Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Hämokompatibilitätsbewertung von blutverfälssenden Geräten mit lasergeschnittenen neurovaskulären Implantaten. Ein Flow-Loop-Modell mit frischem, heparinisiertem menschlichem Blut wird angewendet, um den Blutfluss zu imitieren. Nach der Perfusion werden verschiedene hämatologische Marker analysiert und mit den direkt nach der Blutentnahme gewonnenen Werten zur Hämokompatibilitätsbewertung der getesteten Geräte verglichen.
Abstract
Der zunehmende Einsatz von Medizinprodukten (z. B. Gefäßtransplantate, Stents und Herzkatheter) für temporäre oder dauerhafte Zwecke, die im Kreislaufsystem des Körpers verbleiben, erfordert einen zuverlässigen und multiparametrischen Ansatz, der die möglichen hämatologischen Komplikationen dieser Geräte (z. B. Aktivierung und Zerstörung von Blutbestandteilen) bewertet. Umfassende In-vitro-Hämokompatibilitätstests von blutverfeinernden Implantaten sind der erste Schritt zur erfolgreichen in vivo-Implementierung. Daher ist eine umfassende Analyse nach der Internationalen Organisation für Normung 10993-4 (ISO 10993-4) vor der klinischen Anwendung obligatorisch. Die vorgestellte Durchflussschleife beschreibt ein empfindliches Modell, um die hämostatische Leistung von Stents (in diesem Fall neurovaskuläre) zu analysieren und Nebenwirkungen aufzudecken. Die Verwendung von frischem menschlichem Vollblut und sanfte Blutentnahme sind wichtig, um die Voraktivierung von Blut zu vermeiden. Das Blut wird durch einen heparinisierten Schlauch, der die Probe enthält, durch eine peristaltische Pumpe mit einer Rate von 150 ml/min bei 37 °C für 60 min durchdrungen. Vor und nach der Perfusion hämatologische Marker (d.h. Blutzellzahl, Hämoglobin, Hämatokrit und Plasmamarker), die auf die Aktivierung von Leukozyten (polymorphonukleäre [PMN]-Elastase), Thrombozyten (-Thromboglobulin [-TG]), das Gerinnungssystem (Thombin-Antithrombin III [TAT]) und die Komplementkaska (SC5b-9) hinweisen, Zusammenfassend stellen wir ein wesentliches und zuverlässiges Modell für umfangreiche Hämokompatibilitätstests von Stents und anderen blutverstigenden Geräten vor der klinischen Anwendung vor.
Introduction
Die In-vivo-Anwendung von Implantaten und Biomaterialien, die mit menschlichem Blut interagieren, erfordert intensive präklinische Tests, die sich auf die Untersuchung verschiedener Marker des hämostatischen Systems konzentrieren. Die Internationale Organisation für Normung 10993-4 (ISO 10993-4) legt die zentralen Grundsätze für die Bewertung von blutverfälschten Geräten (d. h. Stents und Gefäßtransplantaten) fest und berücksichtigt das Gerätedesign, den klinischen Nutzen und die benötigten Materialien1.
Menschliches Blut ist eine Flüssigkeit, die verschiedene Plasmaproteine und Zellen enthält, einschließlich Leukozyten (weiße Blutkörperchen [WBCs]), Erythrozyten (rote Blutkörperchen [RBCs]) und Blutplättchen, die komplexe Funktionen im menschlichen Körper ausführen2. Der direkte Kontakt von Fremdstoffen mit Blut kann schädliche Effekte verursachen, wie z. B. die Aktivierung des Immunsystems oder des Gerinnungssystems, die nach derImplantationzu Entzündungen oder thrombotischen Komplikationen und schwerwiegenden Problemen nach der Implantation 3,4,5führen können. Daher bietet die In-vitro-Hämokompatibilitätsvalidierung eine Möglichkeit vor der Implantation, hämatologische Komplikationen zu erkennen und auszuschließen, die beim Kontakt des Blutes mit einer fremden Oberfläche induziert werden können6.
