Summary
Этот протокол описывает комплексную оценку гемосовместимости кроветковых устройств с использованием нейрососудистых имплантатов с лазерной резкой. Модель петли потока со свежей, гепаринной человеческой кровью применяется для имитации кровотока. После перфузии анализируются различные гематологические маркеры и сравниваются с значениями, полученными сразу после сбора крови для оценки гемосовместимости исследуемых устройств.
Abstract
Растущее использование медицинских приборов (например, сосудистых трансплантатов, стентов и сердечных катетеров) для временных или постоянных целей, остающихся в системе кровообращения организма, требует надежного и многопараметрического подхода, который оценивает возможные гематологические осложнения, вызванные этими устройствами (т.е. активация и разрушение компонентов крови). Всеобъемлющее тестирование на гемосовместимость в пробирке имплантатов, контактирующих с кровью, является первым шагом на пути к успешной реализации in vivo. Поэтому обширный анализ в соответствии с Международной организацией по стандартизации 10993-4 (ISO 10993-4) является обязательным до клинического применения. Представленный цикл потока описывает чувствительную модель для анализа гемостатической производительности стентов (в данном случае, нервно-сосудистых) и выявления побочных эффектов. Использование свежей человеческой цельной крови и нежный отбор проб крови имеют важное значение, чтобы избежать преактивации крови. Кровь пронизана гепариной трубкой, содержащей испытательный образец, используя перистальтический насос со скоростью 150 мл/мин при 37 градусах По цельсию в течение 60 мин. До и после перфузии гематологические маркеры (т.е., количество клеток крови, гемоглобин, гематокрит и плазматические маркеры), указывающие на активацию лейкоцитов (полиморфоядерная «ПМН-эластаза»), тромбоцитов (з-тромболобулин, ц-ТГ), системы коагуляции (томбин-антитромбин III «Тат» и В заключение мы представляем важную и надежную модель для обширного гемосовместимости тестирования стентов и других кровоконтактных устройств до клинического применения.
Introduction
Применение in vivo имплантатов и биоматериалов, которые взаимодействуют с человеческой кровью, требует интенсивного доклинического тестирования, фокусирующегося на исследовании различных маркеров гемостатической системы. Международная организация по стандартизации 10993-4 (ISO 10993-4) определяет основные принципы оценки кроветворных устройств (т.е. стентов и сосудистых трансплантатов) и рассматривает конструкцию устройства, клиническую полезность и необходимые материалы1.
Человеческая кровь представляет собой жидкость, которая содержит различные белки плазмы и клетки, в том числе лейкоциты (белые кровяные клетки), эритроциты (красные кровяные клетки) и тромбоциты, которые выполняют сложные функции в организме человека2. Прямой контакт инородных материалов с кровью может вызвать неблагоприятные последствия, такие как активация иммунной или свертывания системы, что может привести к воспалению или тромботические осложнения и серьезные проблемы после имплантации3,4,5. Такимобразом, in vitro гемосовместимость проверки предлагает возможность до имплантации, чтобы обнаружить и исключить любые гематологические осложнения, которые могут быть вызваны при контакте крови с инородной поверхности6.
Представленная модель цикла потока была создана для оценки гемосовместимости нервно-сосудистых стентов и аналогичных устройств путем применения скорости потока 150 мл/мин в трубах (диаметр 3,2 мм) для имитации условий мозгового потока и диаметров артерий2,7. Помимо необходимости оптимальной модели in vitro, источник крови является важным фактором при получении надежных и неизменных результатов при анализе гемосовместимости биоматериала8. Собранную кровь следует использовать сразу после взятия проб, чтобы предотвратить изменения, вызванные длительным хранением. В целом, нежный сбор крови без застоя с использованием 21 G иглы должны быть выполнены, чтобы свести к минимуму преактивации тромбоцитов и каскад коагуляции во время рисования крови. Кроме того, критерии исключения доноров включают тех, кто курит, беременна, находится в плохом состоянии здоровья или принимал оральные контрацептивы или обезболивающие в течение предыдущих 14 дней.
