Summary

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

Published: January 07, 2020
doi:

Summary

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

Abstract

단 세포 mRNA 염기서열 분석은 지난 몇 년 동안 중요한 진전을 이루었으며 발달 생물학 분야에서 중요한 도구가 되었습니다. 그것은 성공적으로 희귀 한 세포 집단을 식별 하는 데 사용 되었습니다., 새로운 마커 유전자를 발견, 공간 및 시간 개발 정보를 디코딩. 단일 셀 방법은 또한 지난 2 ~ 3 년 동안 미세 유체 기반 Fluidigm C1 기술에서 액적 기반 솔루션으로 진화했습니다. 여기에서 우리는 액적 기반 scRNA-Seq 방법을 사용하여 마우스 배아 조직 세포를 프로파일업하는 방법을 입증하기 위해 예를 들어 심장을 사용했다. 또한 워크플로우에 두 가지 전략을 통합하여 단일 실험에서 여러 샘플을 프로파일로 프로파일합니다. 통합된 방법 중 하나를 사용하여 8개의 심장 샘플에서 9,000개 이상의 세포를 동시에 프로파일화했습니다. 이 방법은 다른 유전 적 배경, 발달 단계 또는 해부학 적 위치에서 단일 세포를 동시에 프로파일러딩하는 비용 효율적인 방법을 제공함으로써 발달 생물학 분야에 가치가있을 것입니다.

Introduction

각 단하나 세포의 전사 단면도는 배아 발달 도중 세포 인구 사이에서 변화합니다. 단일 분자가 소수의 유전자1의발현을 시각화하는데 사용될 수 있지만, 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq)은 단일 세포에서 유전자의 게놈 전체 발현 패턴을 예시하는 편견없는 접근법을 제공한다. 2009년에 처음 발표된 후2,scRNA-Seq는 최근 몇 년 동안다발성발달 단계에서 다중 조직을 연구하기 위해3,4,5. 또한, 인간 세포 아틀라스가 최근 발달 중심 프로젝트를 시작함에 따라 인간 배아 조직에서 더 많은 단일 세포 데이터가 가까운 장래에 생성 될 것으로 예상됩니다.

개발하는 첫번째 기관으로 심혼은 배아 발달에 있는 중요한 역할을 합니다. 심혼은 다중 세포 모형으로 이루어져 있고 각 세포 모형의 발달은 단단히 시간적으로 그리고 공간적으로 통제됩니다. 지난 몇 년 동안, 초기 발달 단계에서 심장 세포의 기원과 세포 혈통은 선천성 심장 질환 병인을 이해하는 데 엄청난 유용한 탐색 도구를 제공하는6을특징으로하며, 심근 세포 재생을 자극하는 보다 기술적으로 진보 된 방법을 개발하기위한7.

scRNA-Seq는 최근8,9,10에서급속한 확장을 겪고있다. 새로 개발 된 방법으로, 단일 세포 실험의 설계 및 분석은 더 달성될 11,12,13,14. 여기서 제시된 방법은 액적 용액에 기초한 상업적 절차(재료표참조)15,16. 이 방법은 미세 유체 제어 기제어 시스템의 제어하에 오일-물 에멀젼 액적에 고유한 바코드 비드 세트를 캡처하는 기능을 제공합니다. 액적으로 의한 세포 로딩속도는 매우 낮기 때문에 대부분의 액적 에멀젼은 하나의셀(17)만을함유하고 있다. 절차의 독창적 인 디자인은 이질적인 집단에 RNA-Seq를 사용하여 개별 세포의 병렬 분석을 가능하게하는 바코드와 동시에 발생하는 액적 에멀젼으로 단일 세포 분리에서 비롯됩니다.

멀티플렉싱 전략의 편입은 기존의 단일 셀워크플로우(13,14)에중요한 추가 사항 중 하나이다. 이 추가는 셀 더블을 폐기하고, 실험 비용을 절감하고, 배치 효과18,19를제거하는 데 매우 유용합니다. 지질 기반 바코드 전략 및 항체 기반 바코드 전략(재료 표참조)은 주로 사용되는 두 가지 다중화 방법입니다. 특정 바코드는 두 가지 방법으로 각 샘플에 라벨을 부착하는 데 사용되며, 표지된 샘플은 단일 셀 캡처, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위해 혼합됩니다. 그 후, 풀링된 시퀀싱 데이터는 바코드 시퀀스를 분석하여 분리될 수있다(도 1)19. 그러나 두 메서드 간에는 상당한 차이가 있습니다. 지질 기반 바코드 전략은 지질 변형 올리고뉴클레오티드를 기반으로 하며, 이는 어떤 세포 유형 선호도가 없는 것으로 밝혀졌다. 항체 기반 바코드 전략은 항원 단백질을 발현하는 세포만을 검출할 수 있는반면,20. 또한, 지질을 염색하는 데 약 10분이 걸리지만 항체를 염색하는 데는 40분이 걸린다(도1). 더욱이, 지질 변형 올리고뉴클레오티드는 항체-컨쥬게이팅된 올리고뉴클레오티드보다 저렴하지만 이 기사를 쓰는 시점에서 시판되지 않는다. 마지막으로, 지질 기반 전략은 한 실험에서 96개의 샘플을 다중화할 수 있지만, 항체 기반 전략은 현재 12개의 샘플만 멀티플렉스할 수 있다.