Das vorgestellte Durchflussschleifenmodell wurde erstellt, um die Hämokompatibilität von neurovaskulären Stents und ähnlichen Geräten zu bewerten, indem eine Durchflussrate von 150 ml/min in Schläuchen (Durchmesser 3,2 mm) angewendet wurde, um die Bedingungen des Zerebralpareseflusses und der Arteriendurchmesser2,7nachzuahmen. Neben der Notwendigkeit eines optimalen In-vitro-Modells ist die Blutquelle ein wichtiger Faktor, um bei der Analyse der Hämokompatibilität eines Biomaterials8zuverlässige und unveränderte Ergebnisse zu erzielen. Das entnommene Blut sollte unmittelbar nach der Probenahme verwendet werden, um Veränderungen zu verhindern, die durch längere Lagerung verursacht werden. Im Allgemeinen sollte eine sanfte Blutentnahme ohne Stase mit einer 21 G Nadel durchgeführt werden, um die Voraktivierung von Blutplättchen und die Gerinnungskaskaskade während der Blutentnahme zu minimieren. Darüber hinaus umfassen die Ausschlusskriterien für Spender diejenigen, die rauchen, schwanger sind, sich in einem schlechten Gesundheitszustand befinden oder in den letzten 14 Tagen orale Kontrazeptiva oder Schmerzmittel eingenommen haben.
Diese Studie beschreibt ein In-vitro-Modell für die umfangreiche Hämokompatibilitätsprüfung von Stentimplantaten unter Strömungsbedingungen. Beim Vergleich unbeschichteter mit fibrin-heparinbeschichteten Stents spiegeln die Ergebnisse der umfassenden Hämokompatibilitätstests eine verbesserte Hämokompatibilität der fibrin-heparinbeschichteten Stents9wider. Im Gegensatz dazu induzieren die unbeschichteten Stents die Aktivierung der Gerinnungskaskade, wie eine Erhöhung der Thombin-Antithrombin-III-Konzentrationen (TAT) und der Verlust von Blutplättchenzahlen aufgrund der Adhäsion der Blutplättchen an der Stentoberfläche zeigen. Insgesamt wird empfohlen, dieses Hämokompatibilitätsmodell als präklinischen Test zu integrieren, um schädliche Auswirkungen auf das hämostatische System zu erkennen, die durch das Gerät verursacht werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Blutentnahmeverfahren wurde von der Ethikkommission der medizinischen Fakultät der Universität Tübingen genehmigt (Projekt-Identifikationscode: 270/2010BO1). Alle Personen, die vor der Teilnahme schriftlich und in Kenntnis der Sachkenntnis zur Aufnahme einwilligt werden.
1. Herstellung von Heparin-geladenen Monovetten
- Mischen Sie das unverdünnte Heparin (5.000 I.E./ml) mit Natriumchlorid (NaCl, 0,9%) und bereiten eine Lösung mit einer resultierenden Konzentration von 15 I.E./ml Heparin vor.
- Fügen Sie jeder neutralen Monovette (9 ml) 900 l der verdünnten Heparinlösung hinzu, um nach einer Blutentnahme eine endgültige Heparinkonzentration von 1,5 I.E./ml zu erhalten. Bereiten Sie drei Monovetten pro Spender plus drei Reservemonovettes vor und lagern Sie die mit Heparin beladenen Monovetten bei 4 °C bis zur Blutentnahme.
2. Blutentnahme
- Nehmen Sie die mit Heparin beladenen Monovetten 30 min vor der Blutentnahme aus dem Kühlschrank.
- Sammeln Sie eine 27 ml Blutprobe von jedem gesunden Spender (n = 5) durch Venipunktion für die Durchflussschleife. Wenden Sie nur ein glattes Tourniquet an, um eine vorzeitige Aktivierung der Blutplättchen und der Blutgerinnsel zu vermeiden.
- Sammeln Sie Blutproben in drei Monovetten, die 900 l der Heparin-Lösung (1,5 I.E./ml) enthalten, und bündeln Sie alle drei Monovetten in einem Kunststoffbehälter, um sicherzustellen, dass alle Komponenten gleichmäßig verteilt sind.
- Übertragen Sie das gepoolte heparinisierte Blut direkt in drei verschiedene Monovetten, die entweder EDTA (1,2 ml), Citrat (1,4 ml) oder eine Mischung aus Citrat, Theophyllin, Adenosin und Dipyridamol (CTAD, 2,7 ml) enthalten, um Ausgangswerte zu sammeln. Fahren Sie mit den Proben fort, wie in den Abschnitten 5 bis 8 beschrieben.
HINWEIS: Um ein unbeeinflusstes Gerinnungsverhalten zu gewährleisten, sollten Spender die Einnahme von Arzneimitteln vermeiden, die hemostasis beeinflussen (z. B. Acetylsalicylsäure, Naproxen und Carbenicillin) innerhalb der letzten 14 Tage sowie orale Kontrazeptiva und Rauchen.
3. Vorbereitung der Durchflussschleife
- Schneiden Sie drei heparinbeschichtete Polyvinylchlorid-Röhren mit einer Länge von 75 cm und einem Innendurchmesser von 3,2 mm. Beladen Sie die Rohre mit den neurovaskulären lasergeschnittenen Implantaten mit oder ohne Fibrin-Heparin-Beschichtung. Denken Sie daran, eine Wanne als Steuerung unbeladen zu lassen.
- Legen Sie ein Ende des Rohres in ein mit 0,9 % NaCl gefülltes Reservoir, schließen Sie den Schlauch an den Pumpenkopf an und legen Sie das andere Ende in einen Messzylinder ein.
- Passen Sie die Einstellungen der Peristaltikpumpe so an, dass ein Durchfluss von 150 ml/min erreicht wird, indem Sie einen Timer verwenden, während Sie den Füllstand im Messzylinder überprüfen.
4. Durchführung von Hämokompatibilitätstests
- Verwenden Sie eine 12 ml Spritze, um die Röhrchen mit Blut zu füllen. Lassen Sie 6 ml Blut glatt in jedes Rohr fließen, das eine Probe oder eine unbeladene Kontrolle enthält.
- Bilden Sie einen Kreislauf und schließen Sie die Rohre fest mit einem 0,5 cm langen Silikonanschlussschlauch. Legen Sie die Schläuche in ein Wasserbad von 37 °C und starten Sie die Perfusion für 60 min.
5. Analyse des Ganzen Blutbilds
- 1,2 ml Blut nach der Probenahme (Baseline) oder nach perfusion in eine Monovette geben, die EDTA enthält, und das Röhrchen sorgfältig 5x umkehren.
- Setzen Sie die Monovette in den Blutanalysator ein und führen Sie für jede Probe eine Blutbildanalyse durch. Dann inkubieren Sie die Monovetten auf Eis für 15-60 min nach der Blutbildmessung für weitere Analysen, wie in Abschnitt 7 beschrieben.
6. Sammlung von Citratplasma
- Füllen Sie die monovettes citrat enthalten mit 1,4 ml Blut (frisch gezogen oder nach der Zirkulation) und sorgfältig invertieren 5x.
- Zentrifugieren Sie die Rohre für 18 min bei 1.800 x g bei Raumtemperatur (RT). Aliquot drei 250-L-Proben der Plasmafraktion in 1,5 ml Reaktionsröhren und frieren die Plasmaproben in flüssigem Stickstoff ein. Lagern Sie sie bei -20 °C bis zur Analyse.
7. Sammlung von EDTA-Plasma
- Inkubieren Sie die Monovetten nach der Blutbildmessung für 15-60 min auf Eis. Zentrifugieren Sie dann die Rohre für 20 min bei 2.500 x g und 4 °C.
- Aliquot drei 250-L-Proben der Plasmafraktion in 1,5 ml Reaktionsröhren nach Zentrifugation und Einfrieren der Rohre in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie sie bei -80 °C bis zur Analyse.
8. Sammlung von CTAD Plasma
- Füllen Sie die Monovetten, die die CTAD-Mischung enthalten, mit 2,7 ml Blut (frisch gezogen oder nach der Inkubation) und invertieren Sie sorgfältig 5x. Danach die Monovetten auf Eis für 15-60 min inkubieren. Zentrifugieren Sie dann die Rohre für 20 min bei 2.500 x g und 4 °C.