Это исследование описывает модель in vitro для обширного гемосовместимости тестирования стентных имплантатов в условиях потока. При сравнении с непокрытыми стентами с покрытием с фибрином-гепарином результаты комплексных тестов на гемосовместимость отражают улучшенную гемосовместимость стентов с покрытием фибрина-гепарина9. В отличие от этого, непокрытые стенты вызывают активацию каскада коагуляции, о чем свидетельствует увеличение концентраций томбин-антитромбина III (ТАТ) и потеря номеров тромбоцитов крови из-за привязки тромбоцитов к стентной поверхности. В целом, интеграция этой модели гемосовместимости в качестве доклинического теста рекомендуется для выявления любых побочных эффектов на гемостатической системе, которые вызваны устройством.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедура отбора проб крови была одобрена Комитетом по этике медицинского факультета Университета Тюбингена (код идентификации проекта: 270/2010BO1). Все субъекты представили письменное, информированное согласие на включение до участия.
1. Подготовка гепаринов-загруженных моноветт
- Смешайте неразбавленный гепарин (5000 МЕ/мл) с хлоридом натрия (NaCl, 0.9%) раствор и подготовить раствор с результирующей концентрацией 15 МЕ/мл гепарина.
- Добавьте 900 л разбавленного раствора гепарина к каждому нейтральному моновате (9 мл), чтобы получить окончательную концентрацию гепарина 1,5 МЕ/мл после взятия крови. Подготовьте три моноветта на одного донора плюс три резервных моноветы и храните гепариновые моноветы при 4 градусах Цельсия до взятия крови.
2. Отбор проб крови
- Возьмите гепарина загруженных моноветтов из холодильника 30 минут до взятия крови.
- Соберите образец крови 27 мл от каждого здорового донора (n No 5) путем venipuncture для цикла потока. Только применять гладкий турникет, чтобы избежать преждевременной активации тромбоцитов и свертывания крови каскада.
- Соберите образцы крови в трех моноветах, содержащих 900 л раствора гепарина (1,5 МЕ/мл) и объедините все три моноветы в один пластиковый контейнер, чтобы обеспечить равномерное распределение всех компонентов.
- Непосредственно перенесите объединенную гепаринизированную кровь в три различных моноветта, содержащие либо ЭДТА (1,2 мл), цитрат (1,4 мл), либо смесь цитрата, теофиллина, аденозина и дипиридамола (CTAD, 2,7 мл) для сбора базовых значений. Продолжить примеры, описанные в разделах 5'8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать невлиятельное поведение свертывания крови, доноры должны избегать потребления препаратов, влияющих на гемостаз (например, ацетилсалициловой кислоты, напроксена и карбеницила) в течение последних 14 дней, а также оральных контрацептивов и курения.
3. Подготовка петли потока
- Вырежьте три поливинилхлорида с потривиниловым покрытием с гепарином покрытием с длиной 75 см и внутренним диаметром 3,2 мм. Загрузите трубки нервно-сосудистыми лазерными имплантатами с фибрин-гепариновым покрытием или без него. Не забудьте оставить одну ванну выгруженной в качестве элемента управления.
- Поместите один конец трубки в резервуар, наполненный 0,9% NaCl, соедините трубку с головкой насоса и вставьте другой конец в измерительный цилиндр.
- Отрегулируйте настройки перистальтического насоса для достижения скорости потока 150 мл/мин с помощью таймер при проверке уровня заполнения в измерительном цилиндре.
4. Тестирование производительности гемосовместимости
- Используйте 12 мл шприца, чтобы заполнить трубки с кровью. Пусть 6 мл кровотока плавно в каждую трубку, содержащую образец или выгруженный контроль.
- Сформируйте схему и плотно закройте трубки, используя силиконовую трубку длиной 0,5 см. Поместите трубки в водяную ванну 37 градусов по Цельсию и начните перфузию в течение 60 мин.
5. Анализ весь крови
- Положите 1,2 мл крови после отбора проб (базовый) или после перфузии в моновет, содержащий ЭДТА и тщательно инвертировать трубку 5x.
- Вставьте монетку в анализатор крови и проведите анализ крови для каждого образца. Затем инкубировать моноветты на льду в течение 15–60 минут после измерения крови для дальнейшего анализа, как описано в разделе 7.
6. Коллекция цитратов плазмы
- Заполните моноветты, содержащие цитрат, 1,4 мл крови (свеженарисованной или после циркуляции) и тщательно инвертируйте 5x.
- Центрифуга трубы в течение 18 мин при 1800 х г при комнатной температуре (RT). Aliquot три образца плазменной фракции на 250 л в 1,5 мл реакционных труб и заморозить образцы плазмы в жидком азоте. Храните их при -20 градусах Цельсия до анализа.
7. Коллекция плазмы ЭДТА
- Инкубировать моноветты на льду в течение 15-60 минут после измерения количества крови. Затем центрифуги труб в течение 20 минут при 2500 х г и 4 кв. C.
