Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering analyse av Mouse embryonale celler

Published: January 7, 2020 doi: 10.3791/60647
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Her presenterte vi en multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering metode for å profil genuttrykk i musen embryonale vev. Dråpe BAS ert enkelt celle mRNA sekvensering (scRNA-SEQ) metode i kombinasjon med multipleksing strategier kan profilen enkeltceller fra flere prøver samtidig, som i betydelig grad reduserer reagens kostnader og minimerer eksperimentelle satsvise effekter.

Abstract

Enkelt celle mRNA sekvensering har gjort betydelige fremskritt i de siste årene, og har blitt et viktig verktøy innen utviklingspsykologi biologi. Det har blitt brukt til å identifisere sjeldne celle populasjoner, oppdage romanen markør gener, og dekode romlige og timelige utviklingsmessige informasjon. Den enkle celle metoden har også utviklet seg fra den mikrovæskebasert baserte Fluidigm C1-teknologien til dråpe-baserte løsninger i de siste to til tre år. Her har vi brukt hjertet som et eksempel for å demonstrere hvordan å profil musen embryonale vev celler ved hjelp av dråpe basert scRNA-SEQ metode. I tillegg har vi integrert to strategier i arbeidsflyten for å profil flere prøver i et enkelt eksperiment. Ved hjelp av en av de integrerte metodene, har vi samtidig profilert mer enn 9 000 celler fra åtte hjerte prøver. Disse metodene vil være verdifulle for utviklingsbiologi feltet ved å tilby en kostnadseffektiv måte å samtidig profil enkeltceller fra ulike genetiske bakgrunner, utviklingsmessige stadier, eller anatomiske steder.

Introduction

Den transcriptional profilen til hver enkelt celle varierer mellom celle populasjoner under embryoutvikling. Selv om enkelt molekylær in situ-hybridisering kan brukes til å visualisere uttrykk for et lite antall gener1, gir én celle mRNA sekvensering (ScRNA-SEQ) en upartisk tilnærming for å illustrere uttrykks mønstre av gener i hele Genova i enkeltceller. Etter at den først ble publisert i 20092, scRNA-SEQ har blitt brukt til å studere flere vev på flere utviklingsmessige stadier i de siste årene3,4,5. Også, som den menneskelige cellen Atlas har lansert sin utviklingsmessige-fokuserte prosjekter nylig, er mer enkelt celledata fra menneskelig embryonale vev forventes å bli generert i nær fremtid.

Hjertet som første organ for å utvikle spiller en avgjørende rolle i embryoutvikling. Hjertet består av flere celletyper og utviklingen av hver celle type er strengt regulert timelig og romlig. I løpet av de siste årene, opprinnelse og celle avstamning av CARDIAC celler på tidlige utviklingsmessige stadier har vært preget6, som gir en enorm nyttig navigeringsverktøy for å forstå medfødt hjertesykdom patogenesen, samt for å utvikle mer teknologisk avanserte metoder for å stimulere cardiomyocyte regenerering7.

ScRNA-SEQ har gjennomgått en rask ekspansjon de siste årene8,9,10. Med de nyutviklede metodene har design og analyse av enkelt celle eksperimenter blitt mer oppnåelig11,12,13,14. Metoden som presenteres her er en kommersiell prosedyre basert på dråpe-løsningene (se tabell over materialer)15,16. Denne metoden har å fange celler og sett med unikt Barcoded perler i en olje-vann emulsjon dråpe under kontroll av en mikrovæskebasert Controller system. Hastigheten på celle lasting i dråpene er ekstremt lav, slik at flertallet av dråpe emulsjoner inneholder bare en celle17. Prosedyren er genial design kommer fra enkelt celle separasjon i dråpe emulsjoner forekommende samtidig med barcoding, som muliggjør parallell analyse av individuelle celler ved hjelp av RNA-SEQ på en heterogen befolkning.