- Übertragen Sie 700 l der mittleren Plasmafraktion in ein 1,5 ml Reaktionsrohr und zentrieren Sie die gefüllten Reaktionsröhrchen für 20 min bei 2.500 x g und 4 °C.
- Aliquot zwei 100 l Proben der mittleren Fraktion in 1,5 ml Reaktionsröhren nach Zentrifugation und frieren die Rohre in flüssigem Stickstoff ein. Lagern Sie sie bei -20 °C bis zur Analyse.
HINWEIS: Die Entnahme von EDTA-Plasma und CTAD-Plasma kann zusammen durchgeführt werden, da die Betriebsbedingungen gleich sind.
9. Messung des menschlichen TAT aus Citratplasma
- Das Citratplasma in einem Wasserbad von 37 °C auftauen.
- Verwenden Sie das TAT-Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Rekonstruieren Sie die Plasmastandards und kontrollieren und verdünnen Sie die Waschlösung, antihuman-TAT Peroxidase (POD)-konjugierte Antikörper und Chromogenlösung. Lassen Sie alle Reagenzien und die Mikrotiterplatte 30 min bei RT (15 x 25 °C) vor Beginn der Prüfung.
- Pipetten Sie 50 l des Probenpuffers in jede Bohrung der Mikrotiterplatte und fügen Sie der Bohrplatte 50 l des Probenpuffers (leer), des Plasmastandards, der Plasmasteuerung und der unverdünnten Plasmaprobe in Duplikaten hinzu. Die Platte versiegeln und bei 37 °C 15 min mit sanftem Schütteln bebrüten. Dann waschen Sie die Platte 3x mit 300 l Waschlösung.
- Fügen Sie jedem Brunnen 100 L des POD-konjugierten Anti-Human-TAT-Antikörpers hinzu. Die Platte versiegeln und bei 37 °C 15 min mit sanftem Schütteln bebrüten. Dann waschen Sie die Platte 3x mit 300 l Waschlösung.
- Fügen Sie jedem Brunnen 100 l der frisch zubereiteten Chromogenlösung hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 30 min.
- Entfernen Sie die Dichtungsfolie und fügen Sie jedem Brunnen 100 L Stop-Lösung hinzu. Lesen Sie die optische Dichte (OD) mit einem Photometer bei 490 x 500 nm. Passen Sie die Standardkurvendaten als Trendlinie an und berechnen Sie die Konzentration der Stichproben.
10. Messung der PMN-Elastase aus Citratplasma
- Das Citratplasma in einem Wasserbad bei 37 °C auftauen.
- Verwenden Sie das Polymorphonukleare (PMN)-ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers: Rekonstruieren Sie die PMN-Elastase-Steuerung und den PMN-Elastase-Standard, um eine Standardkurve mit dem Verdünnungspuffer des Kits vorzubereiten.
- Verdünnen Sie die Waschlösung nach herstellerweiter Beschreibung. Lassen Sie alle Reagenzien und die Mikrotiterplatte bei RT 30 min vor Beginn des Tests. Die Citrat-Plasmaproben mit dem Verdünnungspuffer auf 1:100 verdünnen.
- Fügen Sie 100 l des Probenpuffers (leer), die PMN-Elastase-Standardkurve (15,6 x 1.000 ng/ml), die PMN-Elastase-Steuerung (hohe und niedrige Konzentrationen) und verdünnte Plasmaproben in Duplikaten zur Brunnenplatte hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 60 min mit sanftem Schütteln. Anschließend die Platte 4x mit 300 l Waschlösung waschen.
- Fügen Sie jedem Brunnen 150 l des enzymkonjugierten Antikörpers hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 60 min mit sanftem Schütteln. Anschließend die Platte 4x mit 300 l Waschlösung waschen.
- Fügen Sie jedem Brunnen 200 l der 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Substratlösung hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 20 min im Dunkeln. Entfernen Sie dann die Dichtungsfolie und fügen Sie jedem Brunnen 50 l der Stop-Lösung hinzu.
- Lesen Sie die OD mit einem Photometer bei 450 nm mit einem Referenzwert bei 630 nm. Passen Sie die Standardkurvendaten als Trendlinie an und berechnen Sie die Konzentration der Stichproben.
