En protokoll for generering av dynamiske kjemiske landskap etter fotolyse innenfor mikrofluidiske og millifluidiske oppsett presenteres. Denne metoden er egnet til å studere ulike biologiske prosesser, inkludert motilatferd, næringsopptak eller tilpasning til kjemikalier av mikroorganismer, både på enkeltcelle- og befolkningsnivå.
Vi demonstrerer en metode for generering av kontrollerte, dynamiske kjemiske pulser – der lokalisert kjemoattractant plutselig blir tilgjengelig på mikroskalaen – for å skape mikromiljøer for mikrobielle akserieeksperimenter. For å skape kjemiske pulser utviklet vi et system for å introdusere aminosyrekilder nær øyeblikkelig ved fotolyse av buraminosyrer i et mikrofluidant polydimethylsiloxane (PDMS) mikrofluidisk kammer som inneholder en bakteriell suspensjon. Vi brukte denne metoden på kjemotaktisk bakterie, Vibrio ordalii, som aktivt kan klatre disse dynamiske kjemiske gradienter mens de spores av videomikroskopi. Aminosyrer, gjengitt biologisk inert (‘bur’) ved kjemisk modifikasjon med en fotoremovable beskyttende gruppe, er jevnt tilstede i suspensjonen, men ikke tilgjengelig for forbruk før deres plutselige utgivelse, som oppstår på brukerdefinerte punkter i tid og rom ved hjelp av en nær-UV-A fokusert LED-stråle. Antall molekyler som frigjøres i pulsen kan bestemmes av en kalibreringssammenheng mellom eksponeringstid og uncaging fraksjon, hvor absorpsjonsspekteret etter fotolyse er preget av bruk av UV-Vis spektroskopi. En nanoporøs polykarbonat (PCTE) membran kan integreres i mikrofluidisk enhet for å tillate kontinuerlig fjerning ved strømning av de uformede forbindelsene og de brukte mediene. Et sterkt, irreversibelt bånd mellom PCTE membranog PDMS mikrofluidisk struktur oppnås ved å dekke membranen med en løsning av 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) etterfulgt av plasmaaktivering av overflatene som skal bindes. Et datastyrt system kan generere brukerdefinerte sekvenser av pulser på forskjellige steder og med forskjellige intensiteter, for å skape ressurslandskap med foreskrevet romlig og tidsmessig variasjon. I hvert kjemisk landskap kan dynamikken i bakteriell bevegelse i den enkelte skala og deres akkumulering på befolkningsnivå oppnås, og dermed tillate kvantifisering av kjemotaktisk ytelse og dens effekter på bakterielle aggregasjoner i økologisk relevante miljøer.
Mikrober stole på chemotaxis, prosessen med å oppdage kjemiske gradienter og modifisere motilitet som svar1, for å navigere kjemiske landskap, tilnærming næringskilder og verter, og unnslippe skadelige stoffer. Disse mikroskalaprosessene bestemmer makroskaleretikken til interaksjoner mellom mikrober og deres miljø2,3. Nylige fremskritt innen mikrofluidikk og mikrofabrikasjonsteknologier, inkludert myk litografi4,har revolusjonert vår evne til å skape kontrollerte mikromiljøer der vi kan studere mikrober. For eksempel har tidligere eksperimenter studert bakteriell chemotaxis ved å generere svært kontrollerte, stabile gradienter av mellomliggende til høye næringskonsentrasjoner5,6. Men i naturlige miljøer kan mikroskala kjemiske gradienter kortvarige – forsvant av molekylær diffusjon – og bakgrunnsforholdene er ofte svært fortynnede7. For å måle den kjemotaktiske responsen fra mikrobielle populasjoner som først ble utsatt for ustødige kjemiske miljøer, utviklet vi og her beskriver metoder for å kombinere mikrofluidisk teknologi med fotolyse, og dermed etterligne gradienter som ville bakterier møter i naturen.
Uncaging teknologi benytter lysfølsomme sonder som funksjonelt innkapsle biomolekyler i en inaktiv form. Bestråling frigjør burmolekylet, slik at målrettet perturbasjon av en biologisk prosess8. På grunn av den raske og presise kontrollen av cellulær kjemi som uncaging gir9,har fotolyse av burforbindelser tradisjonelt vært ansatt av biologer, fysiologer og nevrologer for å studere aktivering av gener10, ion kanaler11, og nevroner12. Mer nylig har forskere utnyttet de betydelige fordelene med fotolyse for å studere chemotaxis13, for å bestemme flagella bytte dynamikken i individuelle bakterielle celler utsatt for en trinnvis kjemoattractant stimulus14,15, og for å undersøke motilitetmønstre av enkelt sædceller i tredimensjonale (3D) gradienter16.
I vår tilnærming implementerer vi fotolyse av buraminosyrer i mikrofluidiske enheter for å studere atferdsresponsen til en bakteriell populasjon til kontrollerte kjemiske pulser, som blir nesten øyeblikkelig tilgjengelig gjennom fotoutgivelse. Bruk av et mål for lav forstørrelse (4x) (NA = 0,13, fokusdybde ca. 40 μm) gjør det mulig å både observasjonen av befolkningsnivået aggregativ respons av tusenvis av bakterier over et stort synsfelt (3,2 mm x 3,2 mm), og måling av bevegelse på encellenivå. Vi presenterer to anvendelser av denne metoden: 1) utgivelsen av en enkelt kjemisk puls for å studere bakteriell akkumulering-spredningsdynamikk fra ensartede forhold, og 2i) frigjøring av flere pulser for å karakterisere bakterieakkumuleringsdynamikken under tidsvarierende, romlig heterogene kjemoattractantforhold. Denne metoden har blitt testet på de marine bakteriene Vibrio ordalii utfører chemotaxis mot aminosyreglutamat17, men metoden er bredt anvendelig for ulike kombinasjoner av arter og kjemoattractanter, samt til biologiske prosesser utover chemotaxis (f.eks næringsopptak, antibiotikaeksponering, quorumssensing). Denne tilnærmingen lover å bidra til å belyse økologiog oppførsel av mikroorganismer i realistiske miljøer og å avdekke de skjulte avveiningene som individuelle bakterier står overfor når du navigerer flyktige dynamiske gradienter.
Denne metoden gjør det mulig for forskere å studere bakteriell chemotaxis under kontrollerte, dynamiske gradienter i mikro- og millifluidiske enheter, noe som muliggjør reproduserbar datainnsamling. Den nesten øyeblikkelige etableringen av kjemiske pulser på mikroskalaen ved fotolyse har som mål å reprodusere de typer næringspulser som bakterier møter i naturen fra en rekke kilder, for eksempel diffus spredning av plommer bak synkende marine partikler25,eller næringsstoffet sprer seg fra…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker det første mikrofabrikasjonsanlegget på ETH Zürich. Dette arbeidet ble støttet av en Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (til D.R.B.), en Gordon og Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (til R.S.), og en Swiss National Science Foundation stipend 1-002745-000 (til R.S.).
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |