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Developmental Biology

माउस भ्रूण कोशिकाओं के मल्टीप्लेक्स एकल सेल mRNA अनुक्रमण विश्लेषण

Published: January 7, 2020 doi: 10.3791/60647
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

यहां हमने माउस भ्रूणीय ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति को प्रोफाइल करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स एकल कोशिका एमआरएनए अनुक्रमण विधि प्रस्तुत की। मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियों के संयोजन में ड्रॉपलेट-आधारित एकल सेल एमआरएनए अनुक्रमण (स्क्आरएनए-एसईक्यू) विधि एक साथ कई नमूनों से एकल कोशिकाओं को प्रोफाइल कर सकती है, जो अभिकर्मक लागत को काफी कम करती है और प्रयोगात्मक बैच प्रभावों को कम करती है।

Abstract

एकल सेल एमआरएनए अनुक्रमण ने पिछले कई वर्षों में महत्वपूर्ण प्रगति की है और विकासात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है। इसका उपयोग दुर्लभ कोशिका आबादी की पहचान करने, उपन्यास मार्कर जीन की खोज करने और स्थानिक और लौकिक विकासात्मक जानकारी को डिकोड करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। सिंगल सेल मेथड भी पिछले दो से तीन साल में माइक्रोफ्लूइडिक बेस्ड फ्लूइडिकसीजीएम सी1 तकनीक से लेकर ड्रॉपलेट बेस्ड सॉल्यूशंस तक विकसित हुई है । यहां हमने दिल का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि बूंद आधारित स्क्आरएनए-सीक्यू विधि का उपयोग करके माउस भ्रूणीय ऊतक कोशिकाओं को कैसे प्रोफ़ाइल करें। इसके अलावा, हमने एक ही प्रयोग में कई नमूनों को प्रोफाइल करने के लिए कार्यप्रवाह में दो रणनीतियों को एकीकृत किया है। एकीकृत तरीकों में से एक का उपयोग करना, हम एक साथ आठ दिल के नमूनों से अधिक ९,००० कोशिकाओं प्रोफाइल है । ये विधियां विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, विकासात्मक चरणों या शारीरिक स्थानों से एकल कोशिकाओं को एक साथ प्रोफाइल करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका प्रदान करके विकासात्मक जीव विज्ञान क्षेत्र के लिए मूल्यवान होंगी।

Introduction

भ्रूण विकास के दौरान प्रत्येक एकल कोशिका का प्रतिलेखन प्रोफ़ाइल कोशिका आबादी के बीच भिन्न होता है। यद्यपि सीटू संकरण में एकल आणविक का उपयोग कम संख्या में जीन1की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, एकल कोशिका एमआरएनए अनुक्रमण (स्क्आरएनए-एसईक्यू) एकल कोशिकाओं में जीन के जीनोम-व्यापी अभिव्यक्ति पैटर्न को समझाने के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है। 20092में पहली बार प्रकाशित होने के बाद, स्आरएनए -एसईक्यू को हाल केवर्षों3 ,4,5में कई विकासात्मक चरणों में कई ऊतकों का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । इसके अलावा, जैसा कि मानव सेल एटलस ने हाल ही में अपनी विकास केंद्रित परियोजनाओं को शुरू किया है, निकट भविष्य में मानव भ्रूणीय ऊतकों से अधिक एकल कोशिका डेटा उत्पन्न होने की उम्मीद है ।

विकसित करने के लिए पहले अंग के रूप में दिल भ्रूण के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । दिल में कई कोशिका प्रकार होते हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार का विकास कसकर अस्थायी और स्थानिक रूप से विनियमित होता है। पिछले कुछ वर्षों में, प्रारंभिक विकासात्मक चरणों में हृदय कोशिकाओं की उत्पत्ति और सेल वंशको 6विशेषता दी गई है, जो जन्मजात हृदय रोग रोगजनकता को समझने के लिए एक जबरदस्त उपयोगी नेविगेशन उपकरण प्रदान करता है, साथ ही कार्डियोमायोसाइट पुनर्जनन7को प्रोत्साहित करने के लिए अधिक तकनीकी रूप से उन्नत तरीकों को विकसित करने के लिए।

हाल केवर्षोंमें 8,9,10में स्क्रैन -एसईक्यू का तेजी से विस्तार हुआ है . नव विकसित तरीकों के साथ, एकल कोशिका प्रयोगों का डिजाइन और विश्लेषण11, 12 ,13,14अधिक प्राप्त हो गया है। यहां प्रस्तुत विधि बूंद समाधानों (सामग्री की तालिकादेखें)15,16पर आधारित एक वाणिज्यिक प्रक्रिया है । इस विधि में माइक्रोफ्लूइडिक नियंत्रक प्रणाली के नियंत्रण में तेल-पानी पायस ड्रॉपलेट में विशिष्ट बारकोड किए गए मोतियों की कोशिकाओं और सेटों को कैप्चर करने की सुविधा है। बूंदों में सेल लोड करने की दर बहुत कम है ताकि अधिकांश बूंदों के पायस में केवल एक कोशिका17हो । प्रक्रिया का सरल डिजाइन एकल सेल पृथक्करण से बारकोडिंग के साथ एक साथ होने वाले बूंद पायस में आता है, जो विषम आबादी पर आरएनए-सीक्यू का उपयोग करके व्यक्तिगत कोशिकाओं के समानांतर विश्लेषण को सक्षम बनाता है।

मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियों का समावेश पारंपरिक एकल सेल कार्यप्रवाह13,14के लिए महत्वपूर्ण परिवर्धन में से एक है । यह अतिरिक्त सेल डबल्स को त्यागने, प्रायोगिक लागत को कम करने और बैच प्रभाव18,19को नष्ट करने में बहुत उपयोगी है। एक लिपिड आधारित बारकोडिंग रणनीति और एक एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग रणनीति (सामग्री की तालिकादेखें) दो ज्यादातर उपयोग किए जाने वाले मल्टीप्लेक्सिंग विधियां हैं। दोनों तरीकों से प्रत्येक नमूने को लेबल करने के लिए विशिष्ट बारकोड का उपयोग किया जाता है, और लेबल किए गए नमूनों को एकल सेल कैप्चरिंग, पुस्तकालय तैयार करने और अनुक्रमण के लिए मिलाया जाता है। बाद में, बारकोड दृश्यों(चित्रा 1)19का विश्लेषण करके पूल ्ड अनुक्रमण डेटा को अलग किया जा सकता है। हालांकि, दोनों तरीकों के बीच महत्वपूर्ण मतभेद मौजूद हैं । लिपिड आधारित बारकोडिंग रणनीति लिपिड-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स पर आधारित है, जिसमें किसी भी सेल प्रकार की प्राथमिकताएं नहीं पाई गई हैं। जबकि एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग रणनीति केवल एंटीजन प्रोटीन19,20व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का पता लगा सकती है । इसके अलावा, लिपिड को दागने में लगभग 10 मिन लगते हैं लेकिन एंटीबॉडी(चित्रा 1)को दागने के लिए 40 मिन। इसके अलावा, लिपिड-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स एंटीबॉडी-कॉन्जुगार्ड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की तुलना में सस्ते हैं लेकिन इस लेख को लिखने के समय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। अंत में लिपिड आधारित रणनीति एक प्रयोग में 96 नमूने ले सकती है, लेकिन एंटीबॉडी आधारित रणनीति वर्तमान में केवल मल्टीप्लेक्स 12 नमूने ही ले सकती है।

एक ही प्रयोग में मल्टीप्लेक्स के लिए अनुशंसित सेल संख्या 2.5 x 104से कम होनी चाहिए, अन्यथा, इससे सेल डबल्स और संभावित परिवेश एमआरएनए संदूषण का उच्च प्रतिशत हो जाएगा। मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियों के माध्यम से, एकल सेल कैप्चरिंग, सीडीएनए उत्पादन और कई नमूनों के लिए पुस्तकालय तैयार करने की लागत एक नमूने की लागत तक कम हो जाएगी लेकिन अनुक्रमण लागत समान रहेगी।

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Protocol

पशु प्रक्रिया पिट्सबर्ग संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय के अनुसार है ।

1. माउस भ्रूणीय हृदय विच्छेदन और एकल सेल निलंबन की तैयारी

नोट: इस कदम को काटना भ्रूण की संख्या के आधार पर कुछ घंटे लग सकते हैं ।

  1. E18.5 भ्रूणीय दिल प्राप्त करने के लिए, सीओ2 प्रशासन द्वारा एक गर्भवती CD1 माउस इच्छामृत्यु । पेट के क्षेत्र में अवांछित बालों को हटाने के लिए एक रेजर का उपयोग करें और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा कीटाणुरहित।
  2. निष्फल कैंची का उपयोग करपेट की त्वचा को काट लें और सावधानी से भ्रूण को काट दें और जल्दी से उन्हें बर्फ पर ठंडे फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) में डाल दें।
  3. प्रत्येक व्यक्ति भ्रूण से दिलों को ध्यान से एक स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत ठंडे PBS से भरा पकवान में संदंश और कैंची का उपयोग कर अलग ।
    नोट: दिल के साथ फेफड़ों को विच्छेदन करके चार कक्षों को बरकरार रखें और शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ दिल को सीधे पकड़/खींचें नहीं।
  4. ~ 10 दिलों को ठंडे पीबीएस और माइक्रो-विच्छेदन से भरे एक नए 10 सेमी पकवान में स्थानांतरित करें, जो दिलों को बाएं एट्रियम, राइट एट्रियम, लेफ्ट वेंट्रिकल और राइट वेंट्रिकल में बदल ें।
    नोट: यह प्रत्येक नमूने से 1 x 106 कोशिकाओं से अधिक उपज के लिए माना जाता है। हम प्रति नमूना कम से कम 1 x 105 कोशिकाओं के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं।
  5. 4 कक्ष ऊतकों में से प्रत्येक को 1.5 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें और कैंची का उपयोग करके उन्हें टुकड़ों में काट लें। ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए 3 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  6. अधिष्ठाता को एस्पिरेट करने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 0.25% ट्राइप्सिन/ईटीए का 1 एमएल जोड़ें और 10 00 0 पाइपेट का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट करें। P1000 पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे 7-8 बार पिपेट ऊपर और नीचे।
  7. यदि भ्रूणीय चरण E11.5 से पुराना है, तो 10 मिलीग्राम/mL कोलेजेनेज ए/बी मिश्रण का 1 mL जोड़ें और 10-20 min के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे तब तक पिपेट करें जब तक कि अधिकांश कोशिकाओं को विप्रेरित न किया जाए।
  8. कोशिकाओं को 15 मिलीएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और एंजाइमों को पतला करने के लिए 8 मिली हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) जोड़ें। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें। पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करें और उन्हें 1.5 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  9. प्रत्येक नमूने से 15 माइक्रोन वॉल्यूम लें और 0.04% ट्राइपैन ब्लू की समान मात्रा के साथ मिलाएं। इसे सेल काउंटिंग चैंबर पर लोड करें और कोशिकाओं को सेल काउंटर में गिनें।
    नोट: उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम उत्पन्न करने के लिए, सेल व्यवहार्यता 95% से अधिक होने की सिफारिश की जाती है।

2. सिंगल सेल मल्टीप्लेक्सिंग बारकोडिंग

नोट: यह कदम कम से कम 40 मिन लेता है जो संसाधित नमूनों की संख्या के आधार पर भिन्न होता है। RNase विसंदूषण समाधान के साथ इलाज एक स्वच्छ बेंच क्षेत्र पूर्व प्रवर्धन कदम (चरण २.११ से ३.११) के लिए आवश्यक है, और प्रवर्धन के बाद के चरणों (३.११ के बाद के कदम) के लिए एक अलग स्वच्छ बेंच क्षेत्र की आवश्यकता होती है ।

  1. लिपिड आधारित बारकोडिंग प्रक्रिया (वैकल्पिक प्रक्रिया 1)
    1. सेल एकाग्रता के आधार पर, प्रति नमूना 5 x 105 कोशिकाओं से कम रखें। सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन मलबे और सेल समुचित से मुक्त है।
    2. प्रत्येक नमूने(तालिका 1)के लिए 2 माइक्रोएम एंकर/बारकोड स्टॉक सॉल्यूशन और 2 माइक्रोएम सह-एंकर स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें ।
      नोट: एंकर और सह लंगर कृपया डॉ Zev जे गार्टनर लैब द्वारा भेंट की गई । इन लिपिड-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को संश्लेषित करने के लिए, डीएनए दृश्यों को ठोस समर्थन पर फैटी एसिड के साथ संयुग्मित किया गया था और रिवर्स-चरण उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी)18,19द्वारा शुद्ध किया गया था।
    3. पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं और 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें। पीबीएस के 180 माइक्रोन में कोशिकाओं को निलंबित करें।
    4. एंकर/बारकोड स्टॉक समाधान के 20 μL जोड़ें और ऊपर और नीचे धीरे मिश्रण करने के लिए पिपेट । 5 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    5. सह एंकर स्टॉक समाधान के 20 μL जोड़ें और ऊपर और नीचे धीरे मिश्रण करने के लिए, तो एक और 5 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर 1% बीएसए और सेंट्रलाइज के साथ कोल्ड पीबीएस का 1 मिलीएल जोड़ें। पीबीएस में बर्फ की ठंड 1% बीएसए के साथ कम से कम 2 बार और धोएं।
    7. सभी नमूनों को एक साथ मिलाएं और 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें। कोशिकाओं की गणना करें और धारा 3 में उपयोग करने के लिए बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  2. एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग प्रक्रिया (वैकल्पिक प्रक्रिया 2)
    1. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर प्रत्येक नमूने (चरण 1.8 से) के लिए 1 x 106-2 x 106 कोशिकाएं और उन्हें धुंधला बफर(टेबल 1)के 100 माइक्रोन में 1.5 मिलीग्राम कम बांध ट्यूबों में निलंबित करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 सीन के लिए 10 माइक्रोन एफसी ब्लॉकिंग रिएजेंट और इनक्यूबेट जोड़ें।
    3. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 14,000 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें।
    4. एंटीबॉडी धुंधला समाधान20बनाने के लिए सेल धुंधला बफर के 50 μL के लिए प्रत्येक ओलिगो-conjugated एंटीबॉडी के 1 μg जोड़ें । प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए एक एंटीबॉडी धुंधला समाधान जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    5. पीबीएस के 1 mL के साथ 3 बार धोने कोशिकाओं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 5 मिन के लिए स्पिन।
    6. धुंधला बफर के 1 mL में वांछित अनुपात में सभी नमूनों पूल, 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 5 मिन के लिए स्पिन।
    7. पीबीएस में कोशिकाओं को उचित एकाग्रता (1,500 कोशिकाओं/μL तक) और 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। तुरंत अगले कदम पर आगे बढ़ें।

3. ड्रॉपलेट जनरेशन और एमआरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

नोट: यह कदम एक मल्टीप्लेक्सेड प्रतिक्रिया के लिए लगभग 90 00 लेता है।

  1. जेल मोतियों (सामग्री की तालिकादेखें) को 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान में अलग करें। जेल मोतियों से अभिकर्मकों में इमल्शन (जीईएम) किट (सामग्री की तालिकादेखें) लें और उन्हें अपने इंगित तापमान पर रखें।
  2. चिप बी को चिप धारक में इकट्ठा करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. पंक्ति 1 में अप्रयुक्त कुओं में 50% ग्लाइसेरोल समाधान के 75 माइक्रोन वितरित करें; पंक्ति 2 में 40 माइक्रोन; पंक्ति 3 में 280 μL. चिप की शीर्ष पंक्ति पर किसी भी वसूली कुओं में ग्लाइसेरोल न जोड़ें।
  4. टेबल 1के अनुसार बर्फ पर मास्टर मिश्रण तैयार करें। सेल सस्पेंशन और न्यूकलीज-मुक्त पानी की उचित मात्रा को सेल सस्पेंशन वॉल्यूम कैलकुलेटर टेबल17 के अनुसार मास्टर मिक्स में जोड़ें और धीरे-धीरे मिश्रण को पिपेट करें। बुलबुले शुरू किए बिना पंक्ति 1 में अच्छी तरह से नमूना के नीचे केंद्र में सेल मिश्रण के 75 μL बांटना।
  5. भंवर एक भंवर एडाप्टर का उपयोग कर 30 एस के लिए जेल मोती और धीरे-धीरे बुलबुले शुरू करने के बिना पंक्ति 2 में अच्छी तरह से जेल मनका के नीचे केंद्र में जेल मोतियों के 40 μl बांटना।
    नोट: गीला विफलता से बचने के लिए कोशिकाओं और जेल मोतियों को जोड़ने के बीच 30 एस का इंतजार करना महत्वपूर्ण है।
  6. 3 पंक्ति में अच्छी तरह से विभाजन तेल के लिए, अच्छी तरह से साइडवॉल के माध्यम से विभाजन तेल के 280 μL बांटना।
    नोट: विभाजन तेल के 270 माइक्रोन से कम लोड होने से असामान्य जीईएम पीढ़ी पैदा होगी।
  7. चिप पर गैसकेट संलग्न करें, गैसकेट पर नीचे प्रेस न करें और गैसकेट गीला करने से बचने के लिए इसे क्षैतिज रखें।
  8. क्रोमियम नियंत्रक में गैसकेट के साथ इकट्ठे चिप लोड और क्रोमियम एकल सेल बी कार्यक्रम चलाने (सामग्री की मेजदेखें), तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना जब कार्यक्रम पूरा होता है ।
  9. चिप को बाहर निकालकर गैसकेट को डिस्कार्ड कर दें। ढक्कन को 45 डिग्री पर कुओं का पर्दाफाश करने के लिए वापस मोड़ें, यह सुनिश्चित करने के लिए तरल स्तर की जांच करें कि कोई मोज़री मौजूद न हो।
  10. धीरे-धीरे वसूली के निम्नतम बिंदुओं से जीईएम के 100 माइक्रोन को अच्छी तरह से एस्पिरेट करें और जीईएम की एकरूपता की जांच करें। ट्यूब के साइडवॉल के खिलाफ पिपेट युक्तियों के साथ बर्फ पर एक नई बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) ट्यूब में GEMs बांटना।
    नोट: यदि अतिरिक्त जलीय परत देखी जाती है, तो नमूने फिर से तैयार करने का सुझाव दिया जाता है। महत्वपूर्ण बात, मिश्रण की एक तस्वीर ले जब GEMs पिपेट युक्तियों में अभी भी कर रहे हैं । यह तस्वीर बता सकती है कि क्या एक गीला विफलता है, आंशिक रूप से पायस जीईएम, और रिएजेंट क्लॉग है। तस्वीर भी सबूत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रतिस्थापन अभिकर्मकों और चिप्स के साथ अभिएजेंट कंपनी से प्रतिपूर्ति प्राप्त करने के लिए ।
  11. ट्यूब को थर्मल साइकिलर में रखें और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया(टेबल 2)करें।
    नोट: यहां बंद करो या अगले कदम के लिए आगे बढ़ना । पीसीआर उत्पाद को एक सप्ताह तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