11. Messung des Terminal Complement Complex (TCC) aus EDTA Plasma
- Das EDTA-Plasma in einem Wasserbad bei 37 °C auftauen und nach dem Auftauen auf Eis lagern.
- Verwenden Sie das Komplement-Kaskade SC5b-9 ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers: Verdünnen Sie die Waschlösung, wie im Herstellerprotokoll beschrieben. Lassen Sie alle Reagenzien und die Mikrotiterplatte bei RT 30 min vor Beginn des Tests. Die EDTA-Plasmaproben mit dem Verdünnungspuffer des Kits auf 1:10 verdünnen.
- Fügen Sie jedem Brunnen 300 l Waschlösung hinzu, um die Oberfläche zu rehydrieren und nach 2 min zu aspirieren. Fügen Sie 100 l des Probenpuffers (leer), SC5b-9-Standards, SC5b-9-Steuerungen (hohe und niedrige Konzentrationen) und die verdünnten Plasmaproben in Duplikaten zur Bohrplatte hinzu.
- Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 60 min. Als nächstes waschen Sie die Platte 5x mit 300 l Waschlösung.
- Fügen Sie jedem Brunnen 50 l des enzymkonjugierten Antikörpers hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 30 min. Dann waschen Sie die Platte 5x mit 300 l Waschlösung.
- Fügen Sie jedem Bohrgut 100 l der TMB-Substratlösung hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 15 min im Dunkeln.
- Entfernen Sie die Dichtungsfolie und fügen Sie jedem Brunnen 100 l der Stop-Lösung hinzu. Lesen Sie die OD mit einem Photometer bei 450 nm. Passen Sie die Standardkurvendaten als Trendlinie an und berechnen Sie die Konzentration der Stichproben.
12. Messung von A-Thromboglobulin aus CTAD-Plasma
- Das CTAD-Plasma in einem Wasserbad bei 37 °C auftauen.
- Verwenden Sie das ELISA-Kit von '-thromboglobulin ('-TG) gemäß den Anweisungen des Herstellers: Rekonstruieren Sie die '-TG-Steuerung und den Standard '-TG' und verdünnen Sie die Waschlösung mit destilliertemH2O. Rekonstruieren Sie den POD-konjugierten Antikörper mit dem mitgelieferten Phosphatpuffer. Lassen Sie alle Reagenzien und die Mikrotiterplatte bei RT 30 min vor Beginn des Tests.
- Bereiten Sie die Standardkurve und die Steuerung gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem mitgelieferten Phosphatpuffer vor. Die CTAD-Plasmaproben auf 1:21 verdünnen.
- Fügen Sie 200 l des Phosphatpuffers (leer), die --TG-Standards, die --TG-Steuerungen (hohe und niedrige Konzentrationen) und verdünnte Plasmaproben in Duplikaten zur Brunnenplatte hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 60 min. Danach waschen Sie die Platte 5x mit 300 l Waschlösung.
- Fügen Sie jedem Brunnen 200 L des enzymkonjugierten Antikörpers hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 60 min. Danach waschen Sie die Platte 5x mit 300 l Waschlösung.
- Fügen Sie jedem Bohrgut 200 L der TMB-Substratlösung hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Bei RT für 5 min im Dunkeln. Entfernen Sie den Dichtungsfilm und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie jedem Brunnen 50 l 1 M Schwefelsäure (H2SO4) hinzufügen.
- Lassen Sie die Platte für 15-60 min, dann lesen Sie die OD mit einem Photometer bei 450 nm. Passen Sie die Standardkurvendaten als Trendlinie an und berechnen Sie die Konzentration der Stichproben.
13. Probenvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie
- Entfernen Sie das Implantat aus dem Rohr mit Zangen und spülen Sie das Implantat kurz, indem Sie es in 0,9% NaCl-Lösung 3x tauchen.
- In Glutaraldehydlösung (2% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Saline [PBS-Puffer ohne Ca2+/Mg2+]) über Nacht bei 4 °C lagern.
- Als nächstes inkubieren Sie die Implantate in PBS-Puffer für 10 min. Dehydrieren Sie die Proben durch Inkubation in Ethanol mit zunehmender Konzentration für jeweils 10 min: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% und 100%. Bewahren Sie die dehydrierten Proben bis zur weiteren Analyse in 100% Ethanol auf.