- Aliquot три 250 л образцов плазменной фракции в 1,5 мл реакционных труб после центрифугирования и заморозить трубки в жидком азоте. Храните их при -80 градусах По Цельсию до анализа.
8. Коллекция CTAD плазмы
- Заполните моноветы, содержащие смесь CTAD с 2,7 мл крови (свеже нарисованной или после инкубации) и тщательно инвертируйте 5x. После этого инкубировать моноветты на льду в течение 15-60 мин. Затем центрифуги труб в течение 20 минут при 2500 х г и 4 кв. C.
- Передача 700 л средней плазменной фракции в реакционную трубку 1,5 мл и центрифугия заполненных реакционных труб в течение 20 минут при 2500 х г и 4 градусах По Цельсию.
- Aliquot два образца 100 л кЛ средней фракции в 1,5 мл реакционных труб после центрифугирования и заморозить трубки в жидком азоте. Храните их при -20 градусах Цельсия до анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор плазмы ЭДТА и плазмы CTAD может быть выполнен вместе, потому что условия эксплуатации одинаковы.
9. Измерение Тата человека из цитратной плазмы
- Оттепель цитрат плазмы в водяной бане 37 градусов по Цельсию.
- Используйте набор иммуносорбента, связанного с ферментами TAT (ELISA) в соответствии с инструкциями производителя. Реконструируем плазменные стандарты и контролируйте и разбавляйте стиральный раствор, анти-человека-TAT peroxidase (POD)-конъюгированные антитела, и раствор хромогена. Перед началом теста все реагенты и пластина микротитера на РТ (15–25 градусов по Цельсию) оставьте на 30 минут.
- Pipet 50 л буфера образца в каждую скважину пластины микротитера и добавить 50 зл и l образца буфера образца (пустой), плазменный стандарт, плазменный контроль, и неразбавленный образец плазмы в дубликаты к хорошей пластине. Печать пластины и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут с нежной тряски. Затем промойте тарелку 3x с 300 зл и раствором для мытья.
- Добавьте 100 юл антител POD-конъюгированных анти-человека-TAT к каждой скважине. Печать пластины и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут с нежной тряски. Затем промойте тарелку 3x с 300 зл и раствором для мытья.
- Добавьте 100 л свежеприготовленного раствора хромогена к каждому колодцу. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 30 минут.
- Снимите пленку с уплотненияи и добавьте 100 л стоп-раствора к каждому колодцу. Прочитайте оптическую плотность (OD) с помощью фотометра на уровне 490-500 нм. Приготовь стандартные данные кривой в качестве трендовой линии и вычислите концентрацию образцов.
10. Измерение ПМН-эластаза из плазмы цитрата
- Оттепель цитрат плазмы в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
- Используйте полиморфональный (PMN)-elastase ELISA комплект в соответствии с инструкциями производителя: реконструировать pmN-эластазу управления и PMN-elastase стандарт для подготовки стандартной кривой с помощью буфера разбавления комплекта.
- Разбавить стиральный раствор в соответствии с описанием производителя. Оставьте все реагенты и пластину микротитера на РТ в течение 30 минут перед началом теста. Разбавить образцы плазмы цитрата до 1:100 буфером разбавления.
- Добавьте 100 qL буфера образца (пустой), стандартную кривую PMN-elastase (15.6-1,000 нг/мл), контроль PMN-elastase (высокие и низкие концентрации) и разбавленные образцы плазмы в дубликатах к скважинной пластине. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 60 минут с нежной встряхивания. После этого промыть тарелку 4х с 300 л стирального раствора.
- Добавьте 150 л ферментно-спряженого антитела к каждому колодцу. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 60 минут с нежной встряхивания. После этого промыть тарелку 4х с 300 л стирального раствора.
- Добавьте 200 кЛ из 3,3',5'-тетраметилбензидин (TMB)-субстрат решение для каждой скважины. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 20 минут в темноте. Затем снимите пленку с уплотнения и добавьте 50 зл стоп-раствор к каждому колодцу.
- Прочитайте ОД с фотометром на 450 нм с показаниями на 630 нм. Приготовь стандартные данные кривой в качестве трендовой линии и вычислите концентрацию образцов.
11. Измерение комплексного комплекса терминалов (TCC) от ПЛАЗМы EDTA
- Оттепель плазмы ЭДТА в водяной бане при 37 градусах Цельсия, и хранить на льду после размораживания.