4. सीडीएनए एम्पलीफिकेशन

नोट: यह कदम लगभग 150 00 min लेता है।

  1. पोस्ट सिंगल सेल रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन क्लीनअप
    1. जीईएम किट (सामग्री की तालिकादेखें) से सीडीएनए प्रवर्धन रिएजेंट्स को बाहर निकालें और उन्हें अपने इंगित तापमान पर रखें।
    2. एक बिफसिक मिश्रण प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर नमूने में रिकवरी एजेंट के 125 माइक्रोन जोड़ें। कोई अपारदर्शी तरल नहीं देखा जाना चाहिए और मिश्रण को पिलेटिंग या भंवर से बचाना चाहिए।
    3. 60 एस के इंतजार के बाद, धीरे-धीरे ट्यूब के नीचे से वसूली एजेंट के 125 माइक्रोन को हटा दें।
    4. भंवर चुंबकीय मोती (सामग्री की तालिकादेखें) अच्छी तरह से 30 एस के लिए और तुरंत इसका इस्तेमाल मोती सफाई मिश्रण(तालिका 1)तैयार करने के लिए । एजेंटों को सूचीबद्ध के रूप में क्रमिक रूप से जोड़ा जाना चाहिए।
    5. भंवर मोती सफाई मिश्रण और नमूने में २०० μL जोड़ें । इस मिश्रण को 10 बार पिपेट करें फिर इसे कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. एल्यूशन सॉल्यूशन तैयार करने के लिए टेबल 1 में सूचीबद्ध के रूप में अभिकर्मकों को क्रमिक रूप से जोड़ें और सीडीएनए को इस प्रकार के रूप में एल्यूट करें।
      1. नमूने को चुंबक (उच्च स्थिति) (सामग्री की तालिकादेखें) पर रखें जब तक कि समाधान साफ न हो जाए, फिर अधिनेत को हटा दें।
      2. पैलेट में 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस के लिए प्रतीक्षा करें, फिर इथेनॉल को हटा दें।
      3. एक और 2 बार के लिए चरण 4.1.6.2 दोहराएं। सेंटरिफ्यूज संक्षेप में और चुंबक (कम स्थिति) पर रखें। ध्यान से 2 मिनट से कम समय के लिए शेष इथेनॉल और हवा सूखी निकालें।
        नोट: पिछले 2 मिन हवा से अधिक नहीं है, अन्यथा elution दक्षता कम हो जाएगा।
      4. चुंबक से नमूना निकालें। 15 बार मिलाने के लिए एल्यूटस सॉल्यूशन और पिपेट के 35.5 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 न्यूनतम इनक्यूबेट।
      5. नमूना चुंबक (उच्च स्थिति) पर तब तक रखें जब तक कि समाधान साफ न हो जाए। नमूने के 35 माइक्रोन को एक नई ट्यूब स्ट्रिप में स्थानांतरित करें।
        नोट: इस शुद्धिकरण प्रक्रिया का उपयोग चरण 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 और 6.2.6 में भी किया जाता है। चुंबकीय मोतियों की एकाग्रता और ईबी बफर/अल्ट्राप्योर पानी की मात्रा पर ध्यान दें जो प्रत्येक चरण में नमूनों को एल्यूट करने के लिए उपयोग किए जाते हैं ।
    7. एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण21 (सामग्री की तालिकादेखें)(चित्रा 2)का उपयोग करके विशाल सीडीएनए के आकार, एकाग्रता और अखंडता की मात्रा निर्धारित करें।
  2. सीडीएनए का प्रवर्धन
    1. लिपिड आधारित बारकोडिंग रणनीति (वैकल्पिक प्रक्रिया 1) का उपयोग करके सीडीएनए प्रवर्धन
      1. बर्फ पर प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण(तालिका 1)तैयार करें।
      2. सीडीएनए नमूनों के 35 माइक्रोन (चरण 4.1.6.7 से) में प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें। मिश्रण पिपेट, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र। सीडीएनए प्रवर्धन प्रक्रिया(तालिका 2)का पालन करते हुए मिश्रण को थर्मल साइकिलर में इनक्यूबेट करें।
      3. अच्छी तरह से भंवर के बाद, चुनिंदा अभिकर्मक के 120 μL और 100 μL के नमूने के 100 μL के लिए चयन अभिकर्ता की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) । मिश्रण को 15 बार पिपेट करें।
      4. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट और फिर चुंबक पर नमूना जगह जब तक समाधान स्पष्ट हो जाते हैं ।
        नोट: मोतियों के अंश और मल्टीप्लेक्सिंग बारकोड सीडीएनए में एंडोजेनस सीडीएनए सुपरनेटेंट में है।
      5. 6.1 कदम पर मल्टीप्लेक्सिंग बारकोडेड सीडीएनए लाइब्रेरी निर्माण के लिए 1.5 एमएल कम बाइंड ट्यूब में सुपरनेटेंट स्थानांतरित करें।
      6. 4.1.6 में चरणों का पालन करके एंडोजेनस सीडीएनए को साफ करें और उन्हें ईबी बफर के 40 माइक्रोन के साथ एल्यूट करें।
      7. सीडीएनए का विश्लेषण करने/मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) पर शुद्ध सीडीएनए नमूने का 1 μL चलाएं।
      8. अलिफनेस लाइब्रेरी निर्माण के लिए एक नई पीसीआर ट्यूब में सीडीएनए के 10 μL को उद्धृत करें।
        नोट: यहां बंद करो या अगले कदम के लिए आगे बढ़ना । शेष नमूने को 4 सप्ताह तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है ताकि यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त पुस्तकालय उत्पन्न किए जा सकें।
    2. एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग रणनीति में सीडीएनए प्रवर्धन (वैकल्पिक प्रक्रिया 2)
      1. एचटीओ और एडीटी एडिटिव प्राइमर के 2 पीएमओएल और सीडीएनए प्राइमर के 15 माइक्रोन को प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण(तालिका 1)के 50 माइक्रोन में जोड़ें और सीडीएनए प्रवर्धन प्रक्रिया(तालिका 2)के साथ सीडीएनए प्रवर्धन करें।
      2. एंडोजेनस सीडीएनए (मोतियों के अंश) और मल्टीप्लेक्सिंग बारकोड सीडीएनए (सुपरनेटेंट में) को अलग करने के लिए 0.6x चुनें अभिकर्ता का उपयोग करें। कदम 6.2 में बारकोडिंग पुस्तकालय निर्माण करने के लिए सुपरनेटेंट को बचाने के लिए याद रखें।
      3. 4.1.6 में चरणों का पालन करके अंतर्जात ट्रांसक्रिप्ट सीडीएना को शुद्ध और मिटाएं, पुस्तकालयों का गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) करें और अंतर्जात पुस्तकालय निर्माण के लिए एक नई पीसीआर ट्यूब में 10 माइक्रोन को एलिकोट करें।

5. एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट लाइब्रेरी तैयारी

नोट: यह कदम लगभग 120 00 min लेता है।

  1. क्रमशः अपने इंगित तापमान पर पुस्तकालय किट (सामग्री की तालिकादेखें) से जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय निर्माण अभिकर्मकों को रखें।
  2. बर्फ पर विखंडन मिश्रण(टेबल 1)तैयार करें, संक्षेप में मिश्रण और अपकेंद्री बनाने के लिए पिपेट करें।
  3. 10 μL शुद्ध सीडीएनए नमूने (चरण 4.2.1.8 या 4.2.2.3 से) में 25 μL ईबी बफर जोड़ें और फिर नमूने में नए तैयार 15 μL विखंडन मिश्रण जोड़ें, मिश्रण को बर्फ और अपकेंद्रित्र पर 15 बार संक्षेप में पिपेट करें।
  4. नमूने को एक पूर्व-ठंडा थर्मल साइकिलर में स्थानांतरित करें और विखंडन, अंत मरम्मत और ए-टेलिंग(तालिका 2)के लिए पीसीआर कार्यक्रम शुरू करें।
  5. भंवर चुंबकीय मोतियों को निलंबित करने के लिए चुनिंदा अभिकर्मक और उपयोगकर्ता गाइड17,22के अनुसार दो तरफा आकार चयन करने के लिए 0.6x और 0.8 x का चयन अभिकर्मकों का लगातार उपयोग करें। डीएनए को एलिट करने के लिए ईबी बफर के 50 माइक्रोन का इस्तेमाल करें।
  6. एडाप्टर लिगेशन मिश्रण(तालिका 1)तैयार करें, फिर मिश्रण को अच्छी तरह से और अपकेंद्रित्र संक्षेप में पिपेट करें।
  7. नमूना के 50 माइक्रोन में एडाप्टर लिगेशन मिश्रण के 50 माइक्रोन जोड़ें, 15 बार फिर से पिपेट मिश्रण करें और संक्षेप में अपकेंद्री रहें। थर्मल साइकिल(टेबल 2)में प्रोटोकॉल के अनुसार एडाप्टर लिगेशन करें।
  8. लिगेशन उत्पाद को शुद्ध करने के लिए 0.8 x का चयन अभिकर्ता का उपयोग करें और ईबी बफर के 30 माइक्रोन के साथ शुद्ध नमूने को एल्यूट करें (चरण 4.1.6 देखें)।
  9. नमूना इंडेक्स पीसीआर मिश्रण(टेबल 1)तैयार करें और शुद्ध नमूने में 60 माइक्रोन जोड़ें। नमूना सूचकांक के 10 μL जोड़ें, पाइपेट 5 बार के लिए ऊपर और नीचे मिश्रण और केंद्रिताने संक्षेप में, नमूना सूचकांक प्रोटोकॉल(तालिका 2)के बाद एक थर्मल साइकिलर में इनक्यूबेट ।
    नोट: यहां बंद करो या अगले कदम के लिए आगे बढ़ना । यदि एक से अधिक अच्छी तरह से उपयोग किया जाता है, तो प्रत्येक अच्छी तरह से एक विशिष्ट नमूना सूचकांक (सामग्री की तालिकादेखें) चुनें। प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग की जाने वाली इंडेक्स आईडी को रिकॉर्ड करना याद रखें और मल्टीप्लेक्स अनुक्रमित रन में कोई ओवरलैप सुनिश्चित न करें।
  10. शुद्ध एंडोजेनस सेलुलर लाइब्रेरी डीएनए17के 35 माइक्रोन प्राप्त करने के लिए दो तरफा आकार का चयन करने के लिए 0.6x और 0.8 x चुनिंदा अभिकर्मकों का लगातार उपयोग करें।
  11. अनुक्रमण से पहले एनडोजेनस सेलुलर लाइब्रेरी क्यूसी(चित्रा 2)।

