Summary
양전자 방출 단층 촬영을 위한 불소-18(18F) 표지된 방사성 약제의 종합은 전형적으로 경험의 달을 요구합니다. 방사성 추적자에 통합될 때 실리콘 불소 수용기(SiFA) 모티프는 비용이 많이 드는 장비 및 준비 교육과는 무관한 간단한 18F라벨 링 프로토콜을 가능하게 하며, 필요한 전구체 양을 줄이고 더 온화한 반응 조건을 활용합니다.
Abstract
실리콘 불소 수용자(SiFA)로 알려진 파라 치환디-부틸플루오로실벤젠 구조 모티프는 방사능[18F]불소를 양전자 방출 단층 촬영에 사용하기 위한 트레이서에 통합하기 위한 방사성 화학자의 툴킷에 유용한 태그이다. 기존의 방사성 라벨링 전략에 비해, SiFA로부터 불소-19의 동위원소 교환[18F]불소는 실온에서 수행되고 최소한의 반응 참가자가 필요하다. 따라서 부산물의 형성은 무시할 수 있으며 정제는 크게 단순화됩니다. 그러나 라벨링에 사용되는 전구체 분자와 최종 방사성 표지 된 제품은 동위원소분리이지만 화학적으로 동일하므로 정화 절차 중에 분리할 수 없습니다. SiFA 태그는 또한[18F]불소의 처리 및 건조로부터 발생하는 기본 조건하에서 열화되기 쉽다. 상기 '4방울 방법'은 고체상 추출에서 용출된 처음 4방울[18F]불소만 사용되며, 반응에서 염기의 양을 감소시키고, 전구체의 낮은 어금니 양을 용이하게 하고, 분해를 감소시킨다.
Introduction
불소-18(109분 반감기, 97% 양전자 방출)은 양전자 방출 단층 촬영(PET)에 가장 중요한 방사성 핵종 중 하나이며, 다양한 질병에 대한 방사성 표지 추적자의 생체 분포를 시각화하고 정량화하는 비침습적 이미징 방법1. 펩티드 및 단백질은 다단계 합성에 의해 형성된 빌딩 블록을 필요로 하기 때문에[18F]불소로 라벨을 붙이기가 특히 어렵다2. 18F-방사성 라벨링의 복잡성을 줄이기 위해 실리콘 불소 수용기 (SiFA)는 최근 신뢰할 수있는 도구3으로도입되었습니다. SiFA 그룹은 두 개의 삼차 부틸 기, 유도페닐 모에티, 비방사성 불소 원자에 연결된 중앙 실리콘 원자로 구성됩니다. 삼차 부틸 그룹은 실리콘 불소 결합에 가수 분해 안정성을 부여하며, 이는 이미징 제제로서 SiFA 접합체의 생체 내 응용 분야에 중요한 특징입니다.
소분자 또는 생체분자에 부착될 때, SiFA 빌딩 블록은 방사성 측산물의 상당한 양을 형성하지 않고 나노몰 농도에서 불소-18에 대해 불소-19를 교환함으로써 방사성[18F]불소 음이온을 결합한다4. 또한, 높은 방사성 화학 수율은 낮은 온도에서 이극 성 용매에 SiFA moiety를 표시하여 신속하게 달성된다. 이것은 낮은 특정 활동의 방사성 추적자를 생성하는 고전적인 동위 원소 교환 반응과 극명한 대조에5. 이러한 경우, 다량의 전구체(밀리그램 범위)를 사용하여[18F]불소의 합리적인 통합을 얻어야 한다. SiFA를 이용한 동위원소 교환 반응은 운동학 연구 및 밀도 기능 이론계산에의해 확인된 바와 같이 훨씬 더 효율적입니다6,7. 표지된 SiFA는 표지된 SiFA 화합물과 라벨이 부착되지 않은 화합물이 화학적으로 동일하기 때문에 고체 상 추출에 의해 쉽게 정제됩니다. 이는 전구체 분자와 표지된 제품이 두 가지 화학 종이며 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 방사성 라벨링 후 분리되어야 하는 기존의 방사성 표지 추적기와 다릅니다. SiFA 빌딩 블록을 사용하여, 소분자, 단백질 및 펩티드는[18F]로 성공적으로 복잡한 정제 절차가 없는 1단계 및 2단계 라벨링 프로토콜에 의해 불소로 표지될 수 있다(그림 1)4,8,9. 더욱이, 일부 SiFA 표지 화합물은 혈류 및종양(10)에대한 생체내 이미징 제제에서 신뢰할 수 있다. SiFA 화학의 단순성은 훈련받지 않은 조사자조차도 방사선 추적기 합성 및 개발을 위해[18F] 불소를 사용할 수 있게 합니다.
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Protocol
주의 : 18F는 방사성 동위원소이므로 적절한 차폐 뒤에있는 모든 절차를 수행 해야한다는 것을 명심해야합니다. 납 차폐는 이러한 유형의 방사선에 적합합니다. 이 절차 전체에 걸쳐 방사선 검출 배지를 착용해야 합니다. 또한, 합성 후 아무것도 만지기 전에 장갑을 즉시 폐기, 그들은 방사성 활동으로 오염 될 수 있습니다. 손발 모니터와 팬케이크 가이거 카운터를 사용하여 소매, 손 및 발의 오염 여부를 확인합니다.
1. 18F-음이온의 아제오트로픽 건조
참고: 그림 2A는 ~10분 정도 걸리는 이 프로시저의 워크플로 그래프를 보여 주며, 이 그래프는 다음과 같은 것입니다.
- 카리지를 통해 0.5 MK2CO3(10 mL)를 통과하고 탈이온수(10 mL)를 통과시킴으로써 사각 메틸 암모늄(QMA) 음이온 교환 카트리지(표)를 전제 조건으로 한다.
- [18F]F-/[18O]H2O(100−500 MBq)의 수성 용액을 남성 어댑터를 사용하여 역으로 조건부QMA 카트리지를 통과한다. 【18O 】H2O를 버리십시오.
참고: 이러한 단계는 자동 합성 모듈을 사용하거나 주사기에 추가 차폐를 사용하여 수행할 수 있습니다. - QMA 카트리지로부터 의 고정된[18F]의 처음 4방울을 [2.2.2]의 준비된 용액으로 [2.2]cryptand(재료의 표)(10 mg), 0.2 MK2CO3 (50 μL, 10 μmol), 및 아세토니트릴(1 mL)을 두꺼운 벽v-바이알, 밀봉의 용액으로 용해시켰다.
참고: 처음 네 방울만이 방사성[18F]불소의 대다수로서 사용되며, 이들 방울에서 QMA를 용출한다. 이는 SiFA 의 분해를 피하기 위해 필요한[18F]불소 스톡 솔루션에서 전진되는 염기의 양을 감소시킨다. - 바이알을 밀봉하고 뜨거운 접시에 위치한 90 °C 미네랄 오일 욕조에 놓습니다. 통풍구 바늘과 아르곤 가스 스트림에 연결된 바늘을 바이알 캡의 중격에 삽입합니다. 아르곤의 부드러운 흐름 아래에서 용매를 증발시키기 위해 5 분 기다립니다. 아세토니트릴 1mL를 추가하여 남은 물의 흔적을 제거하여 아제오트로픽 공동 증발을 용이하게 합니다. 건조함을 보장하기 위해 이 단계를 2x반복합니다.
- 용매가 눈에 띄게 제거되면 아르곤 흐름을 중지하고 바이알 캡에서 주사기를 제거하고 오일 욕조에서 바이알을 제거합니다.
- 건조[18F]불소를선택의 반응 용매에서 재중단시킨다.
참고 :이 경우, 아세토니트릴 (1 mL)은 높은 반응성[18F-] F- (100−500 MBq)의 주식 솔루션을 만들기 위해 추가됩니다. 이제 이 솔루션을 레이블 지정에 사용할 수 있습니다.
2. 한 단계 SiFA-리간드 라벨링
참고: 그림 2B는 ~15분 정도 걸리는 이 프로시저의 워크플로 그래프를 보여 주며, 이 그래프는 다음과 같은 것입니다.
- C-18 카트리지(재료표)를에탄올(10mL)과 증류수(10mL)로 헹구어 서 두지.
- [18F-]불소스톡 용액을 SiFA 표지 된 전구체(100 μL, 20-100 nmol)를 함유하는 반응 바이알에 첨가한다. 용액을 교반하지 않고 실온에서 5분 동안 라벨링 반응을 진행합니다.
참고: 반응에 필요한 활동의 양에 따라 전체 스톡 솔루션을 추가하거나 aliquot를 추가할 수 있습니다. - 반응 혼합물을 0.1 m 포스페이트 버퍼(9 mL)를 함유하는 20 mL 주사기에 넣고 미리 조건이 있는 C-18 카트리지를 통과하여 표지된 트레이서를 트래핑한다.
- 증류수(5mL)로 카트리지를 세척한 다음 C-18 카트리지에서 에탄올(300 μL)으로 갇힌 추적자를 용출하고 주입용 멸균 인산 완충액으로 희석합니다(3 mL).
- 멸균 필터를 통해 정제된[18F]SiFA 추적기를 전달합니다.
참고 : 작은 동물 이미징을위한 명확한 PET 상상을 얻으려면 분할 된 환자 용량은 5−8 MBq 사이여야합니다. 인간의 사용을 위해, 분할 된 환자 용량은 200-300 MBq 사이여야합니다. - 정제된[18F]SiFA-트레이서의 작은 aliquot(~4 MBq)를 역상 C-18 컬럼이 장착된 HPLC 시스템에 주입하여 방사성 화학적 순도가 95% 이상임을 확인한다.
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Representative Results
단순 SiFA 동위 원소 교환은[18F]불소 (60−90 %)의 높은 방사성 화학 적 혼입정도를 달성 할 수 있습니다. 합성 복잡성의 최소 금액(그림 1). 대부분의 분자는 정제를 위한 HPLC를 포함하지 않고 한 단계로[18F]불소로 방사성 표지될 수있다(도 2). 무선-HPLC는 품질 관리 목적으로 사용될 수 있으며, 여기서 최종 제품의 자외선(UV) 흡광도 피크는 총 피크 면적의 95% 이상인 무선 피크와 일치해야한다(도 3). Radio-HPLC 크로마토그램이 UV 활성 또는 방사성 불순물의 상당한 형성을 드러내는 경우, 전구체는 경미한 기본 방사성 라벨링 조건 하에서 안정되지 않을 수 있습니다. 유기 용매에 용해된 옥살산의 희석용액은 기본성을 낮추기 위한 노력의 일환으로 SiFA-전구체를 첨가하기 전에[18F]불소 스톡 용액에 첨가될 수 있다; 그러나, 기본성을 너무 많이 낮추면[18F]불소 애니온의 핵성도를 감소시킬 것이다. 따라서, 필요한 옥살리산의 몰 양은 사전에 실험적으로 결정되어야 할 것이다. 대안적으로, 표지된 SiFA-리간드는 불순물의 형성이 유의하지만 관리가 용이한 경우 단계 2.3 후에 HPLC에 의해 정제될 수 있다. 단계 2.4 이상은 정제된 SiFA-리간드로부터 HPLC 용매를 제거하기 위해 HPLC 정제 후에도 여전히 필요합니다.
[18F]불소가 SiFA-리간드에 용이하게 통합되지 않은 경우, 용해도에 문제가 있을 수 있으며, 또 다른 선발성 용매가 반응을 위해 아세토니트릴 대신에 사용될 수 있다. 에탄올과 같은 프로틱 용매는 성공적으로 사용되었지만 가열이 필요할 수 있습니다. 무선 박층 크로마토그래피(radio-TLC)에 의한 반응을 모니터링하면 라벨링 프로토콜에 대한 변경 의 결과를 비법인으로 식별하는 데 신속하게 보좌관이 될 수있다[18F]불소는 표준 실리카 TLC 플레이트상의 기준선을 부착할 것이다.
라벨이 붙은 SiFA-리간드가 2.3단계에서 C18 카트리지를 통과하는 경우, 용출용액에 나타나는 활동의 대량에 의해 지시된 바와 같이 카트리지에 나타나지 않고, 사용된 카트리지의 위상을 변경해야 할 수도 있다. 폴라 SiFA-리간드에는 일부 친수성 특성을 가진 C18 수지가 함유된 더 큰 C18 카트리지 또는 이중상 카트리지가 필요할 수 있다.
라벨이 부착된 SiFA-리간드도 PET와 같은 생체 내 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 표지된소분자[18F]SiFA-PSMA(도4A)는마우스 모델에서 이식된 종양 이종이식을 이미지화하는 데 사용되었다(도4B). SiFA-tracer는 경쟁 억제제에 의해 차단될 수 있는 60분 이상 유리한 종양 추월을 표시했습니다(도4C). 더욱 인상적인 것은, 18F표지펩티드[18F]SiFA린-TATE(도5A)를PET(도5B)및 PET/CT(도5C)를통해 암환자에서 전이성 신경내분비 종양을 심상으로 사용하였다.