- Используйте комплект комплемента SC5b-9 ELISA комплект в соответствии с инструкциями производителя: разбавить стиральный раствор, как описано в протоколе производителя. Оставьте все реагенты и пластину микротитера на РТ в течение 30 минут перед началом теста. Разбавить образцы плазмы EDTA до 1:10 буфером разбавления комплекта.
- Добавьте 300 зЛ стирального раствора к каждой скважине, чтобы регидратировать поверхность и аспирировать через 2 мин. Добавить 100 злитров образца буфера (пустой), стандарты SC5b-9, контроль SC5b-9 (высокие и низкие концентрации) и разбавленные образцы плазмы в дубликатах к скважине пластины.
- Печать пластины и инкубировать на RT в течение 60 минут. Затем промойте тарелку 5x с 300 зл и раствором для мытья.
- Добавьте 50 к/л ферментно-спряженого антитела к каждому колодцу. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 30 минут. Затем промойте тарелку 5x с 300 зл и раствором для мытья.
- Добавьте 100 зл исправления TMB-субстрата к каждой скважине. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 15 минут в темноте.
- Снимите пленку с уплотненияи и добавьте 100 л стоп-раствора к каждому колодцу. Прочитайте ОД с фотометром на 450 нм. Приготовь стандартные данные кривой в качестве трендовой линии и вычислите концентрацию образцов.
12. Измерение з-тромболобулина из плазмы CTAD
- Оттепель плазмы CTAD в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
- Используйте комплект ELISA, использующий комплект ELISA с помощью инструкций производителя: реконструируют контроль с ТГ и стандарт «К-ТГ» и разбавляют стиральный раствор с помощью дистиллированного H2O. Реконструкция POD-конъюгированного антитела с использованием предоставленного фосфата. Оставьте все реагенты и пластину микротитера на РТ в течение 30 минут перед началом теста.
- Подготовьте стандартную кривую и управление в соответствии с инструкциями производителя с предоставленным фосфатным буфером. Разбавить образцы плазмы CTAD до 1:21.
- Добавьте 200 qL фосфатного буфера (пустой), стандарты q-TG, контроль q-TG (высокие и низкие концентрации), и разбавленные образцы плазмы в дубликатах к пластине скважины. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 60 мин. После этого, мыть пластины 5x с 300 л стирального раствора.
- Добавьте 200 л ферментно-спряженых антител к каждому колодцу. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 60 мин. После этого, мыть пластины 5x с 300 л стирального раствора.
- Добавьте 200 зл и сотового раствора TMB-субстрата к каждой скважине. Печать пластины и инкубировать на RT в течение 5 минут в темноте. Удалите пленку уплотнения и остановить реакцию, добавив 50 qL 1 M серной кислоты (H2SO4) к каждому колодцу.
- Оставьте тарелку на 15-60 мин, затем прочитайте ОД с фотометром на 450 нм. Приготовь стандартные данные кривой в качестве трендовой линии и вычислите концентрацию образцов.
13. Подготовка образца для сканирования электронной микроскопии
- Удалить имплантат из трубки с помощью щипков и промыть имплантат кратко, окунув его в 0,9% NaCl решение 3x.
- Хранить в растворе глютаральдегида (2% глютаральдегида в фосфатно-буферном солей (PBS-буфер без Ca2'/Mg2")на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Далее инкубировать имплантаты в PBS-буфере на 10 мин. Обезвоживание образцов путем инкубации этанола с увеличением концентрации на 10 мин каждый: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, и 100%. Храните обезвоженые образцы в 100% этанола до дальнейшего анализа.
- Выполните критические точки сушки в соответствии с инструкциями сушиния устройства или литературы10 непосредственно перед сканированием электронной микроскопии (SEM).
14. Сканирование электронной микроскопии
- Прикрепите высушенные имплантаты к образцу носителя для сканирующего микроскопа и распылите образцы золотым палладием.
- Введите распыленные имплантаты в камеру образца. Сфотографируйте в 100-, 500-, 1000- и 2500-кратное увеличение областей с репрезентативной поверхностью и сливом клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кратко обобщено, человеческая цельная кровь была собрана в гепарина загруженных моноветтах затем объединились и использовались для оценки базовых уровней клеточных отсчетов, а также плазматических маркеров гемосовместимости.
