Summary
La sintesi di fluoro-18 (18F) etichettato radiofarmaceutico per la tomografia a emissione di positroni richiede in genere mesi di esperienza. Quando incorporato in un radiotracciatore, il motivo SiFA (Silicon-fluorride acceptor) consente un semplice protocollo di etichettatura Fdi 18 che è indipendente da attrezzature costose e formazione preparatoria, riducendo la quantità precursore necessaria e utilizzando condizioni di reazione più lievi.
Abstract
Il motivo strutturale para-sostituito di-tert-butylfluorolbenzene noto come l'accettatore di silicio-fluoruro (SiFA) è un tag utile nel toolkit del radiochimico per incorporare il fluoruro radioattivo [18F]fluoruro nei traccianti per l'uso nella tomografia a emissione di positroni. Rispetto alle tradizionali strategie di radioetichettatura, lo scambio isotopico di fluoro-19 da SiFA con [18F]fluoruro viene effettuato a temperatura ambiente e richiede partecipanti alla reazione minima. La formazione di sottoprodotti è quindi trascurabile e la purificazione è notevolmente semplificata. Tuttavia, mentre la molecola precursore utilizzata per l'etichettatura e il prodotto radioetichettato finale sono isotopicamente discreti, sono chimicamente identici e sono quindi inseparabili durante le procedure di purificazione. Il tag SiFA è anche suscettibile alla degradazione nelle condizioni di base derivanti dalla lavorazione e dall'essiccazione di [18F]fluoruro. Il "metodo a 4 gocce", in cui solo le prime 4 gocce di eluito [18F]fluoruro vengono utilizzate dall'estrazione in fase solida, riduce la quantità di base nella reazione, facilita una minore quantità molare di precursore e riduce le degradazioni.
Introduction
Fluoro-18 (109 minuti di emivita, 97% di emissione di positroni) è tra i più importanti radionuclidi per la tomografia a emissione di positroni (PET), un metodo di imaging non invasivo che visualizza e quantifica la bio-distribuzione dei traccianti radioetichettati per varie malattie1. Peptidi e proteine sono particolarmente difficili da etichettare con [18F]fluoruro perché richiedono blocchi costitutivi formati da sintesi a più fasi2. Per ridurre la complessità di 18F-radiolabeling, l'accettatore di fluoruro di silicio (SiFA) è stato recentemente introdotto come strumenti affidabili3. Il gruppo SiFA è costituito da un atomo di silicio centrale collegato a due gruppi di butile terziari, una moiety fenili derivata e un atomo fluoro non radioattivo. I gruppi terziari di butile conferiscono stabilità idrolitica al legame siliconico-fluoruro, che è una caratteristica fondamentale per le applicazioni in vivo di SiFA coniugati come agenti di imaging.
Quando sono attaccati a una piccola molecola o biomolecola, i blocchi costitutivi SiFA legano gli anioni radioattivi [18F]fluoruro scambiando fluoro-19 per fluoro-18 a concentrazioni di nanomolare senza formare quantità significative di prodotti laterali radioattivi4. Inoltre, un'elevata resa radiochimica si ottiene rapidamente etichettando la moiety SiFA in solventi aprotici dividuci a basse temperature. Questo è in netto contrasto con le reazioni di scambio isotopico classiche, che producono radiotracciatori di bassa attività specifica5. In questi casi, grandi quantità di precursori (nella gamma di milligrammi) devono essere utilizzati per ottenere una ragionevole incorporazione di [18F]fluoruro. Le reazioni di scambio isotopico con SiFA sono molto più efficienti, come confermato da studi cinetici e calcoli della teoria funzionale della densità6,7. I SiFA etichettati sono facilmente purificati dall'estrazione in fase solida, poiché sia i composti SiFA etichettati che quelli non etichettati sono chimicamente identici. Questo differisce dai tradizionali traccianti radioetichettati, dove la molecola precursore e il prodotto etichettato sono due specie chimiche diverse e devono essere separati dopo la radioetichettatura da cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Utilizzando blocchi costitutivi SiFA, piccole molecole, proteine e peptidi possono essere etichettati con successo con [18F]fluoruro da protocolli di etichettatura in una e due fasi privi di complicate procedure di purificazione (Figura 1),4,8,9. Inoltre, alcuni composti etichettati siFA sono affidabili agenti di imaging in vivo per il flusso sanguigno e tumori10. La semplicità della chimica SiFA consente anche ai ricercatori non addestrati di utilizzare [18F]fluoruro per la sintesi e lo sviluppo del radiotracciante.