6. मल्टीप्लेक्सिंग सैंपल बारकोड सीडीएनए लाइब्रेरी तैयार करना

नोट: यह कदम कम से कम 120 min लेता है।

  1. लिपिड आधारित मल्टीप्लेक्सिंग रणनीति के लिए नमूना बारकोड लाइब्रेरी पीढ़ी (वैकल्पिक प्रक्रिया 1)
    1. 3.2 x चुनिंदा अभिएजेंट एकाग्रता प्राप्त करने के लिए चरण 4.2.1.5 से नमूना बारकोड सीडीएनए में चुनिंदा अभिकर्मक और आइसोप्रोपेनॉल के 360 माइक्रोन के 520 माइक्रोन जोड़ें। मिश्रण को 10 बार पिपेट करें और 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    2. ट्यूब को चुंबकीय रैक पर रखें और समाधान स्पष्ट होने का इंतजार करें। इसके बाद अधिवक्रमक को त्याग दें।
    3. चुंबक पर दो बार मोतियों को धोने और प्रत्येक धोने के बाद 30 एस की प्रतीक्षा करने के लिए 80% इथेनॉल के 500 माइक्रोन का उपयोग करें।
    4. संक्षेप में मोतियों को अपकेंद्रित करें और चुंबक पर रखें। शेष इथेनॉल को पी 10 माइक्रोपाइपेट के साथ निकालें और 2 मिन के लिए मोती छोड़ दें।
    5. चुंबक रैक से ट्यूब निकालें और ईबी बफर के 50 माइक्रोन में मोतियों को फिर से निलंबित करें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। 2 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    6. ट्यूब को चुंबक पर वापस करें और समाधान को स्पष्ट करने की प्रतीक्षा करें। सुपरनेटेंट (नमूना बारकोड सीडीएनए) को एक नई पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें। किसी भी मोतियों को स्थानांतरित न करने के लिए सावधान रहें।
    7. नमूना बारकोड सीडीएनए23की एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें ।
    8. लिपिड बारकोड लाइब्रेरी मिश्रण(टेबल 1),शुद्ध बारकोड सीडीएनए (चरण 6.1.6 से) और 50 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए न्यूकलीज-मुक्त पानी के 3.5 एनजी जोड़ें।
    9. लिपिड आधारित बारकोड लाइब्रेरी पीसीआर(टेबल 2)के बाद इसे थर्मल साइकिलर में रखें।
    10. पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करने और ईबी बफर के 25 माइक्रोन के साथ डीएनए को एल्यूट करने के लिए 1.6x चुनिंदा अभिकर्मक का उपयोग करें (चरण 4.1.6 देखें)।
    11. 1:5(चित्रा 2)के प्रारंभिक कमजोर पड़ने से एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए विश्लेषण विधि24 का उपयोग करके पुस्तकालय एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  2. एंटीबॉडी आधारित मल्टीप्लेक्सिंग रणनीति के लिए नमूना बारकोड लाइब्रेरी जनरेशन (वैकल्पिक प्रक्रिया 2)
    1. 2x सेलेक्ट रिएजेंट अनुपात प्राप्त करने के लिए चरण 4.2.2.3 से प्राप्त नमूना बारकोड युक्त सुपरनेटेंट में चुनिंदा अभिकर्ता की अतिरिक्त 1.4x प्रतिक्रिया मात्रा जोड़ें।
    2. 4.1.6 में चरणों का पालन करके 80% इथेनॉल के साथ मोतियों को धोएं और अल्ट्राप्ली पानी के साथ बारकोड सीडीएनए को एलिट करें।
    3. दूसरी बार 2x का चयन अभिकर्ता के साथ चयन प्रोटोकॉल करें और अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके एलिट करें।
    4. एंटीबॉडी बारकोड लाइब्रेरी मिश्रण(टेबल 1)तैयार करें, और अंतिम चरण से शुद्ध बारकोड सीडीए के 45 माइक्रोन जोड़ें।
    5. एंटीबॉडी बारकोड लाइब्रेरी पीसीआर (टेबल 2)20के बाद थर्मल साइकिलर में इनक्यूबेट करें ।
    6. पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करने के लिए 1.6 x चुनिंदा अभिकर्मक का उपयोग करें और शुद्ध नमूने को अल्ट्राप्ली पानी के 30 माइक्रोन के साथ संबद्ध करें (चरण 4.1.6 देखें)।

7. लाइब्रेरी सीक्वेंसिंग

नोट: हिसेक्यू 4000 और नोवासेक़ जैसे कई अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्मों का उपयोग एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट पुस्तकालयों और मल्टीप्लेक्सिंग बारकोड पुस्तकालयों को अनुक्रम करने के लिए किया जा सकता है।

  1. एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट पुस्तकालयों और मल्टीप्लेक्सिंग बारकोड पुस्तकालयों को अनुक्रम करने के लिए पसंद के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच का उपयोग करें।
  2. एक अनुक्रमण कंपनी या अनुक्रमण सुविधा में एक विशेषज्ञ से सिफारिशों के अनुसार पुस्तकालयों को पतला करें। प्रति सेल न्यूनतम 20,000 पढ़ता है एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट लाइब्रेरी के लिए अनुशंसित है और बारकोड पुस्तकालयों के लिए 3000 पढ़ता है।

8. डेटा विश्लेषण

नोट: क्लाउड-आधारित संसाधन बेसस्पेस का उपयोग करके या यूनिक्स सर्वर पर bcl2fastq पैकेज चलाकर अनुक्रमण डेटा को डी-मल्टीप्लेक्स करें।

  1. एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्टोम डेटा विश्लेषण
    1. डिमल्टीप्लेक्सिंग सॉफ्टवेयर से उत्पन्न फास्टक्यू डेटा के साथ, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध डेटा विश्लेषण पाइपलाइन (सामग्री की तालिकादेखें) पर "एमकेफास्टक्यू" चलाएं ताकि प्रत्येक जीईएम बारकोड को और डिमल्टीप्लेक्स किया जा सके।
    2. संरेखण, फ़िल्टरिंग, बारकोड गिनती और यूमी गिनती करने के लिए "गिनती" चलाएं।
    3. वैकल्पिक रूप से, एक ही प्रयोग से कई अनुक्रमण गलियों को एकत्र करने के लिए "एग्री" चलाएं।
    4. डेटा, क्लस्टर कोशिकाओं की कल्पना करने, अलग-अलग व्यक्त किए गए जीन की पहचान करने और टीएसएनई या जीन अभिव्यक्ति हीटमैप भूखंडउत्पन्न करने के लिए "सेल ब्राउज़र" (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
    5. वैकल्पिक रूप से, डेटा को सामान्य और स्केल करने, अलग-अलग व्यक्त किए गए जीन ों की पहचान करने और tSNE/UMAP भूखंडों और जीन अभिव्यक्ति हीटमैप(चित्रा 3)उत्पन्न करने के लिए एक अच्छी तरह से बनाए रखा आर-आधारित प्लेटफ़ॉर्म25 (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
  2. मल्टीप्लेक्सिंग बारकोड डेटा विश्लेषण
    1. लिपिड आधारित बारकोडिंग रणनीति से डेटा का विश्लेषण
      1. नमूना बारकोड FASTQ फ़ाइलों को नमूना बारकोड यूमी काउंट मैट्रिक्स में बदलने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेटा विश्लेषण पाइपलाइन या डिमुल्टीप्लेक्स आर पैकेज(https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq)का उपयोग करें।
      2. बारकोड UMI गिनती मैट्रिक्स एक साथ एक आर आधारित मंच के लिए एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्टोम डेटा के साथ लोड (सामग्री की तालिकादेखें) एकीकरण विश्लेषण के लिए(चित्रा 3)।
    2. एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग रणनीति से डेटा का विश्लेषण
      1. लाइब्रेरी सीएसवी फाइल और हैशटैग फीचर रेफरेंस सीएसवी फाइल प्रदान करके बारकोड को मैप करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेटा विश्लेषण पाइपलाइन से "गिनती" का उपयोग करें।
      2. आउटपुट यूनिफाइड फीचर-बारकोड मैट्रिक्स लोड करें, जिसमें जीन अभिव्यक्ति की गिनती होती है, जिसमें प्रत्येक सेल बारकोड के लिए फीचर बारकोड मायने रखता है, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आर-आधारित मंच पर।

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Representative Results

इस अध्ययन में, हमने माउस भ्रूणीय हृदय का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि कैसे एक अंग के अलग-अलग हिस्सों से विभिन्न नमूनों को संसाधित करने के लिए मल्टीप्लेक्स एकल सेल एमआरएनए अनुक्रमण किया गया था। E18.5 CD1 माउस दिल अलग थे और बाएं एट्रियम (ला), राइट एट्रियम (आरए), लेफ्ट वेंट्रिकल (एलवी) और राइट वेंट्रिकल (आरवी) में विच्छेदित हो गए थे। इसके बाद एट्रियल और वेंट्रिकुलर कोशिकाओं को लिपिड आधारित बारकोडिंग प्रक्रिया का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से बारकोड किया गया और जीईएम पीढ़ी और रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन से पहले एक साथ मिलाया गया। योजनाबद्ध अवलोकन चित्र 1में दिखाया गया है । हमने पुस्तकालय निर्माण(चित्रा 2ए)से पहले सीडीएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित की है। मानक स्क्आरएनए-एसईक्यू से मल्टीप्लेक्स स्क्आरएनए-एसईक्यू को करने में एक भेद यह है कि सीडीएनए प्रवर्धन और शुद्धिकरण (चरण 4.2.1 और 4.2.2.2) के बाद एंडोजेनस सीडीएनए लाइब्रेरी और नमूना बारकोड सीडीएनए लाइब्रेरी का अधिग्रहण अलग से किया गया था। दो पुस्तकालयों को भी हमारे प्रयोग में योग्य थे(चित्रा 2बी, सी)। पुस्तकालय निर्माण और क्यूसी के बाद अगली पीढ़ी अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण किया गया।

हमने एक ही अनुक्रमण लेन में दोनों पुस्तकालयों को अनुक्रम करने के लिए HiSeqX मंच का उपयोग किया। अनुक्रमण डेटा के साथ, हमने सबसे पहले बेसस्पेस प्रोग्राम का उपयोग करके एंडोजेनस ट्रांसक्रिप्ट डेटा और बारकोड डेटा को अलग किया। फिर हमने प्रत्येक कोशिका में बारकोड अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया और एकल कोशिकाओं के 8 समूहपाए जो विशिष्ट रूप से एक प्रकार के बारकोड को व्यक्त करते हैं, 8 विभिन्न नमूनों(चित्रा 3ए)से कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, हमने यह भी पाया कि कुछ कोशिकाएं किसी भी बारकोड को व्यक्त नहीं करती हैं, जिसे हमने नकारात्मक कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया है, और कुछ कोशिकाएं दो अलग-अलग बारकोड व्यक्त करती हैं, जो डबल्स(चित्रा 3बी)का प्रतिनिधित्व करती हैं। संक्षेप में, हमने पाया कि लगभग 70% कोशिकाएं सिंगल्ट हैं, 25% कोशिकाएं नकारात्मक हैं और 5% कोशिकाएं डबल्स हैं।

एकल कोशिकाओं के साथ, हम सेलुलर विषमता और आणविक नियमों को समझने के लिए आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण कर सकते हैं। संभावित विश्लेषण सेल प्रकार एनोटेशन(चित्रा 4ए),उपन्यास/दुर्लभ सेल प्रकार पहचान(चित्रा 4बी),शारीरिक क्षेत्र तुलनात्मक विश्लेषण(चित्रा 4सी),और जीन ऑन्कोलॉजी मार्ग विश्लेषण जैसे सेल साइकिल चरण अलगाव(चित्रा 4डी)हो सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: मल्टीप्लेक्स एकल सेल एमआरएनए अनुक्रमण कार्यप्रवाह। भ्रूण दिन १८.५ चरण दिलों का विश्लेषण एक मल्टीप्लेक्सड्रॉप आधारित एकल कोशिका अनुक्रमण प्रक्रिया का उपयोग कर के किया गया । आर टी = रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि QC विभिन्न चरणों में परिणाम. (A)चरण 4.1.7 से सीडीएनए का क्यूसी विश्लेषण। लक्ष्य खंड का आकार 200 से 9000 बीपी है।(बी)एंडोजेनस लाइब्रेरी और(सी)बारकोड लाइब्रेरी का विश्लेषण स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस इंस्ट्रूमेंट के साथ किया गया था। एंडोजेनियस लाइब्रेरी के लिए टारगेट टुकड़ा साइज 300-600 बीपी है और बारकोड लाइब्रेरी डीएनए साइज 172 बीपी के आसपास है। इस आंकड़े का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: लिपिड आधारित बारकोडिंग रणनीति से अनुक्रमण डेटा को डिमल्टीप्लेक्सिंग करना। (A)बारकोड अभिव्यक्ति का अपर्यवेक्षित विश्लेषण। एक्स-एक्सिस एकल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-एक्सिस बारकोड का प्रतिनिधित्व करता है। 8 एकल सेल आबादी में से प्रत्येक को विशिष्ट रूप से 8 बारकोड में से एक को व्यक्त करने के लिए पहचाना गया था। ध्यान दें कि कुछ कोशिकाएं एक से अधिक बारकोड व्यक्त करती हैं, और कुछ कोशिकाएं कोई बारकोड व्यक्त नहीं करती हैं। (ख)एकल कोशिकाओं, डबल कोशिकाओं, और नकारात्मक कोशिकाओं के टी-SNE साजिश । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एकल सेल प्रतिलेखन डेटा का उन्नत विश्लेषण। (ए-डी) सेलुलर विषमता और आणविक रास्तों को समझने के लिए एकल सेल डेटा का विश्लेषण विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है। हमने यहां कई अनुप्रयोगों को उदाहरण के रूप में सूचीबद्ध किया है। सेल प्रकार(ए),दुर्लभ कोशिका आबादी(बी),सेल शारीरिक क्षेत्रों(सी),और सेल चक्र चरणों(डी)की पहचान करने के लिए एकल कोशिकाओं को एक आर पैकेज में लोड किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मिश्रण नाम संरचना
कोलेजेनेज़ मिश्रण 10 मिलीग्राम/mL कोलेजेनेज ए और 10 मिलीग्राम/mL कोलेजेनेज बी, एचबीएस ++ में 40% एफबीएस के साथ भंग।
2 μM एंकर/बारकोड स्टॉक समाधान 25 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए पीबीएस (एफबीएस या बीएसए के बिना) में 1:1 मोलर अनुपात में 50 माइक्रोन एंकर और 10 माइक्रोन बारकोड स्ट्रैंड मिलाएं।
2 μM सह एंकर स्टॉक समाधान 24 माइक्रोन पीबीएस (एफबीएस या बीएसए के बिना) के साथ पतला 1 μL 50 μM सह एंकर।
धुंधला बफर पीबीएस जिसमें 2% बीएसए, 0.01% ट्वीन 20
मास्टर मिश्रण 20 μL आरटी रिएजेंट, 3.1 μL Oligo, 2 μL कम करने एजेंट बी, 8.3 μL आरटी एंजाइम सी.
मोती सफाई मिश्रण 182 μL सफाई बफर, 8 μL चयन अभिकर्ता, 5 μL कम करने एजेंट बी, 5 μL Nuclease मुक्त पानी।
प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण 1 μM लिपिड टैग योजक प्राइमर, 15 μL सीडीएनए प्राइमर, 50 μL Amp मिक्स के 1 μL
एल्यूशन सॉल्यूशन 98 माइक्रोन बफर ईबी, 1 μL 10% ट्वीन 20, 1 μL कम करने एजेंट बी.
विखंडन मिश्रण 5 μL विखंडन बफर, 10 μL विखंडन एंजाइम।
एडाप्टर लिगेशन मिश्रण 20 μL लिगेशन बफर, 10 μL डीएनए लिगाज, 20 μL एडाप्टर ओलिगोस।
नमूना सूचकांक पीसीआर मिश्रण 50 μL Amp मिक्स, 10 μL एसआई प्राइमर
लिपिड बारकोड पुस्तकालय मिश्रण 2 × हॉट स्टार्ट मास्टर मिक्स का 26.25 माइक्रोन, 10 माइक्रोन आरपिक्स प्राइमर का 2.5 माइक्रोन, 10 माइक्रोन ट्रूसेक्यू यूनिवर्सल एडाप्टर प्राइमर का 2.5 माइक्रोनल (सामग्री की तालिका देखें)
एंटीबॉडी बारकोड लाइब्रेरी मिश्रण 2 × हॉट स्टार्ट मास्टर मिक्स के 50 माइक्रोन, 10 माइक्रोन आरपीसीप्राइमर के 2.5 माइक्रोन, 10 माइक्रोन पी 5-स्मार्ट-पीसीआर हाइब्रिड ओलिगो के 2.5 माइक्रोन

तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला अभिएजेंट मिश्रण।

इनक्यूबेटिंग प्रक्रिया तापमान(1) समय
जेम-आरटी इन्क्यूबेशन ढक्कन तापमान 53 डिग्री सेल्सियस
चरण 1 53 डिग्री सेल्सियस 45 मिन
चरण 2 85 डिग्री सेल्सियस 5 मिन
चरण 3 4 डिग्री सेल्सियस पकड़
10x जीनोमिक्स सीडीएनए प्रवर्धन ढक्कन तापमान 105 डिग्री सेल्सियस
चरण 1 98 डिग्री सेल्सियस 3 मिन
चरण 2 98 डिग्री सेल्सियस 15 एस
चरण 3 63 डिग्री सेल्सियस 20 एस
चरण 4 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
चरण 5 कुल 12 चक्रों के लिए 2 से 4 चरण दोहराएं (2)
चरण 6 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
चरण 7 4 डिग्री सेल्सियस पकड़
पुस्तकालय निर्माण ढक्कन तापमान 65 डिग्री सेल्सियस
प्री-कूल ब्लॉक 4 डिग्री सेल्सियस पकड़
फ़्रेग्मेंटेशन 32 डिग्री सेल्सियस 5 मिन
अंत मरम्मत और एक टेलिंग 65 डिग्री सेल्सियस 30 मिन
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस पकड़
एडाप्टर लिगेशन ढक्कन तापमान 30 डिग्री सेल्सियस
चरण 1 20 डिग्री सेल्सियस 15 मिन
चरण 2 4 डिग्री सेल्सियस पकड़
नमूना सूचकांक पीसीआर ढक्कन तापमान 105 डिग्री सेल्सियस
चरण 1 98 डिग्री सेल्सियस 45 एस
चरण 2 98 डिग्री सेल्सियस 20 एस
चरण 3 54 डिग्री सेल्सियस 30 एस
चरण 4 72 डिग्री सेल्सियस 20 एस
चरण 5 कुल 12 चक्रों के लिए 2 से 4 चरण दोहराएं (3)
चरण 6 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
चरण 7 4 डिग्री सेल्सियस पकड़
लिपिड बारकोड लाइब्रेरी पीसीआर
चरण 1 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिन
चरण 2 98 डिग्री सेल्सियस 15 एस
चरण 3 60 डिग्री सेल्सियस 30 एस
चरण 4 72 डिग्री सेल्सियस 30 एस
चरण 5 कुल 10 चक्रों के लिए 2 से 4 चरण दोहराएं (4)
चरण 6 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
चरण 7 4 डिग्री सेल्सियस पकड़
एंटीबॉडी बारकोड लाइब्रेरी पीसीआर
चरण 1 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिन
चरण 2 95 डिग्री सेल्सियस 20 एस
चरण 3 60 डिग्री सेल्सियस 30 एस
चरण 4 72 डिग्री सेल्सियस 20 एस
चरण 5 कुल में 8 चक्रों के लिए 2 से 4 चरण दोहराएं (5)
चरण 6 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिन
चरण 7 4 डिग्री सेल्सियस पकड़

तालिका 2: प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली इनक्यूबेटिंग प्रक्रिया। (1) हर प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न ढक्कन तापमान पर ध्यान दें। (2) सेल लोड के अनुसार कुल चक्र संख्या निर्धारित करें: <500 सेल लोड के लिए 13 चक्र; 500-6,000 सेल लोड के लिए 12 चक्र; 6,000 सेल लोड के लिए 11 चक्र। (3) सीडीएनए इनपुट के अनुसार कुल चक्र संख्या निर्धारित करें: 1-25 एनजी सीडीएनए के लिए 14-16 चक्र; 25-150 एनजी सीडीएनए के लिए 12-14 चक्र; 150-500 एनजी सीडीएनए के लिए 10-12 चक्र; 500-1,000 एनजी सीडीएनए के लिए 8-10 चक्र; 1000-1500 एनजी सीडीएनए के लिए 6-8 चक्र। (4) सीडीएनए इनपुट के अनुसार कुल चक्र संख्या निर्धारित करें: 8-12 चक्र। (5) सीडीएनए इनपुट के अनुसार कुल चक्र संख्या निर्धारित करें: 6-10 चक्र।

लिपिड आधारित बार्कोडिंग ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स
एंकर एलएमओ 5'-TGGAATTCGCGTGCCAAGGGTAACGATCCAGCTCTCACT-लिपिड-3'
सह-एंकर एलएमओ 5'-लिपिड-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-3'
बारकोड ओलिगो 5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNNNNNA30-3 '
लिपिड बारकोडिंग योजक प्राइमर 5'-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3'
RPIX प्राइमर 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNGTGACTGTTTTCC
TTGGCACCCGAGAATTCCA-3 '
यूनिवर्सल एडाप्टर प्राइमर 5'-AATGATACGGCGACCACGAGATACTACACTCTCTCCCTACACACAC
GCTCTTCCGATCT-3 '
एंटीबॉडी आधारित बार्कोडिंग ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स
एंटीबॉडी बारकोडिंग ओलिगो 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTCTCTCTCCCGATCTCTNNNNNNNNNN
NNBAaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
HTO योजक प्राइमर 5'-GTGACTGGAGTTGTGTGTGTGCGCGCTCTCTC-3'
एडीटी एडिटिव प्राइमर 5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCC-3 '
P5-स्मार्ट-पीसीआर हाइब्रिड ओलिगो 5'-AATGATACGGCGACCCCGAGATCTACACGCCTGTGCGCAAAa
GCAGTGGTATCAACGCAGAGT * ए * सी-3 '

तालिका 3: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दृश्य। एन = बारकोड या इंडेक्स अनुक्रम; * = फॉस्फोरोथियोएट बॉन्ड

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Discussion

इस अध्ययन में, हमने एकल सेल ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है। हमने स्क्आरएनए-सीक्यू वर्कफ्लो में मल्टीप्लेक्स के नमूनों को दो वैकल्पिक तरीके भी उपलब्ध कराए हैं। दोनों विधियां विभिन्न प्रयोगशालाओं में व्यवहार्य साबित हुई हैं और लागत प्रभावी और बैच प्रभाव मुक्त एकल सेल प्रयोग18,26को चलाने के लिए समाधान प्रदान किए हैं ।

प्रोटोकॉल के माध्यम से जाते समय कुछ कदम ों का सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। एक आदर्श एकल सेल निलंबन में व्यवहार्य कोशिकाओं का 90% होना चाहिए और सेल घनत्व भी एक विशिष्ट श्रेणी27के भीतर होना चाहिए। सेलुलर समुचेग़ा, मलबे और फाइबर की उपस्थिति को कम करने के लिए कोशिकाओं की एक अच्छी गुणवत्ता प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। सेलुलर एग्रीगेट्स का नमूना मल्टीप्लेक्सिंग पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है और बूंद पैदा करने वाली मशीन17को रोकना संभावित जोखिम होता है । आम तौर पर, एक 30-40 μm सेल छलनी बड़े झुरमुट और मलबे को हटाने के लिए आदर्श है, जबकि सेल के नमूनों के संरक्षण क्योंकि ज्यादातर कोशिकाओं को अलग होने के बाद 30 μm से नीचे हटना होगा । यदि सेल व्यास 30 माइक्रोन से बड़ा है तो एकल सेल नाभिक का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। प्रारंभिक भ्रूणीय चरणों में, माउस कोशिकाओं के सभी प्रकार के लिए सेल का आकार 30 μm से छोटा होना चाहिए । हालांकि, बाद के चरणों में, दिल में कार्डियोमायोसाइट्स, मस्तिष्क में न्यूरॉन्स, अंगों में मांसपेशियों की कोशिकाएं, और कुछ वसा कोशिकाओं में 30 माइक्रोन से बड़ा कोशिका आकार हो सकता है। एकल कोशिका प्रयोग शुरू करने से पहले कोशिकाओं के इन प्रकार के लिए सेल आकार मापा जाना चाहिए।

मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियां लागत प्रभावी तरीके से बड़ी संख्या में नमूनों का विश्लेषण करने का एक तरीका प्रदान करती हैं। इसके अलावा, एक साथ कई नमूनों की प्रोफाइलिंग करके, हम बैच प्रभावों से काफी बच सकते हैं और सेल डबल्स की पहचान कर सकते हैं। ये फायदे सिंगल सेल फील्ड के लिए काफी आकर्षक होंगे। हालांकि, कुछ कारक हैं जो उनके उपयोग को सीमित कर सकते हैं। चूंकि एक ही प्रयोग में अधिक कोशिकाओं को मल्टीप्लेक्स किया जाता है, इसलिए सेल डबल रेशियो भी बढ़ेगा। हालांकि मल्टीप्लेक्सिंग बारकोड डेटा का विश्लेषण करके उन डबल्स की पहचान की जा सकती है और उन्हें हटाया जा सकता है, लेकिन इससे अनुक्रमण की एक बड़ी बर्बादी होगी । इसके अलावा, के रूप में और अधिक कोशिकाओं को एक साथ जमा कर रहे हैं, कोशिकाओं को तोड़ने के लिए आसान कर रहे है और परिवेश mRNA, जो कोशिकाओं के साथ बूंदों में कब्जा कर लिया जाएगा और पता लगाने संवेदनशीलता के साथ हस्तक्षेप की वृद्धि का कारण । हम उम्मीद कर रहे हैं कि प्रायोगिक कार्यप्रवाह या बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण पाइपलाइन के आगे अनुकूलन निकट भविष्य में इन दो मुद्दों को हल करेगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ जेवी जे गार्टनर लैब से डेविड एम पैटरसन और क्रिस्टोफर एस मैकगिनिस को लिपिड आधारित बारकोडिंग रिएजेंट्स और प्रायोगिक कदमों और डेटा विश्लेषण पर सुझावों की अपनी तरह की आपूर्ति के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम की स्थापना राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एचएलएल1347202) ने की थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Tween-20 Bio-Rad 1610781
10x Chip Holder 10x Genomics 120252 330019
10x Chromium Controller 10x Genomics 120223
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250 230003
10x Vortex Adapter 10x Genomics 330002, 120251
10x Vortex Clip 10x Genomics 120253 230002
4200 TapeStation System Agilent G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 25 nmol
Buffer EB Qiagen 19086
CD1 mice Chales River Strain Code 022 ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R Appendorf 2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns 10x Genomics 1000073 Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10x Genomics 120262 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns 10x Genomics 1000094 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 10x Genomics 1000095 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads 10x Genomics 2000059 Store at -80 °C
Collagenase A Sigma/Millipore 10103578001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B Sigma/Millipore 11088807001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL Eppendorf 022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL Eppendorf 022431048
Dynabeads MyOne SILANE 10x Genomics 2000048 Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet Theromo Scientific 12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) Sigma E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Fisher Scientific 26140079 Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl Theromo Scientific 4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl Theromo Scientific 4661000N
Flowmi Cell Strainer Sigma BAH136800040 Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) BioLegend 422301 Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA) Fisher Scientific A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) Fisher Scientific NC0295239 Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090-015
MasterCycler Pro Eppendorf 950W
Nuclease-Free Water (Ambion) Thermo Fisher Scientific AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium Corning Cellgro 21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) Sigma-Aldrich SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes Fisher Scientific 05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) Beckman Coulter B23318 (60ml)
Template Switch Oligo 10x Genomics 3000228 Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3 satijalab https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody BioLegend 155801 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody BioLegend 155803 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody BioLegend 155805 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher Scientific 25200-056
Universal I5 Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol

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References

  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).
  22. SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).
  23. Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).
  24. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 155 एकल सेल एमआरएनए-अनुक्रमण माउस भ्रूणीय ऊतक हृदय विकास मल्टीप्लेक्स बारकोड डी-मल्टीप्लेक्सिंग डेटा विश्लेषण
माउस भ्रूण कोशिकाओं के मल्टीप्लेक्स एकल सेल mRNA अनुक्रमण विश्लेषण
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Feng, W., Przysinda, A., Li, G.… More

Feng, W., Przysinda, A., Li, G. Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells. J. Vis. Exp. (155), e60647, doi:10.3791/60647 (2020).

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