Впоследствии труба, содержащая образцы нервно-сосудистых имплантатов, была заполнена, и кровь пронизана в течение 60 мин при 150 мл/мин и 37 градусов по Цельсию с помощью перистальтального насоса. Опять же, количество клеток было проанализировано во всех группах, и образцы плазмы были подготовлены для анализа ELISA(рисунок 1). Количественная оценка клеток крови и параметров крови, таких как гемоглобин и гематокрит, была проведена непосредственно после сбора крови, а также после перфузии в модели цикла потока для всех типов образцов и контроля. Никаких изменений в отношении числа WBCs(рисунок 2A),RBCs(рисунок 2B), или значения гематокрит(рисунок 2C). Однако снижение уровня гемоглобина было обнаружено после инкубации крови в модели цикла потока по сравнению с базовыми значениями, что было связано с перфузией крови в системе цикла потока(рисунок 2D). Кроме того, снижение числа тромбоцитов наблюдалось из-за перфузии крови. Кроме того, этот эффект был увеличен, когда в трубке присутствовал стент без покрытия, что указывает на присоединение тромбоцитов к биоматериалу. Тем не менее, было ясно продемонстрировано, что потеря тромбоцитов была значительно выше, когда непокрытый стент был инкубирован кровью, в отличие от стента с покрытием фибрина(рисунок 2E).
Потенциальные изменения гематологических плазменных маркеров были также исследованы в испытательных группах после перфузии и сравнены с базовыми значениями свеженарисованной крови. Концентрация комплекса ТАТ, отражающая состояние активации системы коагуляции, была слегка увеличена из-за перфузии крови(рисунок 3А). Однако в группе голого металлического стента было обнаружено значительное увеличение ТАТ, что свидетельствует о глубокой активизации системы коагуляции. Стент с покрытием с фибрином гепарином предотвратил активацию системы коагуляции, так как увеличение ТАТ не было определено.
Перфузия привела к увеличению активации комплементного каскада, который был определен путем измерения SC5b-9(рисунок 3B). Однако инкубация стентами с непокрытыми или фибририн-гепарином не привели к дальнейшему увеличению концентрации SC5b-9. Аналогичные результаты были получены при анализе активации нейтрофильных гранулоцитов через количественную оценку концентраций ПМН-эластаза(рисунок 3С).
Визуализация поверхности стента проводилась с использованием SEM. Явные различия между двумя стентными группами были обнаружены после инкубации крови. В то время как на поверхности непокрытого стента присутствовала плотная сеть кровяных клеток и белков, на поверхности стента с покрытием фибрина-гепарина(рисунок 4).
Рисунок 1: Схематический обзор оценки гемосовместимости стентов в устоявшейся модели цикла потока. Свежая целая кровь человека собирается у здоровых доноров в трубках крови, содержащих гепарин для антикоагуляции. Для каждого донора пустая трубка, а также трубки, предварительно загруженные образцовым материалом, впоследствии заполняются свежей кровью и инкубируются в петлю потока со скоростью 150 мл/мин при скорости 37 градусов по Цельсию в течение 60 мин. Кроме того, образцы плазмы готовятся из свеженарисованной крови для получения базовых значений каждого донора. После инкубации образцы плазмы из испытательных труб, с образцами и без них, готовятся и анализируются с помощью специфической ELISA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Анализ различных типов клеток и параметров крови до и после инкубации различных стентимплантатов в модели петли потока. Было выполнено определение белых кровяных телец(A),красных кровяных телец (B),гематокрит (C),гемоглобин(D),и тромбоцитов(E). Данные отображаются в виде среднего значения - SEM (п. 5, р- lt; 0,5, p е lt; 0.001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Определение маркеров активации тромбоцитов или иммунной системы до и после инкубации с помощью нервно-сосудистых имплантатов. Маркерыдляактивации свертывания крови (TAT),(B) системы комплемента (SC5b-9) и(C)нейтрофилов (PMN-elastase) были количественно определены с помощью ELISA. Анализ проводился на образцах плазмы, полученных из свеженарисованной крови или крови, инкубированной различными стентами в модели петли потока. Данные отображаются в виде среднего значения SEM (n No 5, p s lt; 0.5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сканирование электронного микроскопического анализа стентов после инкубации с кровью. Наблюдалась агрегация белков плазмы крови и тромбоцитов на непокрытом стентном материале. Для сравнения, стентные материалы с фибрин-гепаринным покрытием не продемонстрировали привязки клеток или других компонентов крови на поверхности (увеличение на 500-, 1000 и 2500 раз). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный протокол описывает всеобъемлющий и надежный метод для гемосовместимости тестирования кровоконтактных имплантатов в соответствии с ISO 10993-4 в модели потока сдвига, имитирующей поток крови человека. Это исследование основано на тестировании лазерной огранки нейрососудистых имплантатов, но может быть выполнено с различными образцами. Результаты показывают, что этот метод позволяет широкий анализ различных параметров, таких как количество клеток крови, распространенность нескольких маркеров гемосовместимости, и микроскопическая визуализация поверхности устройства после контакта с кровью. С помощью этого протокола могут быть обнаружены потенциальные различия в гемосовместимости различных устройств.