- Führen Sie die kritische Punkttrocknung gemäß den Anweisungen des Trocknungsgeräts oder der Literatur10 kurz vor der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) durch.
14. Rasterelektronenmikroskopie
- Befestigen Sie die getrockneten Implantate an einem Probenträger für das Rastermikroskop und sputtern Sie die Proben mit Goldpalladium.
- Führen Sie die gesputterten Implantate in die Probenkammer ein. Fotografieren Sie in 100-, 500-, 1.000- und 2.500-facher Vergrößerung der Bereiche mit der repräsentativen Oberfläche und Zellhaftung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kurz zusammengefasst, wurde menschliches Vollblut in Heparin-geladenen Monovetten gesammelt und dann gepoolt und verwendet, um die Grundwerte der Zellzahl sowie plasmatische Hämokompatibilitätsmarker zu bewerten.
Anschließend wurden die Schläuche, die die neurovaskulären Implantatproben enthielten, gefüllt und das Blut 60 min bei 150 ml/min und 37 °C mit einer peristaltischen Pumpe durchtränz. Auch hier wurde die Anzahl der Zellen in allen Gruppen analysiert und die Plasmaproben für ELISA-Analysen vorbereitet (Abbildung 1). Die Quantifizierung der Blutzellen und Blutparameter wie Hämoglobin und Hämatokrit erfolgte direkt nach der Blutentnahme sowie nach Perfusion im Durchflussschleifenmodell für alle Probentypen und die Kontrolle. Es wurden keine Änderungen in Bezug auf die Anzahl der WBCs (Abbildung 2A), RBCs (Abbildung 2B) oder die Hämatokritwerte (Abbildung 2C) festgestellt. Allerdings wurde nach der Inkubation des Blutes im Flow Loop-Modell im Vergleich zu den Ausgangswerten, die auf die Durchblutung im Durchflussschleifensystem zurückzuführen war, eine Abnahme des Hämoglobinspiegels festgestellt (Abbildung 2D). Darüber hinaus wurde eine Abnahme der Thrombozytenzahlen aufgrund von Blutdurchblutung beobachtet. Darüber hinaus wurde dieser Effekt verstärkt, wenn ein unbeschichteter Stent in den Schläuchen vorhanden war, was auf die Haftung der Thrombozyten mit dem Biomaterial hindeutet. Dennoch wurde deutlich gezeigt, dass der Verlust von Blutplättchen deutlich höher war, wenn der unbeschichtete Stent mit Blut inkubiert wurde, im Gegensatz zum Fibrin-Heparin-beschichteten Stent(Abbildung 2E).
Mögliche Veränderungen der hämatologischen Plasmamarker wurden auch in den Testgruppen nach perfusion untersucht und mit den Ausgangswerten des frisch gezogenen Blutes verglichen. Die TAT-Komplexkonzentration, die den Aktivierungsstatus des Gerinnungssystems widerspiegelt, wurde aufgrund einer Blutperfusion leicht erhöht (Abbildung 3A). In der Bare-Metal-Stentgruppe wurde jedoch eine signifikante Zunahme der TAT festgestellt, was auf eine tiefgreifende Aktivierung des Gerinnungssystems hindeutet. Der fibrin-heparinbeschichtete Stent verhinderte die Aktivierung des Gerinnungssystems, da keine Erhöhung des TAT festgestellt wurde.
Die Durchblutung führte zu einer erhöhten Aktivierung der Komplementkaskade, die durch Messung von SC5b-9(Abbildung 3B) bestimmt wurde. Die Inkubation mit unbeschichteten oder fibrin-heparinbeschichteten Stents hat die SC5b-9-Konzentration jedoch nicht weiter erhöht. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Analyse der Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch die Quantifizierung der PMN-Elastase-Konzentrationen erzielt (Abbildung 3C).
