Summary
Syntesen av fluor-18 (18F) märkt radiofarmaka för positron emissions tomografi kräver vanligtvis månader av erfarenhet. När den införlivas i en radiotracer, silikon-fluorid acceptor (SiFA) motiv möjliggör en enkel 18F-märkning protokoll som är oberoende av dyr utrustning och förberedande utbildning, samtidigt minska prekursorer mängd som behövs och utnyttja mildare reaktions förhållanden.
Abstract
Den para-substituerade di-tert-butylfluorsilylbensen strukturella motiv som kallas Silicon-fluorid acceptor (Sifa) är en användbar tagg i radiochemist ' s Toolkit för att införliva radioaktiva [18F] fluorid i spårämnen för användning i positron emissions tomografi. I jämförelse med konventionella radiolabeling strategier, isotop utbyte av fluor-19 från SiFA med [18F] fluor utförs vid rumstemperatur och kräver minimal reaktion deltagare. Bildandet av biprodukter är således försumbar, och rening är kraftigt förenklad. Medan den föregångare molekyl som används för märkning och den slutliga radioaktivt märkt produkt är isotopiskt diskret, de är kemiskt identiska och är därmed oskiljaktiga under reningsförfaranden. SiFA-taggen är också känslig för nedbrytning under de grundläggande förhållanden som uppkommer vid bearbetning och torkning av [18F] fluorid. Den "4 Drop metod", där endast de första 4 droppar eluerade [18F] fluorid används från den fasta fasen utvinning, minskar mängden bas i reaktionen, underlättar lägre molar mängder av föregångare, och minskar nedbrytning.
Introduction
Fluor-18 (109-minuters halveringstid, 97% positron emission) är bland de viktigaste radionukliderna för positron emissions tomografi (PET), en noninvasiv avbildning metod som visualiserar och kvantifierar bio-distribution av radiomärkade spårämnen för olika sjukdomar1. Peptider och proteiner är särskilt svåra att märka med [18F] fluorid eftersom de kräver byggstenar som bildas av flera steg synteser2. För att minska komplexiteten av 18F-radiolabeling, kisel-fluorid acceptor (Sifa) infördes nyligen som tillförlitliga verktyg3. SiFA-gruppen består av en central kisel atom som är ansluten till två tertiära butylgrupper, en derivatiserad fenyldel och en icke-radioaktiv fluor Atom. Den tertiära butyl grupper ge hydrolytisk stabilitet till kisel-fluorid Bond, som är en kritisk funktion för in vivo tillämpningar av SiFA konjugat som Imaging agenter.
När SiFA-byggblocken är fästa vid en liten molekyl eller Biomolecule binder de radioaktiva [18F] fluorid anjoner genom att utbyta fluor-19 mot fluor-18 vid nanomolära koncentrationer utan att bilda betydande mängder radioaktiva sidoprodukter4. Dessutom uppnås snabbt en hög radiokemisk avkastning genom märkning av Sifa-delen i tvåpolig aprotiska-lösningsmedel vid låga temperaturer. Detta står i skarp kontrast till klassisk isotop utbyta reaktioner, som producerar radiotracers av låg specifik aktivitet5. I dessa fall måste stora mängder prekursorer (i intervallet milligram) användas för att få en rimlig inkorporering av [18F] fluorid. Isotop utbyta reaktioner med sifas är mycket effektivare, vilket bekräftas av kinetiska studier och densitet funktionell teori beräkningar6,7. Märkta SiFAs är lätt renas genom fast-fas extraktion eftersom både märkta och omärkta SiFA föreningar är kemiskt identiska. Detta skiljer sig från traditionella radiomärkta spårämnen, där föregångaren molekylen och den märkta produkten är två olika kemiska arter och måste separeras efter radiomärkt genom högeffektiv vätskekromatografi (HPLC). Med hjälp av Sifa byggstenar, små molekyler, proteiner och peptider kan framgångsrikt märkas med [18F] fluorid av en-och två steg märkning protokoll saknar komplicerade reningsförfaranden (figur 1)4,8,9. Dessutom, vissa SiFA-märkta föreningar är pålitliga in vivo Imaging agenter för blodflödet och tumörer10. Enkelheten i SiFA kemi möjliggör även otränade utredare att använda [18F] fluorid för radiotracer syntes och utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FÖRSIKTIGHET: man måste ha i åtanke att 18F är en radioaktiv isotop, och därför är det nödvändigt att utföra alla procedurer bakom adekvat avskärmning. Bly avskärmning är lämplig för denna typ av strålning. Var noga med att bära strålnings identifieringsmärken under hela denna procedur. Dessutom, omedelbart kassera handskar innan du vidrör något efter syntesen, eftersom de kan vara förorenade med radioaktiv aktivitet. Utnyttja hand-fot monitorer samt pannkaka Geiger räknare för att kontrollera om kontaminering av ärmar, händer, och fötter.
1. azeotropisk torkning av 18F-Anion
ANMÄRKNINGAR: figur 2a visar ett arbetsflödesdiagram av denna procedur, som tar ~ 10 min.
- Förutsättning en kvartärgeologi metyl ammonium (QMA) anjonutbytes patron (tabell över material) genom att passera 0,5 M K2Co3 (10 ml) genom patronen, följt av avjoniserat vatten (10 ml).
- Passera en vattenlösning av [18f] f-/[18o] H2O (100 − 500 MBq) genom den förkonditionerade QMA patronen i omvänd, med hjälp av en hane till hane adapter. Kassera [18o] H2o.
Obs: dessa steg kan utföras med hjälp av en automatiserad syntes modul, eller genom att använda ytterligare avskärmning på sprutan. - Eluera de första fyra dropparna av de fasta [18F] fluoridanjonerna från QMA-patronen till en beredd lösning av [2.2.2] Cryptand (tabell över material) (10 mg). 0,2 M K2Co3 (50 μl, 10 μmol) och acetonitril (1 ml) i en tjockväggiga v-injektionsflaska och försegla injektionsflaskan.
Notera: endast de första fyra dropparna används, som majoriteten av det radioaktivt [18F] fluoride elueras av qmaen i dessa tappar. Detta minskar mängden bas som transporteras framåt i [18F] fluorid stamlösning, vilket är nödvändigt för att undvika nedbrytning av Sifa-delen. - Försegla injektionsflaskan och placera den i ett mineral olje bad på 90 ° c placerad på en värmeplatta. Sätt i en ventilerad nål och en nål ansluten till en ström av argon gas i septum av flaskan locket. Vänta 5 min att avdunta lösningsmedel under mild ström av argon. Avlägsna eventuella kvarvarande spår av vatten genom att tillsätta 1 mL acetonitril för att underlätta azeotropisk samavdunstning. Upprepa detta steg 2x för att säkerställa torrhet.
- När vätskan är synligt avlägsnas, stoppa argon flödet, och ta bort sprutor från locket på injektionsflaskan, och ta bort flaskan från oljebadet.
- Omsuspendera den torkade [18F] fluor i reaktions vätskan i valet.
Anmärkning: i detta fall tillsätts acetonitril (1 mL) för att skapa en stamlösning av mycket reaktiv [18f-] f- (100 − 500 MBq). Den här lösningen kan nu användas för märkning.
2. en-steg SiFA-ligand märkning
Anmärkning: figur 2B visar ett arbetsflöde diagram av denna procedur, som tar ~ 15 min.
- Förutsättning a C-18 patron (tabell över material) genom att skölja den med etanol (10 ml) och destillerat vatten (10 ml).
- Tillsätt [18F-] fluorid stamlösningen till en reaktions flaska som innehåller en Sifa-märkt prekursor (100 μl, 20 − 100 nmol). Låt märknings reaktionen fortsätta i 5 minuter vid rumstemperatur utan att röra lösningen.
Obs: hela stamlösningen kan tillsättas eller en alikvot, beroende på hur mycket aktivitet som önskas för reaktionen. - Rita upp reaktionsblandningen i en 20 mL-spruta som innehåller 0,1 M fosfatbuffert (9 mL) och passera lösningen genom den konditionerade C-18-patronen för att fälla den märkta spårämne.
- Tvätta patronen med destillerat vatten (5 ml), sedan eluera fångade spårämne från C-18 patronen med etanol (300 μl), och späd med steril fosfatbuffert för injektion (3 ml).
- Passera den renade [18F] Sifa-Tracer genom ett sterilt filter.
Anmärkning: för att få ett tydligt husdjur föreställa sig för små djur avbildning, bör den partitionerade patientdosen vara mellan 5 − 8 MBq. För humant bruk ska den partitionerade patientdosen vara mellan 200 − 300 MBq. - Injicera en liten alikvot (~ 4 MBq) av den renade [18F] Sifa-Tracer på ett HPLC-system som är försett med en omvänd fas C-18-kolonn för att bekräfta att den radiokemiska renheten är större än 95%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den förenklade SiFA isotop utbytet kan uppnå en hög grad av radiokemisk inkorporering av [18F] fluorid (60 − 90%) med en minsta mängd syntetisk komplexitet (figur 1). De flesta molekyler kan radiomärlas med [18F] fluorid i ett steg utan att HPLC för rening (figur 2). Radio-HPLC kan användas för kvalitetskontroll ändamål, varvid ultraviolett (UV) absorbans toppen av slutprodukten bör sammanfalla med sin radio topp större än 95% total Peak Area (figur 3). Om radio-HPLC-kromatogram avslöjar en signifikant bildning av UV-aktiva eller radioaktiva föroreningar, får föregångaren inte vara stabil under de milt grundläggande radiomärkta förhållandena. En utspädd lösning av oxalsyra upplöst i ett organiskt lösningsmedel kan tillsättas till [18F] fluorid stamlösning före tillsats av Sifa-föregångare i ett försök att sänka basicitet; men att sänka basicitet för mycket kommer att minska nukleofilicitet av [18F] fluorid Anion. Sålunda, den molar mängd oxalsyra som behövs kommer att behöva experimentellt bestäms i förväg. Alternativt kan den märkta SiFA-ligand renas genom HPLC efter steg 2,3 om bildandet av föroreningar är betydande men hanterbar. Steg 2,4 och därefter kommer fortfarande att behövas efter HPLC-rening för att avlägsna HPLC-vätska från den renade märkta SiFA-ligand.
Om [18F] fluorid inte är lätt att införliva i Sifa-ligand, kan det finnas problem med löslighet och ett annat aprotiskt lösningsmedel i valet kan användas i stället för acetonitril för reaktionen. Protiska lösningsmedel, såsom etanol, har använts framgångsrikt men kan kräva uppvärmning. Övervakning av reaktionen genom radio-tunnskiktskromatografi (radio-TLC) kan snabbt medhjälpare för att identifiera resultatet av eventuella ändringar som gjorts i märkningen protokollet som oinkorporerade [18F] fluorid kommer att följa baslinjen på en standard kiseldioxid TLC plattan.
Om den märkta SiFA-ligand passerar genom C18-kassetten i steg 2,3, vilket indikeras av huvuddelen av den aktivitet som förekommer i den eluerade lösningen och inte i patronen, kan den fas av cylinderampullen som används behöva ändras. Polar SiFA-ligander kan behöva en större C18-patron eller en dual-Phase-patron som innehåller en C18-harts med vissa hydrofila egenskaper.
Märkta SiFA-ligands kan också användas för in vivo applikationer såsom PET. Till exempel användes den märkta lilla molekylen[18F] Sifa-PSMA (figur 4A) för att avbilda en implanterad tumörxenograft i en musmodell (figur 4B). SiFA-Tracer visade gynnsam tumör upptag över 60 min, som kan blockeras av en kompetitiv hämmare (figur 4C). På ett mer imponerande sätt användes den 18f-märkta peptiden [18F] Sifalin-Tate (figur 5A) för att avbilda metastaserande neuroendokrina tumörer hos en cancerpatient via PET (figur 5B) och PET/CT (figur 5C)11.
Figur 1: översikt över SiFA 18F-radiolabeling Workflow. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: typiskt SiFA 18F-radiolabeling protokoll. A) azeotropisk torkning av [18F] fluorid. (B) Sifa märkning reaktion och rening via solid-fas extraktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Final radio-HPLC kromatogram efter fast fas utvinning rening av [18F] Sifa-PSMA, tas för kvalitetskontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: applicering av märkta SiFA-ligander. A) strukturen på [18F] Sifa-PSMA radiotracer. (B) rekonstruerad bild av en mus redovisade en LNCaP xenograft tumör över vänster axel, 60 min post injektion (p.i.) med [18F] Sifa-PSMA. C) tids aktivitets kurvor för [18F] Sifa-PSMA-upptag i tumör-och muskelvävnad över 60 min, med eller utan föregående administrering av 300 μg dcfpyl som blockerande medel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: applicering av märkta SiFA-ligander. A) strukturen hos [18F] Sifa-Tate radiotracer. Brekonstruerad PET-bild av en human cancerpatient med metastaserande endokrina tumörer med [18F] Sifa-Tate. C) PET/CT-bilder av samma patient i tvärgående och sagittal plan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SiFA märkning kemi representerar en av de första 18F-märkning metoder anställa en utomordentligt effektiv isotop utbyte reaktion som kan utföras vid rumstemperatur. En typisk radiokemisk reaktion bygger på bildandet av en kol-fluor bindning genom reaktion av [18F] fluor med en fluor-reaktiv funktion genom en eliminering eller substitutions väg. Dessa reaktions förhållanden är ofta hårda, utförs vid extrema pH eller hög temperatur, och är lastade med biprodukter eller reaktions deltagare som måste avlägsnas med mödosamma och tidskrävande tekniker som HPLC. Med SiFA-märkning teknik, märkning föregångare och 18F-märkta förening är kemiskt identiska. Dessutom, inga sidoprodukter observeras vanligtvis eftersom reaktionen fortsätter under mycket milda förhållanden. Dessa funktioner gör det möjligt att märka mer komplicerade molekyler (dvs. proteiner, fria radikaler generatorer, metall-kelater, fluoroforer, bioluminescerande prekursorer) som normalt sönderdelas eller epimerize under mer reaktiva tillstånd eller förhöjda temperaturer. Dessutom kan 18F-märkta Sifa-innehållande föreningar renas snabbt med hjälp av enkla enfas extraktionsmetoder.
Denna märkning metodik utnyttjar "4 Drop metod", varvid endast de första 4 droppar av den grundläggande eluering lösningen används när elminerande fångade [18F] fluorid bort av en QMA patron. Denna ändring gjordes för att minska mängden bas i [18f] fluorid Stock lösning eftersom det skulle försämra Sifa-delen om [18f] fluorid beståndet innehöll hela basen från elutionslösningen. Tidigare, oxalsyra lades till [18F] fluorid Stock lösning för att minska basicitet, eller en liten alikvot av beståndet användes i stället för hela lösningen, som var slösaktig. 4 Drop-metoden representerar den senaste iterationen av SiFA-etiketteringsprotokollet.
Eftersom föregångaren molekylen och den märkta slutprodukten är kemiskt identiska, kan de inte separeras från varandra under rening och molar aktiviteten av den slutliga injicerbara är således helt beroende av den mängd föregångare som används för isotop utbyte. Att ha för hög av en bråkdel av omärkta föregångare i den slutliga lösningen kommer att minska möjligheten för den märkta SiFA-ligand att binda sitt avsedda molekylära mål på grund av konkurrens med omärkbara föregångare. Således är molar aktiviteten helt beroende av mängden föregångare som används för märkning. Typiskt är 20 − 100 nmol av föregångare krävs för reproducerbara märkning reaktioner, och så lite som 5 nmol av föregångare har märkts framgångsrikt för att uppnå molar verksamhet 80 GBq/μmol och högre.
Små molekyler och peptider härledda med SiFA-byggblocket (t. ex. SiFA-octreotate) kan märkas med [18F] fluorid i ett steg; men SiFA märkning av proteiner kräver ett två-stegs protokoll. En liten, mycket reaktiv SiFA-protetisk grupp (t. ex. [18F] sifb) måste förberedas och reageras med det givna proteinet, och det märkta proteinet skall sedan RENAS med HPLC.
Den SiFA-märkning metodik lämpar sig väl att radiofarmaceutical kit synteser som HPLC rening och omfattande reaktion manipulation är normalt inte behövs. Enkla "Shake and Bake"-kit med enstaka patientdoskvantiteter av en SiFA-ligand kan enkelt hanteras av radiofarmacy-tekniker som kräver en mycket mindre inlärningskurva och tid/arbetskostnad än med en automatiserad syntes enhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga erkännanden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
- Wahl, R. L., Buchanan, J. W. Principles and practice of positron emission tomography. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2002).
- Wängler, C., Schirrmacher, R., Bartenstein, P., Wängler, C. Click-chemistry reactions in radiopharmaceutical chemistry: Fast & easy introduction of radiolabels into biomolecules for in vivo imaging. Current Medical Chemistry. 17, 1092-1116 (2010).
- Schirrmacher, R., et al. 18F-labeling of peptides by means of an organosilicon-based fluoride acceptor. Angewandte Chemie International Edition. 45, 6047-6050 (2006).
- Kostikov, A. P., et al. Oxalic acid supported Si-18F-radiofluorination: One-step radiosynthesis of N-succinimidyl 3-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzoate ([18F]SiFB) for protein labeling. Bioconjugate Chemistry. 23 (1), 106-114 (2012).
- Cacace, F., Speranza, M., Wolf, A. P., Macgregor, R. R. Nucleophilic aromatic substitution; kinetics of fluorine-18 substitution reactions in polyfluorobenzenes. Isotopic exchange between 18F- and polyfluorobenzenes in dimethylsulfoxide. A kinetic study. Journal of Fluorine Chemistry. 21, 145-158 (1982).
- Schirrmacher, E., et al. Synthesis of p-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzaldehyde ([18F]SiFA-A) with high specific activity by isotopic exchange: A convenient labeling synthon for the 18F-labeling of N-amino-oxy derivatized peptides. Bioconjugate Chemistry. 18, 2085-2089 (2007).
- Kostikov, A., et al. N-(4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzyl)-2-hydroxy-N,N-dimethylethylammonium bromide ([18F]SiFAN+Br-): A novel lead compound for the development of hydrophilic SiFA-based prosthetic groups for 18F-labeling. Journal of Fluorine Chemistry. 132, 27-34 (2011).
- Wängler, B., et al. Kit-like 18F-labeling of proteins: Synthesis of 4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzenethiol (Si[18F]FA-SH) labeled rat serum albumin for blood pool imaging with PET. Bioconjugate Chemistry. 20, 317-321 (2009).
- Iovkova, L., et al. para-Functionalized aryl-di-tert-butylfluorosilanes as potential labeling synthons for 18F radiopharmaceuticals. Chemistry. 15, 2140-2147 (2009).
- Wängler, C., et al. One-step 18F-labeling of carbohydrate-conjugated octreotate-derivatives containing a silicon-fluoride-acceptor (SiFA): In vitro and in vivo evaluation as tumor imaging agents for positron emission tomography (PET). Bioconjugate Chemistry. 21, 2289-2296 (2010).
- Ilhan, H., et al. First-in-human 18F-SiFAlin-TATE PET/CT for NET imaging and theranostics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46, 2400-2401 (2019).