Альтернатива оценке гемосовместимости in vitro состоит из тестирования на животных in vivo, которое связано с рядом недостатков, таких как более высокая изменчивость и искажение эффектов, связанных с устройством, из-за подавляющего краткосрочного воздействия травмы тканей6.
Для тестирования на гемосовместимость в пробирке доступны три типа моделей: (1) статические модели инкубации крови, (2) агитированные модели инкубации крови и (3) модели потока сдвига. Статическая модель обеспечивает простой и быстрый метод для определения тромбогенности путем инкубации устройства непосредственно с кровью, но это приводит только к элементарным результатам в отношении гемосовместимости11. Для преодоления основных недостатков статических моделей (т.е. отложения кровяных клеток и большой воздухоконтактной поверхности) может быть использована агитирующая модель инкубации крови, в которой испытательная камера, содержащая имплантаты, заполнена кровью и инкубируется на качалке платформы12. Тем не менее, эти типы моделей по-прежнему ниже по сравнению с существующими моделями потока сдвига, такими как цикл потока, представленный здесь. Квинтэссенция этих моделей заключается в том, что сосудистый поток крови человека может быть имитирован; таким образом, близкое изображение реального взаимодействия между имплантатом и клетками крови может быть отображено13. В дополнение к модели цикла потока, модели, такие как петля Чендлера или несколько пронизывается камера потока существуют14,15,16.
Петля Чендлера представляет собой замкнутую трубку системы, которая частично заполнены воздухом и зажата в вращающееся устройство, в результате чего кровообращение через трубки17. В настоящей системе петли потока, трубка полностью заполнена кровью, и поток вынужден с помощью перистальтический насос. При использовании модели петли Chandler операторы сталкиваются с двумя основными недостатками из-за требования включения воздуха в тестовую трубку. Во-первых, известно, что постоянное взаимодействие крови и воздуха вызывает агрегацию лейкоцитов и тромбоцитов, а также денатурацию белка18,19. Во-вторых, частота кровообращения ограничена, так как воздух всегда остается на самой высокой точке петли20.
Эти недостатки можно преодолеть при использовании системы цикла потока. Поскольку в системе нет воздушно-жидкого интерфейса, активация тромбоцитов не происходит. Таким образом, модель имеет низкий фон для тромботических событий, так что низкая концентрация антикоагулянтов, как правило, 1 МЕ / мл или 1,5 МЕ / мл гепарина, достаточно, чтобы предотвратить свертывание, даже если высокие скорости потока применяются6. Регулируемая скорость кровотока, регулируемая насосом, и свободно выбираемый диаметр трубки позволяют оператору имитировать физиологические условия вены или артерии, которые соответствуют испытанию имплантата, и достичь соответствующих результатов испытаний21. Однако, это преимущество в то же время ограничение, из-за механического стресса, применяемого к крови через насос, и разрушение эритроцитов (т.е. гемолиза) может произойти2. Это возникающее внутреннее повреждение крови снижает чувствительность метода и препятствует длительному воздействию крови21. Тем не менее, несколько исследований продемонстрировали эффективное использование модели цикла потока для оценки гемосовместимости22,23,24.
Однако основной разрыв между всеми моделями in vitro и механизмами in vivo включает в себя недостающий эндотелий, который выражает цитокины, антитромботические компоненты и молекулы адгезии; Поэтому этот компонент играет решающую роль во взаимодействии имплантата и циркулирующей крови25. В заключение, модель цикла потока является регулируемой, эффективной, надежной и экономически эффективной для оценки гемосовместимости имплантатов перед клиническим использованием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
За выполнение сканирующей электронной микроскопии мы благодарим Эрнста Швайзера из секции медицинской материаловедения Университетской больницы Тубингена. Исследование было поддержано Министерством образования, молодежи и спорта ЧР в рамках Национальной программы устойчивого развития II (проект BIOCEV-FAR L-1604) и проектом Чешского научного фонда No 18-01163S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W.
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
