Se presenta un protocolo para la generación de paisajes químicos dinámicos por fotólisis dentro de configuraciones microfluídicas y milifluídicas. Esta metodología es adecuada para estudiar diversos procesos biológicos, incluyendo el comportamiento móvil, la acumulación de nutrientes o la adaptación a los productos químicos de los microorganismos, tanto a nivel de una sola célula como de población.
Demostramos un método para la generación de pulsos químicos controlados y dinámicos, donde la quimioattractant localizada se vuelve repentinamente disponible a escala micropara crear microambientes para experimentos de quimiotaxis microbianos. Para crear pulsos químicos, desarrollamos un sistema para introducir fuentes de aminoácidos casi instantáneamente por fotólisis de aminoácidos enjaulados dentro de una cámara microfluida de polidimetilsiloxano (PDMS) que contiene una suspensión bacteriana. Aplicamos este método a la bacteria quimiotáctica, Vibrio ordalii,que puede escalar activamente estos degradados químicos dinámicos mientras se rastrea mediante microscopía de vídeo. Los aminoácidos, que se vuelven biológicamente inertes («enjaulados») por modificación química con un grupo protector fotoextraíble, están uniformemente presentes en la suspensión, pero no están disponibles para su consumo hasta su liberación repentina, que se produce en puntos definidos por el usuario en el tiempo y el espacio mediante un haz LED centrado cerca de los rayos UV-A. El número de moléculas liberadas en el pulso puede determinarse mediante una relación de calibración entre el tiempo de exposición y la fracción de desauno, donde el espectro de absorción después de la fotólisis se caracteriza por el uso de espectroscopia UV-Vis. Una membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) se puede integrar en el dispositivo microfluídico para permitir la eliminación continua por flujo de los compuestos no enjaulados y los medios gastados. Un enlace fuerte e irreversible entre la membrana PCTE y la estructura microfluídica PDMS se logra recubriendo la membrana con una solución de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) seguida de la activación plasmática de las superficies a unir. Un sistema controlado por ordenador puede generar secuencias de pulsos definidas por el usuario en diferentes ubicaciones y con diferentes intensidades, con el fin de crear paisajes de recursos con variabilidad espacial y temporal prescrita. En cada paisaje químico, se puede obtener la dinámica del movimiento bacteriano a escala individual y su acumulación a nivel de población, permitiendo así la cuantificación del rendimiento quimiotáctico y sus efectos en las agregaciones bacterianas en entornos ecológicamente relevantes.
Los microbios se basan en la quimiotaxis, el proceso de detección de gradientes químicos y la modificación de la motilidad en la respuesta1,para navegar por paisajes químicos, acercarse a fuentes de nutrientes y huéspedes, y escapar de sustancias nocivas. Estos procesos a microescala determinan la cinética macroeconómica de las interacciones entre los microbios y su entorno2,3. Los recientes avances en microfluídicas y tecnologías de microfabricación, incluida la litografía blanda4,han revolucionado nuestra capacidad de crear microambientes controlados en los que estudiar las interacciones de los microbios. Por ejemplo, experimentos anteriores han estudiado la quimiotaxis bacteriana generando gradientes estables y altamente controlados de concentraciones de nutrientes intermedios a altos5,6. Sin embargo, en entornos naturales, los gradientes químicos a microescala pueden ser disipados de corta duración por difusión molecular, y las condiciones de fondo son a menudo altamente diluidas7. Para medir directamente la respuesta quimiotáctica de las poblaciones microbianas expuestas por primera vez a entornos químicos inestables, hemos ideado y aquí describimos métodos para combinar la tecnología microfluídica con la fotólisis, imitando así los gradientes que las bacterias silvestres encuentran en la naturaleza.
La tecnología de uncaging emplea sondas sensibles a la luz que encapsulan funcionalmente las biomoléculas de forma inactiva. La irradiación libera la molécula enjaulada, permitiendo la perturbación dirigida de un proceso biológico8. Debido al control rápido y preciso de la química celular que el uncaging ofrece9, la fotólisis de los compuestos enjaulados ha sido empleada tradicionalmente por biólogos, fisiólogos y neurocientíficos para estudiar la activación degenes 10,canales iónicos11y neuronas12. Más recientemente, los científicos han aprovechado las ventajas significativas de la fotólisis para estudiar la quimiotaxis13,para determinar la dinámica de conmutación de flagelos de células bacterianas individuales expuestas a un estímulo quimioatraer escalono14,15, e investigar patrones de motilidad de espermatozoides individuales en gradientes tridimensionales (3D)16.
En nuestro enfoque, implementamos la fotólisis de aminoácidos enjaulados dentro de dispositivos microfluídicos para estudiar la respuesta conductual de una población bacteriana a pulsos químicos controlados, que se vuelven casi instantáneamente disponibles a través de la fotoliberación. El uso de un objetivo de bajo aumento (4x) (NA a 0,13, profundidad de enfoque de aproximadamente 40 m) permite tanto la observación de la respuesta agregativa a nivel de población de miles de bacterias en un gran campo de visión (3,2 mm x 3,2 mm), como la medición del movimiento a nivel de una sola célula. Presentamos dos aplicaciones de este método: 1) la liberación de un solo pulso químico para estudiar la dinámica de acumulación bacteriana de disipación a partir de condiciones uniformes, y 2i) la liberación de múltiples pulsos para caracterizar la dinámica de acumulación bacteriana en condiciones de quimioatractorancias espacialmente heterogéneas que varían en el tiempo. Este método ha sido probado en las bacterias marinas Vibrio ordalii realizando quimiotaxis hacia el aminoácido glutamato17, pero el método es ampliamente aplicable a diferentes combinaciones de especies y quimioatractores, así como a procesos biológicos más allá de la quimiotaxis (por ejemplo, la aceptación de nutrientes, la exposición a antibióticos, la detección de quórum). Este enfoque promete ayudar a dilucidar la ecología y el comportamiento de los microorganismos en ambientes realistas y descubrir las compensaciones ocultas que enfrentan las bacterias individuales al navegar por gradientes dinámicos efímeros.
Este método permite a los investigadores estudiar la quimiotaxis bacteriana bajo gradientes dinámicos controlados en dispositivos micro y milifluidos, lo que permite la adquisición de datos reproducibles. La creación casi instantánea de pulsos químicos a microescala por fotólisis tiene como objetivo reproducir los tipos de pulsos de nutrientes que las bacterias encuentran en la naturaleza a partir de una gama de fuentes, por ejemplo, la difusión difusa de plumas detrás del hundimiento de partículas marinas<sup …
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen la primera instalación de microfabricación en ETH Zurich. Este trabajo fue apoyado por un Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (a D.R.B.), un Premio de Investigador de la Iniciativa Microbiana De Gordon y Betty Moore GBMF3783 (a R.S.), y una beca de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias GBMF3783 (a R.S.), y una beca de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias GBMF3783 (a R.S.), y una beca de la Fundación Nacional suiza de Ciencias 1-002745-000 (a R.S.).
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |