen auf bakterielle Aggregationen in ökologisch relevanten Umgebungen ermöglicht wird.
Introduction
Mikroben verlassen sich auf Chemotaxis, den Prozess der Erkennung chemischer Gradienten und Modifizieren der Beweglichkeit in Reaktion1, um chemische Landschaften zu navigieren, Nährstoffquellen und Wirte zu nähern und schädlichen Substanzen zu entkommen. Diese mikroskalen Prozesse bestimmen die makroskalige Kinetik der Wechselwirkungen zwischen Mikroben und ihrer Umgebung2,3. Jüngste Fortschritte in der Mikrofluidik und Mikrofabrikationstechnologien, einschließlich der weichen Lithographie4, haben unsere Fähigkeit revolutioniert, kontrollierte Mikroumgebungen zu schaffen, in denen die Wechselwirkungen von Mikroben untersucht werden können. Zum Beispiel haben frühere Experimente bakterielle Chemotaxis untersucht, indem hochkontrollierte, stabile Gradienten von mittleren bis hohen Nährstoffkonzentrationen5,6erzeugt wurden. In natürlichen Umgebungen können jedoch mikroskalige chemische Gradienten kurzlebig sein, die durch molekulare Diffusion abgeführt werden, und die Hintergrundbedingungen sind oft stark verdünnt7. Um die chemotaktische Reaktion von mikrobiellen Populationen, die zuerst in stabilen chemischen Umgebungen ausgesetzt waren, direkt zu messen, haben wir Methoden entwickelt und hier beschrieben, um mikrofluidische Technologie mit Photolyse zu kombinieren und dabei Gradienten nachzuahmen, denen wilde Bakterien in der Natur begegnen.
Die Unkaging-Technologie verwendet lichtempfindliche Sonden, die Biomoleküle funktionell in inaktiver Form verkapseln. Die Bestrahlung setzt das Käfigmolekül frei, wodurch die gezielte Störung eines biologischen Prozessesermöglicht wird 8. Aufgrund der schnellen und präzisen Kontrolle der zellulären Chemie, die die Unkaging bietet9, Photolyse von Käfigverbindungen wurde traditionell von Biologen, Physiologen und Neurowissenschaftlern verwendet, um die Aktivierung der Gene10, Ionenkanäle11, und Neuronen12zu studieren. In jüngerer Zeit haben Wissenschaftler die signifikanten Vorteile der Photolyse genutzt, um Chemotaxis13zu untersuchen, um die Flagella-Schaltdynamik einzelner Bakterienzellen zu bestimmen, die einem stufenweisen Chemolockantenreiz14,15, ausgesetzt sind, und um Motilitätsmuster einzelner Spermien in dreidimensionalen (3D) Gradienten16zu untersuchen.
In unserem Ansatz implementieren wir die Photolyse von Käfig-Aminosäuren in mikrofluidischen Geräten, um die Verhaltensreaktion einer bakterienpopulation auf kontrollierte chemische Impulse zu untersuchen, die durch Photorelease nahezu sofort verfügbar werden. Die Verwendung eines objektiven Objektivs mit geringer Vergrößerung (4x) (NA = 0,13, Schwerpunkttiefe ca. 40 m) ermöglicht sowohl die Beobachtung der aggregationiven Reaktion von Tausenden von Bakterien auf Populationsebene über ein großes Sichtfeld (3,2 mm x 3,2 mm) als auch die Messung der Bewegung auf Einzelzellebene. Wir stellen zwei Anwendungen dieser Methode vor: 1) die Freisetzung eines einzelnen chemischen Impulses zur Untersuchung der bakteriellen Akkumulations-Dissipationsdynamik ausgehend von einheitlichen Bedingungen und 2i) die Freisetzung mehrerer Impulse, um die bakterielle Akkumulationsdynamik unter zeitverändernden, räumlich heterogenen Chemopitantenbedingungen zu charakterisieren. Diese Methode wurde an den Meeresbakterien Vibrio ordalii getestet, die Chemotaxis in Richtung der Aminosäure Glutamat17durchführen, aber die Methode ist allgemein anwendbar auf verschiedene Kombinationen von Arten und Chemoattractants, sowie auf biologische Prozesse jenseits von Chemotaxis (z. B. Nährstoffaufnahme, Antibiotika-Exposition, Quorum-Erkennung). Dieser Ansatz verspricht dabei, die Ökologie und das Verhalten von Mikroorganismen in realistischen Umgebungen aufzuklären und die versteckten Kompromisse aufzudecken, denen einzelne Bakterien beim Navigieren in flüchtigen dynamischen Gradienten ausgesetzt sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Chemotaxis unter kontrollierten, dynamischen Gradienten in mikro- und millifluidischen Geräten zu untersuchen und so eine reproduzierbare Datenerfassung zu ermöglichen. Die nahezu sofortige Erzeugung chemischer Impulse im Mikromaßstab durch Photolyse zielt darauf ab, die Arten von Nährstoffpulsen, denen Bakterien in freier Wildbahn begegnen, aus einer Reihe von Quellen zu reproduzieren, zum Beispiel die diffusive Ausbreitung von Pflaumen hinter sinkenden Meeresparti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der FIRST Mikrofabrikation an der ETH Zürich. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (nach D.R.B.), einen Gordon and Betty Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (nach R.S.) und ein Stipendium der Swiss National Science Foundation. 1-002745-000 (nach R.S.).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