Die Visualisierung der Stentoberfläche erfolgte mit SEM. Deutliche Unterschiede zwischen den beiden Stentgruppen wurden nach der Blutinkubation festgestellt. Während auf der Oberfläche des unbeschichteten Stents ein dichtes Netz von Blutzellen und Proteinen vorhanden war, wurde keine Haftung von Proteinen oder Zellen auf der Oberfläche des fibrin-heparinbeschichteten Stents nachgewiesen (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schematische Übersicht der Hämokompatibilitätsbewertung von Stents in einem etablierten Durchflussschleifenmodell. Frisches menschliches Vollblut wird von gesunden Spendern in Blutröhrchen mit Heparin zur Antikoagulation gesammelt. Für jeden Spender werden anschließend ein leeres Rohr sowie mit dem Probenmaterial vorinstallierte Schläuche mit frischem Blut gefüllt und in der Durchflussschleife mit einer Rate von 150 ml/min bei 37 °C für 60 min inkubiert. Zusätzlich werden Plasmaproben aus frisch entnommenem Blut hergestellt, um die Ausgangswerte jedes Spenders zu erhalten. Nach der Inkubation werden die Plasmaproben aus den Prüfschläuchen mit und ohne Probenmaterial mit einem spezifischen ELISA hergestellt und analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Analyse verschiedener Zelltypen und Blutparameter vor und nach der Inkubation verschiedener Stentimplantate im Durchflussschleifenmodell. Die Bestimmung der weißen Blutkörperchen (A), der roten Blutkörperchen (B), hämatocrit (C), Hämoglobin (D) und der Blutplättchen (E) wurde durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert angezeigt (n = 5, p* < 0,5, p*** < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bestimmung von Thrombozyten- oder Immunsystemaktivierungsmarkern vor und nach der Inkubation mit neurovaskulären Implantaten. Die Marker für das (A) Aktivierungssystem der Blutgerinnung (TAT), (B) (SC5b-9) und (C) Neutrophilen (PMN-Elastase) wurden mit ELISA quantifiziert. Die Analyse wurde an Plasmaproben durchgeführt, die aus frisch entnommenem Blut oder Blut gewonnen wurden, das mit verschiedenen Stents im Flow Loop-Modell inkubiert wurde. Die Daten werden als Mittelwert angezeigt (n = 5, p* < 0,5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Rasterelektronenmikroskopische Analyse von Stents nach Inkubation mit Blut. Die Aggregation von Blutplasmaproteinen und Blutplättchen auf unbeschichtetem Stentmaterial wurde beobachtet. Im Vergleich dazu zeigten Stentmaterialien mit der Fibrin-Heparin-Beschichtung keine Haftung von Zellen oder anderen Blutbestandteilen auf der Oberfläche (Vergrößerung von 500-, 1.000- und 2.500-fach). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine umfassende und zuverlässige Methode zur Hämokompatibilitätsprüfung von blutverstättlichen Implantaten gemäß ISO 10993-4 in einem Scherflussmodell, das den menschlichen Blutfluss imitiert. Diese Studie basiert auf der Prüfung von lasergeschnittenen neurovaskulären Implantaten, kann aber mit einer Vielzahl von Proben durchgeführt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die breite Analyse verschiedener Parameter wie die Blutzellzahl, die Prävalenz mehrerer Hämokompatibilitätsmarker und die mikroskopische Visualisierung der Geräteoberfläche nach Demintest ermöglicht. Mit diesem Protokoll können mögliche Unterschiede in Bezug auf die Hämokompatibilität verschiedener Geräte erkannt werden.
Eine Alternative zur In-vitro-Hämokompatibilitätsbewertung besteht aus In-vivo-Tierversuchen, die mit mehreren Nachteilen verbunden sind, wie z. B. höhere Variabilität und Verzerrung gerätebezogener Effekte aufgrund der überwältigenden kurzfristigen Auswirkungen von Gewebeverletzungen6.
