Summary

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Published: January 07, 2020
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Summary

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Abstract

La secuenciación de ARNm de una sola célula ha hecho progresos significativos en los últimos años y se ha convertido en una herramienta importante en el campo de la biología del desarrollo. Se ha utilizado con éxito para identificar poblaciones de células raras, descubrir nuevos genes marcadores y decodificar información espacial y temporal del desarrollo. El método de una sola célula también ha evolucionado de la tecnología Fluidigm C1 basada en microfluidos a las soluciones basadas en gotas en los últimos dos o tres años. Aquí usamos el corazón como ejemplo para demostrar cómo perfilar las células del tejido embrionario del ratón usando el método scRNA-Seq basado en gotas. Además, hemos integrado dos estrategias en el flujo de trabajo para generar perfiles de varias muestras en un solo experimento. Utilizando uno de los métodos integrados, hemos perfilado simultáneamente más de 9.000 células de ocho muestras de corazón. Estos métodos serán valiosos para el campo de la biología del desarrollo al proporcionar una manera rentable de perfilar simultáneamente células individuales de diferentes orígenes genéticos, etapas de desarrollo o ubicaciones anatómicas.

Introduction

El perfil transcripcional de cada célula individual varía entre las poblaciones celulares durante el desarrollo embrionario. Aunque la hibridación molecular in situ única se puede utilizar para visualizar la expresión de un pequeño número de genes1, la secuenciación de ARNm de una sola célula (scRNA-Seq) proporciona un enfoque imparcial para ilustrar los patrones de expresión de genes en todo el genoma en células individuales. Después de su publicación por primera vez en 20092, scRNA-Seq se ha aplicado para estudiar múltiples tejidos en múltiples etapas de desarrollo en los últimos años3,4,5. Además, a medida que el atlas de células humanas ha lanzado recientemente sus proyectos centrados en el desarrollo, se espera que en un futuro próximo se generen más datos de células únicas de tejidos embrionarios humanos.

El corazón como el primer órgano en desarrollarse desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario. El corazón consta de varios tipos de células y el desarrollo de cada tipo de célula está estrechamente regulado temporal y espacialmente. En los últimos años, el origen y el linaje celular de las células cardíacas en las primeras etapas del desarrollo se han caracterizado6,que proporcionan una tremenda herramienta de navegación útil para la comprensión de la patogénesis congénita de enfermedades cardíacas, así como para el desarrollo de métodos más tecnológicamente avanzados para estimular la regeneración de cardiomiocitos7.

El scRNA-Seq ha experimentado una rápida expansión en los últimos años8,9,10. Con los métodos recién desarrollados, el diseño y análisis de experimentos de una sola célula se ha vuelto más alcanzable11,12,13,14. El método presentado aquí es un procedimiento comercial basado en las soluciones de gotas (ver Tabla de Materiales)15,16. Este método cuenta con la captura de células y conjuntos de cuentas con código de barras única en una gota de emulsión aceite-agua bajo el control de un sistema de controlador microfluídico. La velocidad de carga de celdas en las gotas es extremadamente baja, por lo que la mayoría de las emulsiones de gotas contienen solo una celda17. El ingenioso diseño del procedimiento proviene de la separación de una sola célula en emulsiones de gotas que ocurren simultáneamente con la codificación de barras, lo que permite el análisis paralelo de células individuales utilizando ARN-Seq en una población heterogénea.

La incorporación de estrategias de multiplexación es una de las adiciones importantes al flujo de trabajo de una sola célula tradicional13,14. Esta adición es muy útil para desechar los dobletes celulares, reducir los costos experimentales y eliminar los efectos por lotes18,19. Una estrategia de codificación de barras basada en lípidos y una estrategia de codificación de barras basada en anticuerpos (ver Tabla de Materiales)son los dos métodos de multiplexación utilizados principalmente. Los códigos de barras específicos se utilizan para etiquetar cada muestra en ambos métodos, y las muestras etiquetadas se mezclan para la captura de una sola celda, la preparación de la biblioteca y la secuenciación. Después, los datos de secuenciación agrupados se pueden separar analizando las secuencias de códigos de barras (Figura 1)19. Sin embargo, existen diferencias significativas entre los dos métodos. La estrategia de codificación de barras basada en lípidos se basa en oligonucleótidos modificados con lípidos, que no se ha encontrado que tenga ninguna preferencia de tipo de célula. Mientras que la estrategia de codificación de barras basada en anticuerpos sólo puede detectar las células que expresan las proteínas antígeno19,20. Además, se tarda unos 10 minutos en manchar los lípidos, pero 40 minutos para manchar los anticuerpos(Figura 1). Además, los oligonucleótidos modificados con lípidos son más baratos que los oligonucleótidos conjugados con anticuerpos, pero no están disponibles comercialmente en el momento de escribir este artículo. Por último, la estrategia basada en lípidos puede multiplexar 96 muestras en un solo experimento, pero la estrategia basada en anticuerpos actualmente solo puede multiplexar 12 muestras.

