Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att testa effekten av riktade terapier som valts ut baserat på genomisk makeup av en tumör. Protokollet beskriver identifiering och validering av strukturella DNA-omorganiseringar, engraftment av patienternas tumörer i möss och testa svar på motsvarande läkemedel.
Abstract
Vi presenterar här en integrativ metod för att testa effekten av riktade terapier som kombinerar nästa generations sekvensering technolo-gies, terapeutiska mål analyser och läkemedelsrespons övervakning med hjälp av patienten härledda xenografts (PDX). Denna strategi validerades med hjälp av äggstockscancer tumörer som ett exempel. Mate-pair nästa generations sekvensering (MPseq) protokollet användes för att identifiera strukturella förändringar och följt av analys av potentiellt targetable ändringar. Mänskliga tumörer som odlas i immunkomprometterade möss behandlades med läkemedel som valts ut baserat på de genomiska analyserna. Resultaten visade ett bra samband mellan de förväntade och de observerade svaren i PDX-modellen. Den presenterade metoden kan användas för att testa effekten av kombinationsbehandlingar och stöd personlig behandling för patienter med återkommande cancer, särskilt i de fall då standardbehandling misslyckas och det finns ett behov av att använda läkemedel off label.
Introduction
Patient-derived xenografts (PDXs), som genereras från implantation av patienten tumör bitar i immunodeficient möss, har dykt upp som en kraftfull preklinisk modell för att hjälpa personlig anti-cancer vård. PDX-modeller har framgångsrikt utvecklats för en mängd olika mänskliga maligniteter. Dessa inkluderar bröstcancer och äggstockscancer, malignt melanom, kolorektal cancer, bukspottskörteln adenokarcinom, och icke-småcellig lungcancer1,2,3,,4,5. Tumörvävnad kan implanteras ortopotopically eller heterotopically. Den förra, anses mer exakt men tekniskt svårt, innebär transplantation direkt i organ tumör ursprung. Dessa typer av modeller tros exakt efterlikna histologi av den ursprungliga tumören på grund av den "naturliga" mikromiljö för tumören6,7. Till exempel, orthotopic transplantation i bursa av musen äggstock resulterade i tumör spridning i bukhålan och produktion av ascites, typiska för äggstockscancer8. På samma sätt påverkade injektion av brösttumörer i bröstkorgen i stället för buken bröstkörteln PDX framgång och beteende9. Men orthotopic modeller kräver sofistikerade bildsystem för att övervaka tumörtillväxt. Heterotopic implantation av solid tumör utförs vanligtvis genom implantering vävnad i subkutan flanken av en mus som möjliggör enklare övervakning av tumörtillväxt och är billigare och tidskrävande7. Tumörer som odlas subkutant sällan metastaserar dock till skillnad från vad som observerats vid tandpetitisk implantation10.
Framgången för engraftment har visat sig variera och i hög grad beror på tumörtypen. Mer aggressiva tumörer och vävnadsprover som innehåller en högre procent av tumörceller rapporterades ha bättre framgångpriser 12,13. Överensstämmer med detta, tumörer som härrör från ögonbevarande platser visade sig engraft vid frekvenser på 50-80%, medan de från primära platser engraft vid frekvenser så lågt som 14%12. Däremot vävnad som innehåller nekrotiska celler och färre livskraftiga tumörceller engraft dåligt. Tumörtillväxt kan också främjas genom tillsats av källarmembranmatrisproteiner i vävnadsblandningen vid tidpunkten för injektionen i möss14 utan att kompromissa med egenskaperna hos den ursprungliga tumören. Storleken och antalet vävnadsbitar avsedda för implantation befanns också påverka framgången för engraftment. Större tumör ta-priser rapporterades för implantation i sub-renal kapseln jämfört med subkutan implantation på grund av förmågan hos sub-renal kapseln för att upprätthålla den ursprungliga tumör stroma och ge värden stromal celler samt15.
De flesta studier använder NOD/SCID immunbrist möss, som saknar naturliga mördarceller16 och har visat sig öka tumör engraftment, tillväxt och metastasering jämfört med andra stammar14. Ytterligare övervakning krävs dock eftersom de kan utveckla thymic lymfom så tidigt som 3-4 månaders ålder13. Vid äggstockstumörtransplantationer som odlas i SCID-möss hämmades utväxten av B-celler framgångsrikt av rituximab, vilket förhindrade utvecklingen av lymfom men utan att påverka instämningen av äggstockstumörer17.
På senare tid har NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) möss, bär en null mutation i genen kodning interleukin 2 receptorn gamma kedjan18, blev en ofta använd stam för generering av PDX modeller. Tumörer från etablerade PDX modeller passage till framtida generationer av möss rapporteras att behålla histologiska och molekylära egenskaper för 3 till 6 generationer19,20. Många studier har visat att behandlingsresultaten i PDX-modeller efterliknar behandlingsresultaten hos deras motsvarande patienter2,,3,,4,,21,22,23. Svarsfrekvensen på kemoterapi i PDX-modeller för icke-små lungcancer och kolorektal carcinom liknade den i kliniska prövningar för samma läkemedel24,25. Studier som utförts i PDX-modeller, utvecklade för patienter som rekryterats i kliniska prövningar, visade på svar på testade läkemedel liknande dem som observerats kliniskt hos motsvarande patienter2,,3,4.
Genomiska analyser med hög genomströmning av en patienttumör tillsammans med PDX-modeller ger ett kraftfullt verktyg för att studera korrelationer mellan specifika genomiska förändringar och ett terapeutiskt svar. Dessa har beskrivits i några publikationer26,27. Till exempel, terapeutiska svar på EGFR-hämmare cetuximab i en uppsättning kolorektal PDX modeller som bär EGFR förstärkning, parallella kliniska svar på cetuximab hos patienter28.
Det finns några utmaningar i samband med utveckling och tillämpning av PDX-modeller. Bland dessa är tumör heterogenitet29,30 som kan äventyra noggrannheten i behandling svar tolkning som en enda cell klon med högre proliferative kapacitet inom en PDX kan växa ur de andra31, vilket resulterar i en förlust av heterogenitet. Dessutom, när enda tumör tarmbiopsier används för att utveckla PDX, kan några av cellpopulationerna missas och kommer inte att vara representerade i det slutliga transplantatet. Flera prover från samma tumör rekommenderas för implantation för att lösa detta problem. Även om PDX tumörer tenderar att innehålla alla celltyper av den ursprungliga givaren tumör, dessa celler gradvis ersättas av de av murint ursprung3. Samspelet mellan murine stroma och mänskliga tumörceller i PDX-modeller är inte väl förstått. Ändå visades stromal celler att rekapitulera tumör mikromiljö33.
Trots dessa begränsningar är PDX-modeller fortfarande bland de mest värdefulla verktygen för translationell forskning samt personlig medicin för att välja patientterapier. Större tillämpningar av PDXs inkluderar biomarkör upptäckt och drogtester. PDX-modeller används också framgångsrikt för att studera läkemedelsresistens mekanismer och identifiera strategier för att övervinna läkemedelsresistens34,35. Den metod som beskrivs i det aktuella manuskriptet gör det möjligt för forskaren att identifiera potentiella terapeutiska mål i mänskliga tumörer och att bedöma effekten av motsvarande läkemedel in vivo, hos möss som hyser engrafted tumörer som ursprungligen genomiskt karakteriserades. Protokollet använder äggstockstumörer engrafted intraperitoneally men är tillämplig på alla typer av tumör tillräckligt aggressiva för att växa i möss2,3,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Färska vävnader från samtyckande patienter med äggstockscancer samlades in vid tidpunkten för debulking kirurgi enligt ett protokoll som godkänts av Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Alla djurförsök och behandlingar som används i detta protokoll godkändes av Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och följde riktlinjerna för djurvård.
1. Parval sekvensering och analyser
OBS: Antingen färsk eller flash fryst vävnad måste användas för parpar (PARSeq) sekvensering. Paraffin inbäddat material är inte lämpligt eftersom det innehåller fragmenterad DNA.
- Isolera DNA från frusen tumörvävnad. Använd originalprov på människa som erhållits från kirurgiskt material eller biopsi36.
- Använd 1000 ng AV DNA för att göra parlamentsledamötereq bibliotek och sekvens som 2 prover per körfält på nästa generation sequencer (se Tabell över material)36.
- Analysera data med hjälp av en uppsättning algoritmer för att upptäcka stora kromosomal avvikelser (borttagningar, infogningar, förstärkningar, inversioner och flyttningar) enligt beskrivningen tidigare36,37.
2. Urval av terapeutiska mål
- Använd verktyget Panda med öppen åtkomst (Pathway and Annoteation) eller ett liknande verktyg för att identifiera målbara ändringar (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
- Gör en lista över gener som identifieras av MSeq som ändras, som en enkel flik-avgränsad fil, med hjälp av standard accepterade gensymboler.
OBS: Det inkluderade exemplet har analys av förstärkningar och vinster. - Lägg till ett "#"-tecken på huvudraden i listan för att säkerställa att tabellhuvudet överförs till programvarans vyn för utbildningsavsnittsnivå.
- Ladda upp filen genom att klicka på navigeringsfliken Ladda upp anteckningsuppsättning.
- Tilldela en enda ikon från menyn för att representera underliggande data genom att klicka på valfri ikon och sedan klicka på fliken Slutför.
- När anteckningsfilerna har överförts identifierar du en kolumn som visar antalet kommenterade gener per vägavsnitt. Detta är den sista kolumnen till höger.
- Använd Pathway Filter längst upp till vänster i huvudfönstret för att visa vägar som innehåller gener av intresse.
- Identifiera vägar som har fler kommenterade gener än vad som förväntas av en slump. Använd funktionen som finns under fliken Anrikning.
- Välj en databas för att visa potentiellt druggable gener från Preset Annoteation genom att kontrollera en lämplig ikon till vänster om huvudfönstret (t.ex. DGIdb, PharmGKB).
- Välj väg för visualisering genom att klicka på dess namn som visas på sidan Pathway Viewer.
Ikoner som representerar varje anteckningsuppsättning visas bredvid den associerade genen. Klicka på den gen av intresse för att öppna motsvarande GeneCards webbsida. - Välj de vägar som visade kommenterade gener av intresse (dvs. ändras i en viss tumör) och "träffar" för potentiella läkemedel för vidare analys.
- Gör en lista över gener som identifieras av MSeq som ändras, som en enkel flik-avgränsad fil, med hjälp av standard accepterade gensymboler.
- Använd en databas som innehåller läkemedel som godkänts för klinisk tillämpning (https://clinicaltrials.gov/) för att korsreferera de identifierade målen.
- Prioritera riktade ändringar för ytterligare testning i PDX-modeller genom att utföra en litteraturöversikt (t.ex.
3. Validering av genomiska omorganiseringar genom PCR- och Sangersekvensering
- Designprimer med sekvensering läser från MPseq data.
- Välj en intressepunkt för valideringen (dvs. potentiellt terapeutiskt mål) baserat på riksdagsanalyser.
- Designprimer directionally sådan att ampliconen innehåller föreningspunkten. Design 2 primers på varje sida av korsningen, för totalt 4, för att öka chanserna att förstärka korsningen.
OBS: Namn primers enligt fallet och kromosom plats. - Använd standard PCR parametrar för primer design och en programvara val. Välj smälttemperatur (60-62 °C) och GC-halten (40-60%). Se till att primersekvensen inte bildar grundfärger, palindromer eller hårnålsöglor.
- Bekräfta att primersekvensen saknar homologi till andra delar av det mänskliga genomet genom att kontrollera den med BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
- Kör en PCR för att förstärka korsningen av intresse.
- Späd primers med vatten till 10 mM och kombinera 10 ml av varje primer så att varje framåt primer paras ihop med varje omvänd primer i en primer mix.
Obs! Table 1 - Etikett 0,2 ml bandrör som: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 och T4 där C=kontrollerar humant genomiskt DNA (kommersiellt), T=Tumör-DNA, isolerat från patient- eller PDX-tumör, och numret indikerar primerblandningen.
- Tillsätt 1 ml av varje primerblandning i dess märkta rör.
- Förbered Taq mastermix genom att kombinera reagenser som anges i tabell 2och lämna enzymet i frysen tills det behövs och lägga till det i blandningen i slutet.
- Gör 2 master mixar, en för varje mall DNA, kontrollera mänskligt DNA och tumör DNA. Tillsätt 24 ml av varje Taq master mix till dess respektive bandrör. Den totala reaktionsvolymen är 25 ml. Vortex mycket kort och snurra sedan remsaröret ner.
- Kör en PCR i en thermocycler. Använd de parametrar som visas i tabell 3. Justera glödgningstemperaturen så att den är minst 1 °C kallare än grundfärgernas smälttemperatur.
- Förvara den färdiga PCR-produkten vid -20 °C (lång sikt) eller kyld vid 4 °C (kortvarig) tills det behövs.
- Utför elektrofores vid 1-5 V/cm för att visualisera PCR-produkten med en 1,5% agarosgel. Lämna 2 ml alikvot av produkten som ska användas för Sanger sekvensering.
- Späd primers med vatten till 10 mM och kombinera 10 ml av varje primer så att varje framåt primer paras ihop med varje omvänd primer i en primer mix.
- Utför Sanger sekvensering för att bekräfta korsningen och identifiera den exakta brytpunkten38.
- Använd PCR-produkten om PCR genererade en enda produkt (band). Alternativt, skär bandet ur gel, rena och lämna för Sanger sekvensering tillsammans med primer som används för förstärkning.
OBS: De tumörer för vilka genomiska analyser utfördes sedan används för implantation hos möss.
- Använd PCR-produkten om PCR genererade en enda produkt (band). Alternativt, skär bandet ur gel, rena och lämna för Sanger sekvensering tillsammans med primer som används för förstärkning.
4. Tumör engraftment och underhåll
- Ställ in preparat för att engraft tumörer i PDX mus modeller. Välj för engraftment tumörer för vilka genomiska analyser kommer att eller har utförts.
- Se till att en stödjande infrastruktur finns på plats när utvecklingen av alla PDX-modeller inleds, inklusive särskilda laboratorie- och djuranläggningar, kompetent teknisk personal och detaljerade standardrutiner.
- Se till att snabb transport och bearbetning av prover som hastighet är avgörande för cellens livskraft och framgångsrik engraftment.
- Använd en steril miljö för att minska bakteriell och svampkontaminering för bearbetning och engrafting prover.
- Hantera mänskliga exemplar med försiktighet, i enlighet med institutionella riktlinjer för potentiellt biohazardous material, eftersom de kan hysa blodburna patogener.
- Förbered vävnaden (0,5-0,7 cm3 i storlek) för engraftment genom att sätta det kirurgiska provet i ett förkylt 50 ml-rör med 20 ml vävnadsodlingsmedia.
OBS: Tumörvävnaden kan vara frisk eller återvinnas från tidigare kryoreserverat material5. - Bekräfta tumörinnehållet i provet genom att konsultera en patolog.
- Placera tumörvävnaden i en maträtt som innehåller 10-15 ml kall PBS, eller vävnadsodlingsmedia som RPMI 1640 eller DMEM som innehåller antibiotika (1% penicillin och streptomycin).
- Identifiera och isolera livskraftigt tumörmaterial från intilliggande normal och nekrotisk vävnad med hjälp av en patolog. Använd sterila pincett och skalpell för att avlägsna nekrotiskt material som påpekats av en patolog.
OBS: Tumören kan implanteras antingen intraperitoneally eller subcutaneously in i mössen. Följ steg 4.2 för att utföra en intraperitoneal implantation eller hoppa till steg 4.3 för att utföra en subkutan engraftment. I denna studie testades riktade terapier som valts ut baserat på genomiska analyser i en serie PDX-modeller för serös äggstockscancer av hög grad med intraperitoneal implantation.
- Förbered vävnaden för intraperitoneal (IP) implantation malning vävnaden med sterila pincetter och en skalpell på is för att göra bitar ca 1-1,5 mm3 i storlek och blanda med kall kultur medium. Injicera 0,3–0,5 ml tumörslamry med en 16-17 gauge nål.
OBS: Alla kirurgiska ingrepp utförs med hjälp av aseptiska tekniker. Sterila handskar, sterila instrument, förnödenheter och implanterade material användes för att minska risken för infektion.- Blanda bitarna 1:1 med iskall odlingsmedium och injicera 100 ml intraperitoneally i minst tre scid-möss från kvinnor.
- Skär tumörvävnaden för subkutan engraftment med sterila pincett, skalpell eller kirurgisk sax i små fragment, ungefär 2 x 2 x 2 mm i storlek, och överför de fragmenterade vävnaderna till en förkyld petriskål på is.
- Tillsätt den kalla källaren membran matrisen i skålen med fragmenterad vävnad (ca 200 ml per 10 bitar av vävnad), blanda väl, och låt vävnadfragment suga i den kalla källaren membran matris i 10 min.
- Söva 5 kvinnliga NOD/SCID möss för att förbereda dem för engraftment.
- Injicera varje mus intraperitoneally med ketamin (150 mg/kg) och xylazine (10 mg/kg) kombination.
- Bekräfta att musen är ordentligt sövd genom att nypa svansspetsen med atraumatiska pincett.
- Ta försiktigt helt sövd mus från kammaren och sätta på musen en näsa kon som har ingång från spridare och utgång från rökgas rensningssystem.
- Sätt vet salva på musens ögon för att förhindra torrhet under anestesi. Förbered det område där operationen kommer att utföras. Använd aseptisk teknik för att utföra operationen.
- Se till att ytan på vilken operationen kommer att ta är icke-porös, förseglad och desinficeras före operationen.
- Börja operation med sterila (genom autoklav, gas eller kemisk sterilisering) instrument.
- Använd handskar för att hantera instrument och upprätthålla steriliteten i instrumentet tips under hela förfarandet genom att doppa dem i etanol mellan kirurgi steg.
- Sterilisera operationsområdet genom att applicera 3 alternerande scrubs av jod och alkohol. Använd steril kirurgisk sax och pincett för att göra en 5-10 mm vertikal hud snitt på båda flankerna av en mus.
- Sätt in raka pincett försiktigt i det subkutana utrymmet för att skapa en ficka tillräckligt stor för att ett tumörfragment ska placeras under fettdynan.
- Använd de sterila raka pincetten för att infoga tumörfragment i tidigare förberedd ficka i vart och ett av 5 möss.
OBS: Placera 3-4 bitar av tumörvävnad i en ficka. - Stäng hudsnitt med hjälp av vävnadslim.
- Intraperitoneally injicera varje mus med 100 ml Rituximab efter implantation för att hämma lymfocyter spridning.
- Placera musen i en bur under en värmelampa i ca 20 min tills den återhämtat sig från anestesi. Övervaka musen vitala tecken och se till att dess tillräcklig hydrering.
- Returnera musen till sällskap av andra möss efter det återhämtat sig från anestesi och började få mat och vatten. Ge postoperativ vård och övervakning enligt institutionella riktlinjer. Kontrollera om det finns tecken på smärta och ångest dagligen i 3 dagar i följd efter operationen.
OBS: Kriterier för smärta eller ångest inkluderar nekros eller sår, viktminskning / kroppstillstånd scoring, beteendemässiga tecken såsom aktivitetsnivå, motorisk funktion och hållning. - Kontrollera rutinmässigt mössen för tumörbildning varannan vecka tills tumörerna når storleken 0,5 cm i diameter mätt med ett ok.
- Bedöm hälsopoängen för varje mus som härleds från utseende, beteende och kroppstillstånd39. Använd betyg på ≤6 som kriterier för döende möss som ska offras genom inandning av koldioxid.
5. Testa svar på genomiskt identifierade mål i PDX-modeller
- Starta de valda riktade behandlingarna när tumörerna är påtagliga och nå 0,5 cm3 mätt med en ultraljudsundersökning.
- Innan du utför en ultraljudsundersökning av buken ta bort musen buken päls och tillämpa sterila gelé smörjmedel.
- Använd en ultraljudsmaskin med en givare för att få bilder med tumören placerad i tvärsnitt. Gör 3 mätningar per session för varje djur och genomsnitt värdet för en mer exakt bedömning av tumörstorlek.
- Analysera bilderna med hjälp av tillgänglig programvara40.
- Administrera kemoterapi bestående av en blandning av karboplatin vid 51 mg/kg och paklitaxel vid 15 mg/kg intraperitoneally (IP) en gång i veckan under en total behandlingstid på 4-6 veckor. Se till att den totala injektionsvolymen inte överstiger 0,2 ml.
- Gör en MK-220641-lagerlösning i 30% cyklodextrin (t.ex. Captisol) och leverera via oral sondmatning vid 120 mg/kg dagligen i 4 på varandra följande veckor.
- Förbered musen för oral sondmatning genom att hålla den genom att nypa huden på ryggen och fästa tillbaka den, så att huvudet och lemmarna på musen är immobiliserade.
- Sätt in sonden i gavaget på baksidan av musens hals tills sonden når matstrupen. Se till att sonden inte sätts in för långt, eftersom musens lungor kan perforera och orsaka dödsfall.
- Gör en MK-866942-lagerlösning i etanol vid 25 mg/ml. Späd den i ett fordon som innehåller 5,2 % Tween 80, 5,2 % PEG400 i sterilt vatten för IP-injektioner vid 10 mg/kg i 5 dagar varannan vecka, med en total behandlingstid på 4 veckor.
OBS: Volymen som injiceras i möss ska vara 50-120 ml, beroende på djurets vikt. - Använd 7-8 möss per behandlingsgrupp för att ha tillräckligt med statistisk kraft för att upptäcka skillnader43,,44.
- Bedöm mössens kroppsvikt och allmänna tillstånd i behandlingen dagligen. Undanhålla läkemedel om ett djurs vikt sjunker 20% eller mer från sin ursprungliga vikt.
- Bedöma tumörstorleken varje vecka med hjälp av ultraljudsskanning. Se till att den person som utför övervakningen av tumörtillväxten är blind för behandlingen för att säkerställa opartisk poängsättning av svar.
MINDRE laboratorier kan anställa 2 olika personer för att administrera behandling och ultraljudsövervakning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vävnad från resected äggstockstumörer vid tidpunkten för debulking operationer samlades in i enlighet med IRB vägledning och används för 1) genomisk karakterisering och 2) engraftment i immunkomprometterade möss (figur 1). Mate-pair sekvensering protokoll36,37 användes för att identifiera strukturella förändringar i DNA inklusive förluster, vinster och förstärkningar. Ett representativt genomområde som illustrerar ett landskap av genomiska förändringar i en tumör (betecknad som OC101) visas i figur 2. Typiska för hög kvalitet serösa subtyp tumörer, flera vinster (blå linjer) och borttagningar (röda linjer) hittades, vilket tyder på höga nivåer av genomisk instabilitet, samt kromosomal förluster och vinster, vägledande för aneuploidy, observerades. På en genomsnittlig 300-700 förändringar totalt identifieras i hög kvalitet serösa subtyp tumörer45. Senare analyser visade några DNA-ändringar som potentiellt var targetable med kliniskt relevanta läkemedel. Den högst rankade förändringen för terapeutisk intervention i OC101 tumör var en förstärkning vid kromosom 17 med ERBB2 (figur 2 och figur 3A). ERBB2 är en gen som kodar för HER2-receptor som är känd vid dimerisering med EGFR, HER3 eller HER4 för att aktivera RAS/ERK och PI3K/AKT signalvägar och främja celltillväxt, cellmigration och invasion. HER2-hämmare (t.ex. monoklonala antikroppar pertuzumab och trastuzumab) är effektiva vid behandling av bröstcancerpatienter när tumörer överuttrycker HER2-proteinet. Anti-HER2 terapi för äggstockscancer, dock, är inte FDA godkänt.
Jämförelse av den genomiska profilen för givaren patienters tumör (figur 1) till en motsvarande PDX modell (inte visas) visade en slående likhet, överensstämmer med alla tidigare studier rapporterar molekylära närhet av ursprungliga tumörer till deras PDX derivat.
För att validera MPseq resultat på DNA-nivå, flera uppsättningar av specifika primers utformades för kanterna av förstärkt region som innehåller genen ERBB2, och PCR utfördes med hjälp av DNA isolerade från den ursprungliga tumören samt från en tumör som förökas i flera generationer i möss. En representativ gelbild av förstärkta produkter med två olika uppsättningar primers visas i figur 3B. Inget band upptäcktes när normala poolade genomiska DNA (betecknas som C), som inte innehöll förstärkning av ERBB locus, förstärktes. Rening av produkterna från gel och Sanger sekvensering (visas inte) ytterligare bekräftade den förändring som förutspås av MPseq. Ytterligare validering genomfördes genom att undersöka uttrycket av HER2 protein i motsvarande PDX tumör med hjälp av immunoblotting. Analysen visade en hög nivå av HER2 protein (resultatet visas inte), överensstämmer med den observerade förstärkning av genen ERBB2.
I DNA av en annan äggstockscancer tumör (betecknas T14) många regionala vinster observerades. Bland dessa fanns AKT2- och RICTOR-gener (figur 3C). Båda var av stort intresse ur ett terapeutiskt perspektiv som hämmare av AKT2 och mTOR, som RICTOR associerar med, finns tillgängliga och för närvarande i kliniska prövningar. Eftersom det inte fanns någon mate par läser spänner över närheten av antingen gen, enkel PCR validering av vinsten som detekterades av MPseq var inte möjligt. Vi testade därför uttrycksnivån för motsvarande proteiner genom immunblotting. Höga nivåer av AKT och RICTOR observerades (figur 3D) tyder på att behandling med riktade läkemedel är berättigad.
För att testa känsligheten hos denna tumör till hämmare av AKT och mTOR, PDX möss med intraperitoneally implanteras T14 tumör utvidgades och randomiserades för att få endast kemoterapi (carboplatin/paclitaxel) eller en kombination av kemoterapi med pan-AKT-hämmare MK-220641 eller mTOR-hämmare MK-866942. Kemoterapi gavs till möss i kombinationsarmen i 2 veckor före tillägg av den riktade behandlingen (figur 4). Ultraljud mätningar togs varje vecka för att övervaka tumör regression/tillväxt.
Varje behandlingsarm innehöll inte mindre än 7 möss. Detta antal var tillräckligt för att observera skillnader i svar mellan grupperna samtidigt som kostnaderna för studien låg betydligt lägre. Färre möss (tre till fyra) kan användas i kontroll obehandlad grupp, eftersom individuella variationer i tumörtillväxt är försumbara och tillväxten normaliseras till en tumörstorlek vid vilken behandling i andra armar börjar.
Ingen skillnad observerades mellan cellgiftsbehandlade och obehandlade grupper under de första 3 veckorna av observationen (visas inte). En signifikant minskning av tumörbördan (58% median) observerades i den kemoterapi som behandlades i slutet av vecka 6. En extra fördel jämfört med kemoterapi ensam observerades i grupper som fick en kombination av kemoterapi med riktade terapier. Skillnaden blev uppenbar vid vecka 4 respektive 3 för MK-8669 (figur 4A) respektive MK-2206 (figur 4B).
Djur avlivades och tumörvävnad samlades in för molekylära analyser av behandlingssvar i slutet av behandlingsstudien vid vecka 7. För detta ändamål fastställdes mängden av den totala och fosforylerade S6-kinasen (figur 5A,B),AKT och mTOR (figur 5C,D) med hjälp av immunblotting. Ribosomal protein S6 kinas är en nedströms budbärare av AKT-mTOR utbildningsavsnitt, känd för att vara upp-regleras och fosforyleras vid stimulering av AKT-mTOR axeln av tillväxtfaktorer för att främja cellens överlevnad och tillväxt. Jämförelse av nivåerna av dessa proteiner i obehandlade eller behandlade med kemoterapi PDX tumörer till möss som fick AKT eller mTOR-hämmare visade en markant minskning av de två sistnämnda (figur 5), vilket indikerar effektiviteten av den riktade behandlingen på molekylär nivå. Justeringar av behandlingsregementet, när det gäller tillämpningstid för kombinerade läkemedel och terapi varaktighet, bör göras och testas för att uppnå bättre svar.
| Primer Namn | Sekvens | Primer Blandning | Primers kombinerade | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 och R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGACAGTAACACCTAGTAGTTGATTCTGC | 2 | OC101 F1 och R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACGGGAACGTGCTACCTTG | 3 | OC101 F2 och R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCCTAGCAGTTCTATCCCCACTG | 4 | OC101 F2 och R2 | ||
Tabell 1: Grundfärger som används för validering av OC101chromosome 17-ändringen.
| Reagens | Mängd att lägga till för 1 reaktion (μL) | Mängd att lägga till för 4 reaktioner (μL). [Multiplicera med 4,3 för att göra tillräckligt för varje primer mix (4)] |
| Nukleasfritt vatten | 20.45 | 89.94 |
| 10x buffert (Easy A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTPs 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| Mall-DNA (koncentration >10 ng/μL) | 0.3 | 1.29 |
| Taq Polymeras | 0.25 | 1.08 |
Tabell 2: PCR-inställning för att validera en korsning.
| Temp (C) | Tid | |
| 94 | 5 min | |
| 94 | 40 s | 35 cykler |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2 min | |
| 72 | 5 min | |
| 4 | Hålla |
Tabell 3: Cykelförhållanden för PCR för att validera en korsning.
Figur 1: Schematisk återgivning av strategin för genomiskt guidad terapi testning med PDX modeller för serös äggstockscancer carcinom. H&E färgning av äggstockscancer tumör visas (överst). Skala bar =100 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Genomisk karakterisering av äggstockstumörer med hjälp av MPseq. Genomtomdiagram som visar landskapet av strukturella förändringar och kopiera nummerförändringar som detekteras av parlamentsledamöter. X-axeln spänner över kromosomens längd med det kromosompositionsnummer som visas. Varje kromosom anges på höger och vänster Y-axel. Höjden på de horisontella spåren för varje kromosom anger antalet läsningar som detekteras för 30k basparfönster. DNA-kopieringsnummer anges med färg, med grått som representerar det normala 2N kopieringstillståndet, rött som motsvarar borttagningar och blå-till-vinster. Ansluta svarta linjer motsvarar kromosomal rearrangements. Ändringar vid ERBB2 locus avbildas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Urval av målbara ändringar och validering av dem. (A) Ett närbildssegment av genomområdet som visas i fig.1 som illustrerar en förstärkning av genen ERBB2 på kromosom 17 (i blått). Kromosomnummer är som anges. (B)Valideringsanalys av brytpunkter vid ERBB2 locus som identifierats av MPseq med PCR förstärkning. C är en poolad genomisk DNA-kontroll, OC101 är DNA från patienttumör, M är en DNA-stege. (C) En närbild av segment av arvsmassan tomten för en annan äggstockscancer tumör visar vinster (anges av blå linje) på AKT locus (överst) och på RICTOR genen (botten). Kromosomer är som anges. (D) Valideringsanalys av uttryck för proteiner av AKT/mTOR väg genom immunblotting med hjälp av tumörvävnad från PDX (T14), genomiska förändringar för vilka avbildas i C. 30 mg totalt protein och specifika antikroppar mot AKT, RICTOR, p-mTOR användes. MAPK fungerade som en lastningskontroll. Pos con är en oberoende tumör som används som en positiv kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Jämförelsen av svar på kemoterapi ensam och i kombination med riktad terapi i tumör hysa vinster på AKT2 och RICTOR gener med motsvarande läkemedel. Behandling svar på en kombination av kemoterapi och anti-mTOR läkemedel MK-8669(A) eller hämmare av pan-AKT MK2206 (B) kontra kemoterapi ensam. Administreringstiden för varje behandling och varaktigheten visas av pilarna. Volymerna uttrycks som procent av den initiala volymen i början av behandlingen som medelvärdet +/- SD. Chemo är kemoterapi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Jämförelse av molekylära förändringar som framkallas av varje behandling som bestäms av immunoblotting analys. (A)Halterna av S6 och phospho-S6, nedströmseffektoren för AKT-mTOR-vägen visas. 30 mg totalt protein och specifik antikropp mot S6 och p-S6 användes. GAPDH användes som lastningskontroll. Kvantifiering av proteinnivåer som normaliserats till GAPDH-nivå visas i (B) (C) Nivåer av mTOR, p-mTOR, AKT och p-AKT som detekteras genom immunblottning. GAPDH användes som lastningskontroll. (D)Kvantifiering av proteinnivåer normaliserade till GAPDH-nivå. NT behandlas inte, cellgifter är kemoterapi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver den metod och protokoll som vi använde för att genomföra en "klinisk prövning" i PDX modeller som drar nytta av molekylära egenskaper hos tumör som erhålls genom genomisk profilering för att bestämma det bästa valet av läkemedel för testning. Flera sekvenseringsplattformar används för närvarande för genomisk karakterisering av primära tumörer inklusive hela genomsekvensering, RNAseq och anpassade genpaneler. För hög kvalitet serösa äggstockscancer carcinom, MPseq att identifiera strukturella förändringar, DNA rearrangements och kopiera förändringar nummer, är särskilt användbart på grund av den höga graden av genomisk instabilitet observerats i denna typ av tumör. Den andra fördelen med MPseq-plattformen är att den täcker hela genomet men kostar betydligt mindre än andra omfattande sekvenseringstekniker. MPseq är dock inte lämplig för punktmutation upptäckt som bas täckning är inte tillräckligt, når endast 8-10x. En av begränsningarna med att använda MPseq ensam för genomisk karakterisering av en tumör är förekomsten av komplexa klustrade kromosomala rearrangements, vars analys inte förutsäga uttrycket av påverkade gener av intresse. En korsning som upptäckts av MPseq förutspådde att skapa en förmodad fusion gen som validerar i DNA av PCR får inte uttryckas på grund av en ram skift eller små borttagningar och infogningar i promotorn regionen. På samma sätt bör kromosomvinster och förstärkningar av potentiella terapeutiska mål noggrant bedömas och valideras på RNA- eller proteinnivå för att säkerställa uttryck för den gen av intresse.
Även om den molekylära make-up av tumören är till stor del bevaras efter förökning i möss i flera generationer, förändringar i uttryck nivåer av viktiga gener kan uppstå över tiden antingen återspeglar tumör evolution, klonala urval eller adaptiv svar på murine miljö. Validering av en ändring avsedd för terapeutisk intervention i både ursprungliga givaren tumör och PDX tumör är därför kritisk. För tumör isolerad från PDX modeller både RNA och protein kan användas för att förhöra uttrycket nivå som materialet är rikligt. Antingen kan man välja att dubbelkolla uttrycket i den ursprungliga tumören, beroende på tillgängligheten och typen av den lagrade vävnaden, och tillgången på antikroppar för motsvarande proteindetektering. PDX-modellen är särskilt ovärderlig vid testning av kombinationsterapier eftersom in vivo-inställningen tillåter övervakning av biverkningar, samt doserings- eller varaktighetsjusteringar i behandlingsregimen.
Valet mellan orthotopic och subkutan engraftment kan göras beroende på de specifika frågor som behandlas i studien. Det är dock viktigt att komma ihåg att känsligheten hos xenografted tumörer till therapeutics kan moduleras av platsen för implantation46. Å andra sidan har inga bevis rapporterats ännu på upptäckten av läkemedel som visar ett terapeutiskt svar i ortoptopiska modeller men frånvarande i subkutant implanteras PDX9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmarna i Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr Lin Yang och Faye R. Harris, MS, för hjälp med att genomföra experiment. Detta arbete stöddes av Mr och Mrs Neil E. Eckles gåva till Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