단일 실험에서 멀티플렉스에 대한 권장 세포 수는 2.5 x 104보다낮아야 하며, 그렇지 않으면 세포 배더의 높은 비율과 잠재적인 주변 mRNA 오염으로 이어질 것이다. 멀티플렉싱 전략을 통해 단일 세포 캡처, cDNA 생성 및 여러 샘플에 대한 라이브러리 준비 비용은 하나의 샘플 비용으로 감소되지만 시퀀싱 비용은 동일하게 유지됩니다.

Protocol

동물 절차는 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라. 1. 마우스 배아 심장 해부 및 단세포 현탁액 준비 참고: 이 단계는 해부할 배아의 수에 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. E18.5 배아 심장을 획득하려면,CO2 투여에 의해 임신한 CD1 마우스를 안락사시한다. 면도기를 사용하여 복부 부위의 원치 않는 모발을 제거하고 70% ?…

Representative Results

이 연구에서, 우리는 다중화 된 단일 세포 mRNA 염기서열 분석이 기관의 별도의 부분에서 다른 샘플을 동시에 처리하기 위해 수행된 방법을 전시하기 위해 예로 마우스 배아 심장을 사용했습니다. E18.5 CD1 마우스 하트는 좌측 심방(LA), 우측 심방(RA), 좌심실(LV) 및 우심실(RV)으로 분리및 해부되었다. 심방 및 심실 세포는 지질 기반 바코드 절차를 사용하여 독립적으로 바코드?…

Discussion

본 연구에서, 우리는 단일 세포 전사 프로파일을 분석하는 프로토콜을 입증했다. 우리는 또한 scRNA-Seq 워크플로우에서 멀티플렉스 샘플에 두 가지 선택적 방법을 제공했습니다. 두 방법 모두 다양한 실험실에서 실현 가능한 것으로 입증되었으며 비용 효율적이고 배치 효과가없는 단일 세포 실험18,26을실행하는 솔루션을 제공했습니다.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 지질 기반 바코드 시약의 종류 공급과 실험 단계 및 데이터 분석에 대한 제안에 대한 박사 Zev J. Gartner 실험실에서 데이비드 M. 패터슨과 크리스토퍼 S. 맥기니스 에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 설립 되었다 (HL13347202).

Materials

10% Tween-20 Bio-Rad 1610781
10x Chip Holder 10x Genomics 120252 330019
10x Chromium Controller 10x Genomics 120223
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250 230003
10x Vortex Adapter 10x Genomics 330002, 120251
10x Vortex Clip 10x Genomics 120253 230002
4200 TapeStation System Agilent G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 25 nmol
Buffer EB Qiagen 19086
CD1 mice Chales River Strain Code 022 ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R Appendorf 2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns 10x Genomics 1000073 Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10x Genomics 120262 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns 10x Genomics 1000094 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 10x Genomics 1000095 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads 10x Genomics 2000059 Store at -80 °C
Collagenase A Sigma/Millipore 10103578001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B Sigma/Millipore 11088807001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL Eppendorf 022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL Eppendorf 022431048
Dynabeads MyOne SILANE 10x Genomics 2000048 Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet Theromo Scientific 12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) Sigma E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Fisher Scientific 26140079 Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl Theromo Scientific 4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl Theromo Scientific 4661000N
Flowmi Cell Strainer Sigma BAH136800040 Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) BioLegend 422301 Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA) Fisher Scientific A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) Fisher Scientific NC0295239 Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090-015
MasterCycler Pro Eppendorf 950W
Nuclease-Free Water (Ambion) Thermo Fisher Scientific AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium Corning Cellgro 21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) Sigma-Aldrich SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes Fisher Scientific 05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) Beckman Coulter B23318 (60ml)
Template Switch Oligo 10x Genomics 3000228 Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3 satijalab https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody BioLegend 155801 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody BioLegend 155803 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody BioLegend 155805 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher Scientific 25200-056
Universal I5 Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol

References

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Cite This Article
Feng, W., Przysinda, A., Li, G. Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells. J. Vis. Exp. (155), e60647, doi:10.3791/60647 (2020).

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