El número de celda recomendado para multiplexar en un solo experimento debe ser inferior a 2,5 x 104, de lo contrario, conducirá a un alto porcentaje de dobletes celulares y una posible contaminación del ARNm ambiental. A través de las estrategias de multiplexación, el costo de captura de una sola célula, generación de ADNc y preparación de bibliotecas para múltiples muestras se reducirá al costo de una muestra, pero el costo de secuenciación seguirá siendo el mismo.

Protocol

El procedimiento animal está de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh (IACUC). 1. Disección embrionaria del corazón del ratón y preparación de la suspensión de una sola célula NOTA: Este paso podría tardar unas horas dependiendo del número de embriones para diseccionar. Para adquirir corazones embrionarios E18.5, eutanasia un ratón CD1 embarazada por administración de CO2. Ut…

Representative Results

En este estudio, utilizamos el corazón embrionario de ratón como ejemplo para exhibir cómo se realizó la secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexada para procesar las diferentes muestras de partes separadas de un órgano simultáneamente. Los corazones del ratón E18.5 CD1 fueron aislados y diseccionados en la aurícula izquierda (LA), la aurícula derecha (RA), el ventrículo izquierdo (LV) y el ventrículo derecho (RV). Las células auriculares y ventriculares fueron des…

Discussion

En este estudio, hemos demostrado un protocolo para analizar perfiles transcripcionales de una sola célula. También hemos proporcionado dos métodos opcionales para multiplexar muestras en el flujo de trabajo scRNA-Seq. Ambos métodos han demostrado ser factibles en varios laboratorios y han proporcionado soluciones para ejecutar un experimento de una sola célula rentable y libre de efectos por lotes18,26.

Hay algunos pasos que debe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a David M. Patterson y Christopher S. McGinnis del laboratorio Dr. Zev J. Gartner por su amable suministro de los reactivos de codificación de barras basados en lípidos y sugerencias sobre los pasos experimentales y el análisis de datos. Este trabajo fue fundado por los Institutos Nacionales de Salud (HL13347202).

Materials

10% Tween-20 Bio-Rad 1610781
10x Chip Holder 10x Genomics 120252 330019
10x Chromium Controller 10x Genomics 120223
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250 230003
10x Vortex Adapter 10x Genomics 330002, 120251
10x Vortex Clip 10x Genomics 120253 230002
4200 TapeStation System Agilent G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 25 nmol
Buffer EB Qiagen 19086
CD1 mice Chales River Strain Code 022 ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R Appendorf 2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns 10x Genomics 1000073 Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10x Genomics 120262 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns 10x Genomics 1000094 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 10x Genomics 1000095 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads 10x Genomics 2000059 Store at -80 °C
Collagenase A Sigma/Millipore 10103578001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B Sigma/Millipore 11088807001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL Eppendorf 022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL Eppendorf 022431048
Dynabeads MyOne SILANE 10x Genomics 2000048 Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet Theromo Scientific 12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) Sigma E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Fisher Scientific 26140079 Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl Theromo Scientific 4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl Theromo Scientific 4661000N
Flowmi Cell Strainer Sigma BAH136800040 Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) BioLegend 422301 Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA) Fisher Scientific A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) Fisher Scientific NC0295239 Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090-015
MasterCycler Pro Eppendorf 950W
Nuclease-Free Water (Ambion) Thermo Fisher Scientific AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium Corning Cellgro 21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) Sigma-Aldrich SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes Fisher Scientific 05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) Beckman Coulter B23318 (60ml)
Template Switch Oligo 10x Genomics 3000228 Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3 satijalab https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody BioLegend 155801 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody BioLegend 155803 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody BioLegend 155805 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher Scientific 25200-056
Universal I5 Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol

References

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Cite This Article
Feng, W., Przysinda, A., Li, G. Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells. J. Vis. Exp. (155), e60647, doi:10.3791/60647 (2020).

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