Für In-vitro-Hämokompatibilitätstests stehen drei Arten von Modellen zur Verfügung: (1) statische Blutinkubationsmodelle, (2) agitierte Blutinkubationsmodelle und (3) Scherflussmodelle. Das statische Modell bietet eine einfache und schnelle Methode, um Thrombogenheit durch Inkubation des Geräts direkt mit Blut zu bestimmen, aber es führt nur zu rudimentären Ergebnissen in Bezug auf Hämokompatibilität11. Um die Hauptnachteile statischer Modelle (d.h. Sedimentation von Blutzellen und der großen luftkontaktierenden Oberfläche) zu überwinden, kann das aufrührerische Blutinkubationsmodell verwendet werden, in dem eine Testkammer mit den Implantaten mit Blut gefüllt und auf einer Schaukelplattform inkubiert wird12. Diese Modelltypen sind jedoch im Vergleich zu den vorhandenen Scherflussmodellen, wie z. B. der hier vorgestellten Strömungsschleife, noch unterlegen. Die Quintessenz dieser Modelle ist, dass der vaskuläre menschliche Blutfluss nachgeahten werden kann; So kann eine genaue Darstellung der realen Wechselwirkung zwischen Implantat und Blutzellen dargestellt werden13. Neben dem Durchflussschleifenmodell gibt es Modelle wie die Chandler-Schleife oder mehrere durchlässige Durchflusskammer14,15,16.
Die Chandler-Schleife ist ein geschlossenes Rohrsystem, das teilweise mit Luft gefüllt und in eine rotierende Vorrichtung geklemmt wird, was zu einer Durchblutung durch die Schläuche17führt. Im derzeitigen Durchflussschleifensystem wird das Rohr vollständig mit Blut gefüllt, und der Durchfluss wird durch eine peristaltische Pumpe erzwungen. Bei der Verwendung des Chandler-Loop-Modells sehen sich Bediener zwei große Nachteile gegenüber, da Luft in die Prüfschläuche aufgenommen werden muss. Zunächst ist bekannt, dass die ständige Wechselwirkung von Blut und Luft die Aggregation von Leukozyten und Blutplättchen sowie die Proteindenaturierung18,19auslöst. Zweitens ist die Durchblutungsrate begrenzt, da die Luft immer am höchsten Punkt der Schleife20bleibt.
Diese Nachteile können bei Verwendung des Durchflussschleifensystems überwunden werden. Da im System keine Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle vorhanden ist, erfolgt keine Thrombozytenaktivierung. Somit hat das Modell einen niedrigen Hintergrund für thrombotische Ereignisse, so dass eine niedrige Konzentration von Antikoagulanzien, typischerweise 1 I.E./ml oder 1,5 I.E./ml Heparin, ausreicht, um Gerinnung zu verhindern, selbst wenn hohe Durchflussraten angewendet werden6. Die einstellbare pumpenregulierte Durchblutungsrate und der frei wählbare Rohrdurchmesser ermöglichen es dem Bediener, die physiologischen Bedingungen einer Vene oder Arterie, die dem zu prüfenden Implantat entsprechen, nachzuahmen und relevante Testergebnisse zu erzielen21. Dieser Vorteil ist jedoch gleichzeitig eine Einschränkung, aufgrund der mechanischen Belastung des Blutes durch die Pumpe, und die Zerstörung von Erythrozyten (d.h. Hämolyse) kann auftreten2. Diese entstehende intrinsische Blutschädigung reduziert die Methodsensitivität und behindert eine längere Exposition gegenüber dem Blut21. Dennoch haben mehrere Studien die effektive Verwendung des Durchflussschleifenmodells für die Hämokompatibilitätsbewertung22,23,24gezeigt.
Die Hauptlücke zwischen allen In-vitro-Modellen und den In-vivo-Mechanismen umfasst jedoch das fehlende Endothel, das Zytokine, antithrombotische Komponenten und Adhäsionsmoleküle ausdrückt; daher spielt diese Komponente eine entscheidende Rolle bei der Interaktion zwischen Implantat und zirkulierendem Blut25. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Durchflussschleifenmodell einstellbar, effizient, zuverlässig und kostengünstig ist, um die Hämokompatibilität von Implantaten vor der klinischen Anwendung zu bewerten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Für die Leistungsfähigkeit der Rasterelektronenmikroskopie danken wir Ernst Schweizer von der Fachgruppe Medizinische Materialwissenschaft und -technik des Universitätsklinikums Tübingen. Die Forschung wurde vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der CR im Rahmen des Nationalen Nachhaltigkeitsprogramms II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) und vom Projekt Nr. 18-01163S der Tschechischen Wissenschaftsstiftung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