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Protocol
AVVISO: Bisogna tenere a mente che 18F è un isotopo radioattivo, e quindi è necessario eseguire tutte le procedure alla base di un'adeguata schermatura. La schermatura del piombo è appropriata per questo tipo di radiazioni. Assicurarsi di indossare badge di rilevamento delle radiazioni per tutta la durata di questa procedura. Inoltre, smaltire immediatamente i guanti prima di toccare qualsiasi cosa dopo la sintesi, in quanto possono essere contaminati da attività radioattiva. Utilizzare monitor a piedi a mano e contatori Pancake Geiger per verificare la contaminazione di maniche, mani e piedi.
1. Essiccazione azeotropica di 18F-anion
NOTA: Figura 2A Mostra un grafico del flusso di lavoro di questa procedura, che richiede 10 min.
- Precondizionare una cartuccia di cambio anion (QMA) diammoniaca quaternaria (QMA) passando per 0,5 M K2CO3 (10 mL) attraverso la cartuccia, seguita da acqua deionizzata (10 mL).
- Passare una soluzione acquosa di [18F]F-/[18O]H2O (100-500 MBq) attraverso la cartuccia QMA precondizionata in retromarcia, utilizzando un adattatore da maschio a maschio. Eliminare il [18O]H2O.
NOTA: questi passaggi possono essere eseguiti utilizzando un modulo di sintesi automatico o utilizzando schermatura aggiuntiva sulla siringa. - Elutare le prime quattro gocce degli anioni fissi [18F]fluoroi dalla cartuccia QMA in una soluzione preparata di [2.2.2]cryptand (Table of Materials) (10 mg), 0.2 M 2 4CO3 (50 L, 10 zmol) e acetonitrile (1 mL) in una v-vial densa mente-
NOTA: Solo le prime quattro gocce vengono utilizzate come la maggior parte del radioattivo [18F]fluoruro è eluito fuori il QMA in queste gocce. Questo riduce la quantità di base portata avanti nella soluzione di magazzino[18F]fluoruro, che è necessaria per evitare la degradazione della moiety SiFA. - Sigillare la fiala e posizionarla in un bagno di olio minerale di 90 gradi posizionato su una piastra calda. Inserire un ago di sfiato e un ago collegato a un flusso di gas argon nel setto del tappo della fiala. Attendere 5 min per far evaporare i solventi sotto il flusso dolce di argon. Rimuovere eventuali tracce rimanenti di acqua aggiungendo 1 mL di acetonitrile per facilitare la co-evaporazione azeotropica. Ripetere questo passaggio 2x per garantire la secchezza.
- Una volta rimosso visibilmente il solvente, fermare il flusso di argon e rimuovere le siringhe dal tappo della fiala e rimuovere la fiala dal bagno d'olio.
- Risospendere il fluoruro essiccato [18F]nel solvente di reazione di scelta.
NOTA: In questo caso, acetonitrile (1 mL) viene aggiunto per creare una soluzione di stock altamente reattiva [18F-]F- (100-500 MBq). Questa soluzione può ora essere utilizzata per l'etichettatura.
2. Etichettatura SiFA-ligando in un unico passaggio
NOTA: Figura 2B mostra un grafico del flusso di lavoro di questa procedura, che richiede 15 min.
- Precondizionare una cartuccia C-18 (Tabella dei materiali) risciacquandola con etanolo (10 mL) e acqua distillata (10 mL).
- Aggiungete la soluzione di stock [18F-]fluoruro a una fiala di reazione contenente un precursore con etichetta SiFA (100 nmol, 20-100 nmol). Lasciare che la reazione di etichettatura proceda per 5 min a temperatura ambiente senza agitare la soluzione.
NOTA: L'intera soluzione di stock può essere aggiunta o un, a seconda di quanta attività si desidera per la reazione. - Prelevare la miscela di reazione in una siringa da 20 mL contenente tampone di fosfato da 0,1 M (9 mL) e passare la soluzione attraverso la cartuccia C-18 precondizionata per intrappolare il tracciante etichettato.
- Lavare la cartuccia con acqua distillata (5 mL), quindi eluire il tracciante intrappolato dalla cartuccia C-18 con etanolo (300 - L) e diluire con cuscinetto fosfato sterile per l'iniezione (3 mL).
- Passare il purificato [18F]SiFA-tracer attraverso un filtro sterile.
NOTA: Per ottenere un PET chiaro immaginate per l'imaging di piccoli animali, la dose di circa il paziente diviso deve essere compresa tra 5-8 MBq. Per uso umano, la dose di paziente partizionato dovrebbe essere compresa tra 200,300 MBq. - Iniettare una piccola aliquota (4 MBq) del purificato [18F]SiFA-tracer su un sistema HPLC dotato di una colonna C-18 in fase invertita per confermare che la purezza radiochimica è superiore al 95%.
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Representative Results
Lo scambio isotopico SiFA semplicistico può raggiungere un elevato grado di incorporazione radiochimica di [18F]fluoruro (60-90%) con una quantità minima di complessità sintetica (Figura 1). La maggior parte delle molecole può essere radioetichettata con [18F]fluoruro in un unico passaggio senza coinvolgere HPLC per la purificazione (Figura 2). Radio-HPLC può essere utilizzato per scopi di controllo di qualità, in cui il picco di assorbimento ultravioletto (UV) del prodotto finale dovrebbe coincidere con il suo picco radio superiore al 95% area di picco totale (Figura 3). Se il cromatogramma radio-HPLC rivela una formazione significativa di impurità attive o radioattive UV, il precursore potrebbe non essere stabile nelle condizioni di radioetichettatura leggermente di base. Una soluzione diluita di acido osalico disciolto in un solvente organico può essere aggiunta alla soluzione di stock[18F]fluoruro prima dell'aggiunta a SiFA-precursor nel tentativo di abbassare la basicità; tuttavia, abbassando troppo la basicità diminuirà la nucleofilità dell'anione[18F]fluoruro. Pertanto, la quantità molare di acido osalico necessario dovrà essere determinata sperimentalmente in anticipo. In alternativa, il SiFA-Ligand etichettato può essere purificato da HPLC dopo il passaggio 2.3 se la formazione di impurità è significativa ma gestibile. I passaggi 2.4 e oltre saranno ancora necessari dopo la purificazione HPLC al fine di rimuovere il solvente HPLC dal sugo purificato SiFA-Ligand.
Se il [18F]fluoruro non è facilmente incorporato nel SiFA-ligand, ci possono essere problemi di solubilità e un altro solvente aprotico di scelta può essere utilizzato al posto di acetonitrile per la reazione. I solventi protici, come l'etanolo, sono stati utilizzati con successo, ma possono richiedere il riscaldamento. Il monitoraggio della reazione mediante cromatografia a strato radiosottile (radio-TLC) può rapidamente aiutare a identificare l'esito di eventuali modifiche apportate al protocollo di etichettatura come non incorporato [18F]fluoruro aderisce alla linea di base su una piastra TLC di silice standard.
Se il siggando sifa-ligando etichettato passa attraverso la cartuccia C18 nel passaggio 2.3, come indicato dalla maggior parte dell'attività che appare nella soluzione eluita e non nella cartuccia, allora la fase della cartuccia utilizzata potrebbe essere modificata. I ligandi Polar SiFA possono aver bisogno di una cartuccia C18 più grande o di una cartuccia a doppia fase contenente una resina C18 con alcune caratteristiche idrofile.
I ligandi SiFA etichettati possono essere utilizzati anche per applicazioni in vivo come il PET. Ad esempio, la molecola piccola etichettata [18F]SiFA-PSMA (Figura 4A) è stata utilizzata per immaginare uno xenotrapianto tumorale impiantato in un modello murino (Figura 4B). Il SiFA-tracciatore ha mostrato l'assorbimento di tumore favorevole oltre 60 min, che potrebbe essere bloccato da un inibitore competitivo (Figura 4C). Ancora più impressionante, il peptide 18con etichetta F [18F]SiFAlin-TATE (Figura 5A) è stato utilizzato per l'immagine di tumori neuroendocrini metastatici in un paziente oncologico tramite PET (Figura 5B) e PET/CT ( Figura5C)11.
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro di radioattività F SiFA 18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: tipico protocollo SiFA 18F-radiolabeling. (A) Essiccazione azeotropica di[18F]fluoruro. (B) Reazione e purificazione SiFA tramite estrazione in fase solida. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cromatogramma radio-HPLC finale dopo la purificazione dell'estrazione in fase solida di [18F]SiFA-PSMA, preso per il controllo di qualità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Applicazione di livrea SiFA-ligands con etichetta. (A) Struttura del radiotracciatore [18F]SiFA-PSMA. (B) Immagine ricostruita di un topo che trasporta un tumore allo xenotrapianto LNCaP sulla spalla sinistra, 60 min post iniezione (p.i.) con [18F]SiFA-PSMA. (C) Le curve di attività temporale per l'assorbimento di[18F]SiFA-PSMA nei tessuti tumorali e muscolari superiori a 60 min, con o senza la somministrazione preventiva di 300 DCFPyL come agente di blocco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Applicazione di livrea SiFA-ligands con etichetta. (A) Struttura del radiotracciatore [18F]SiFA-TATE. (B) Immagine PET ricostruita di un malato di cancro umano con tumori endocrini metastatici con [18F]SiFA-TATE. (C) Immagini PET/TC dello stesso paziente nei piani trasversali e sagittale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La chimica dell'etichettatura SiFA rappresenta uno dei primi 18metodi di etichettatura F che impiegano una reazione di scambio isotopico straordinariamente efficiente che può essere eseguita a temperatura ambiente. Una tipica reazione radiochimica si basa sulla formazione di un legame carbonio-fluoro attraverso la reazione del[18F]fluoruro con una funzionalità fluoruro-reattiva attraverso un percorso di eliminazione o sostituzione. Queste condizioni di reazione sono spesso dure, eseguite a pH estremo o ad alta temperatura, e sono cariche di sottoprodotti o partecipanti alla reazione che devono essere rimossi utilizzando tecniche laboriose e dispendiose in termini di tempo come hpLC. Con la tecnica di etichettatura SiFA, il precursore dell'etichettatura e il composto con etichettatura 18F sono chimicamente identici. Inoltre, di solito non si osservano prodotti collaterali poiché la reazione procede in condizioni molto lievi. Queste caratteristiche consentono di etichettare molecole più complicate (ad esempio, proteine, generatori di radicali liberi, metal-chelati, fluorofori, precursori bioluminescenti) che normalmente possono decomporre o epimerizzare in condizioni più reattive o temperature elevate. Inoltre, 18composti contenenti SiFA con etichetta F possono essere purificati rapidamente utilizzando semplici tecniche di estrazione in fase solida.
Questa metodologia di etichettatura utilizza il 'metodo 4 goccia', in cui solo le prime 4 gocce della soluzione di eluzione di base vengono utilizzate quando si elusa intrappolato [18F]fluoruro fuori di una cartuccia QMA. Questa modifica è stata apportata per ridurre la quantità di base nella soluzione di stock [18F]fluoruro in quanto avrebbe degradato la moiety SiFA se lo stock di[18F]fluoruro contenesse tutta la base dalla soluzione di eluizione. In precedenza, l'acido osalico è stato aggiunto alla soluzione di magazzino[18F]fluoruro per ridurre la basicità, o una piccola aliquota dello stock è stata utilizzata al posto dell'intera soluzione, che è stata dispendiosa. Il 'metodo di rilascio' rappresenta l'ultima iterazione del protocollo di etichettatura SiFA.
Poiché la molecola precursore e il prodotto finale etichettato sono chimicamente identici, non possono essere separati l'uno dall'altro durante la purificazione e l'attività molare dell'iniettabile finale dipende quindi interamente dalla quantità di precursore utilizzata per lo scambio isotopico. Avere una frazione troppo alta di una frazione di precursore non etichettato nella soluzione finale ridurrà l'opportunità del SiFA-Ligand etichettato di legare il suo obiettivo molecolare previsto a causa della concorrenza con il precursore non etichettato. Pertanto, l'attività molare dipende interamente dalla quantità di precursore utilizzata per l'etichettatura. Tipicamente, sono necessari 20-100 nmol di precursori per le reazioni di etichettatura riproducibili, e appena 5 nmol di precursore è stato etichettato con successo per ottenere attività molare di 80 GBq / mol e superiori.
Piccole molecole e peptidi derivati con il blocco costitutivo Della SiFA (ad esempio, SiFA-octreotate) possono essere etichettati con [18F]fluoruro in un solo passaggio; tuttavia, l'etichettatura SiFA delle proteine richiede un protocollo in due fasi. Un piccolo gruppo siFA-protesico altamente reattivo (ad esempio, [18F]SiFB) deve essere preparato e reagito con la proteina data, e la proteina etichettata deve quindi essere purificata dall'HPLC.
La metodologia di etichettatura SiFA si presta bene alle sintesi di kit radiofarmaceutici, poiché in genere non sono necessarie la purificazione dell'HPLC e l'ampia manipolazione delle reazioni. Semplici kit di stile "shake and bake" con quantità di dose per singolo paziente di un ligando SiFA potrebbero essere facilmente gestiti dai tecnici della radiofarmacia, che richiedono una curva di apprendimento molto più piccola e un costo di tempo/lavoro rispetto a un'unità di sintesi automatizzata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
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