그림 1: SiFA 18F-방사성 라벨링 워크플로우 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일반적인 SiFA 18F-방사성 라벨링 프로토콜. (A)[18F]불소의 아제오트로픽 건조. (B)SiFA 라벨링 반응 및 고체 상 추출을 통한 정제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3:[18F]SiFA-PSMA의 고체 상 추출 정제 후 최종 무선-HPLC 크로마토그램, 품질 관리를 위해 촬영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 표지된 SiFA-리간드의 적용. (A)[18F]SiFA-PSMA 라디오 트레이서의 구조. (B)왼쪽 어깨 위에 LNCaP 이종이식 종양을 운반하는 마우스의 재구성 이미지, 60 분 후 주사 (p.i.)[18F]SiFA-PSMA. (C)[18F]SiFA-PSMA 통풍관에 대한 시간 활성 곡선은 60분 이상 종양 및 근육 조직에서, 차단제로서 300 μg DCFPyL의 사전 투여 유무에 관계없이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 표지된 SiFA-리간드의 적용. (A)【18F 】SiFA-TATE 방사성 추적기의 구조. (B)[18F]SiFA-TATE와 함께 전이성 내분비 종양을 가진 인간 암 환자의 PET 이미지를 재구성하였다. (C)횡단 및 시상 평면에서 동일한 환자의 PET /CT 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
SiFA 라벨링 화학은 실온에서 수행될 수 있는 매우 효율적인 동위원소 교환 반응을 채택한 최초의 18가지F 라벨링 방법 중 하나를 나타낸다. 전형적인 방사성 화학 반응은 제거 또는 치환 경로를 통해 불소 반응성 기능을 가진[18F]의 반응을 통해 탄소 불소 결합의 형성에 의존한다. 이러한 반응 조건은 종종 가혹한, 극단적인 pH 또는 높은 온도에서 수행, 그리고 HPLC와 같은 힘들고 시간이 많이 걸리는 기술을 사용 하 여 제거 해야 하는 부산물 또는 반응 참가자와 함께 누워. SiFA 라벨링 기술을 사용하면 라벨링 전구체와 18개의F-라벨화합물이 화학적으로 동일합니다. 더욱이, 반응이 아주 온화한 조건하에서 진행되기 때문에 아무 부작용도 일반적으로 관찰되지 않습니다. 이러한 기능을 통해 더 복잡한 분자(즉, 단백질, 자유 라디칼 발생기, 금속 킬레이트, 형광원, 생물 발광 전구체)에 라벨을 붙일 수 있으며, 이는 일반적으로 반응성 조건 이나 높은 온도하에서 분해되거나 전형화될 수 있습니다. 또한, 18개의F-라벨이 부착된 SiFA 함유 화합물은 간단한 고체 상 추출 기술을 사용하여 신속하게 정제될 수 있습니다.
이러한 라벨링 방법은 '4 드롭 방법'을 활용하며, 여기서 QMA 카트리지에서[18F]불소를용출할 때 기본 용출 용액의 처음 4방울만 사용된다. 이러한 변형은 [18F]플루오라이드 스톡이 용출 용액으로부터 모든 염기를 함유하는 경우 SiFA 모에티를 저하시킬 때[18F]불소 스톡 용액에서염기의 양을 감소시키기 위해 이루어졌다. 이전에는 기본성을 줄이기 위해[18F]불소 스톡 용액에 옥살산을 첨가하거나, 전체 용액 대신에 소량의 스톡을 사용하였고, 이는 낭비적이었습니다. '4 드롭 메서드'는 SiFA 라벨링 프로토콜의 최신 이터레이션을 나타냅니다.
전구체 분자및 표지된 최종 생성물은 화학적으로 동일하기 때문에, 최종 주사제의 정제 및 몰 활성 동안 서로 분리될 수 없으므로 동위원소 교환에 사용되는 전구체의 양에 전적으로 의존한다. 최종 용액에서 표지되지 않은 전구체의 분획이 너무 높게 갖는 것은 표지되지 않은 전구체와의 경쟁으로 인해 의도된 분자 표적을 결합하는 표지된 SiFA-리간드의 기회를 감소시킬 것이다. 따라서, 어금니 활성은 라벨링에 사용되는 전구체의 양에 전적으로 의존한다. 일반적으로 재현 가능한 라벨링 반응에는 20-100 nmol의 전구체가 필요하며, 80GBq/μmol 이상의 어금니 활동을 달성하기 위해 5nmol의 전구체가 성공적으로 표지되었습니다.
SiFA 빌딩 블록(예를 들어, SiFA-octreotate)으로 유도된 소분자 및 펩티드는 한 단계에서[18F]불소로 표지될 수 있다; 그러나, 단백질의 SiFA 라벨링은 2단계 프로토콜을 필요로 한다. 작고 반응성이 높은 SiFA 보철군(예:[18F]SiFB)은 주어진 단백질을 준비하고 반응해야 하며, 표지된 단백질은 HPLC에 의해 정제되어야 합니다.
SiFA 라벨링 방법론은 HPLC 정제 및 광범위한 반응 조작이 일반적으로 필요하지 않기 때문에 방사성 의약품 키트 합성에 잘 어부릴 수 있습니다. SiFA-ligand의 단일 환자 용량 수량으로 간단한 '흔들고 굽는' 스타일 키트는 방사선 약국 기술자가 쉽게 처리 할 수 있어 자동화 된 합성 장치보다 훨씬 작은 학습 곡선과 시간 / 인건비가 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 아무런 인정이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
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