Innlemmelse av multipleksing strategier er en av de viktigste tilleggene til den tradisjonelle enkelt celle arbeidsflyten13,14. Dette tillegg er svært nyttig i å forkaste celle doublets, redusere eksperimentelle kostnader, og eliminere batch effekter18,19. En lipid basert barcoding strategi og et antistoff basert barcoding strategi (se tabell av materialer) er de to mest brukte multipleksing metoder. Spesifikke strekkoder brukes til å merke hvert utvalg i begge metodene, og de merkede eksemplene blandes deretter for enkelt celle henting, biblioteks forberedelser og sekvenser. Etterpå kan de grupperte sekvensering dataene skilles ved å analysere strekkode sekvensene (figur 1)19. Det finnes imidlertid betydelige forskjeller mellom de to metodene. Den lipid basert barcoding strategien er basert på lipid-modifisert oligonukleotider, som ikke har blitt funnet å ha noen celle type preferanser. Mens antistoff-baserte barcoding-strategien bare kan oppdage cellene som uttrykker antigen-proteinene19,20. I tillegg tar det ca 10 min å flekk på lipider men 40 min å beis antistoffer (figur 1). Videre er lipid-modifiserte oligonukleotider billigere enn antistoff-bøyd oligonukleotider, men ikke kommersielt tilgjengelig på tidspunktet for å skrive denne artikkelen. Til slutt, lipid-basert strategi kan multiplex 96 prøver i ett eksperiment, men antistoff-basert strategi for tiden bare kan multiplex 12 prøver.

Det anbefalte celle nummeret for å multiplex i et enkelt eksperiment bør være lavere enn 2,5 x 104, ellers vil det føre til en høy andel av celle doublets og potensiell ambient mRNA-forurensning. Gjennom multipleksing strategier, kostnaden for enkelt celle fangst, cDNA generasjon, og biblioteket forberedelse for flere prøver vil bli redusert til kostnadene for en prøve, men sekvensering kostnadene vil forbli den samme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyret prosedyren er i samsvar med University of Pittsburgh institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).

1. Mouse embryonale hjerte disseksjon og enkelt celle suspensjon forberedelse

Merk: dette trinnet kan ta noen timer, avhengig av antall embryo å analysere.

  1. For å tilegne seg E 18.5 embryonale hjerter, euthanize en gravid CD1 mus av CO2 administrasjon. Bruk en barberhøvel til å fjerne uønsket hår i mageområdet og desinfisere huden med 70% etanol.
  2. Skjær huden på magen ved hjelp sterilisert saks og nøye analysere embryo ut og raskt sette dem inn i kaldt fosfat-bufret saltvann (PBS) på isen.
  3. Isoler hjerter fra hvert enkelt embryo nøye i en 10 cm rett fylt med kald PBS under et stereoskopisk mikroskop ved hjelp av pinsett og saks.
    Merk: Hold de fire kamrene intakt ved å dissekere lungene med hjertet sammen og ikke direkte fangst/trekke hjertet med Kirurgiske instrumenter.
  4. Overfør ~ 10 hjerter inn i en ny 10 cm parabol fylt med kaldt PBS og mikro-analysere hjertene i venstre Atrium, høyre Atrium, venstre ventrikkel, og høyre ventrikkel.
    Merk: Dette antas å gi mer enn 1 x 106 celler fra hver prøve. Vi anbefaler å starte med minst 1 x 105 celler per prøve.
  5. Overfør hver av de 4 kammeret vev til en 1,5 mL rør og hogge dem i stykker ved hjelp av saks. Sentrifuger på 300 x g for 3 min for å samle inn vev.
  6. Etter aspirating av supernatanten, tilsett 1 mL 0,25% Trypsin/EDTA til hvert rør og ruge i et vannbad på 37 ° c i 10 min. Pipet opp og ned forsiktig 7-8 ganger ved hjelp av en P1000 pipette.
  7. Hvis den embryonale scenen er eldre enn E 11.5, tilsett 1 mL 10 mg/mL kollagenase A/B-blanding og ruge ved 37 ° c for 10-20 min. Pipet forsiktig opp og ned til de fleste cellene er dissosiert.
  8. Overfør cellene til et 15 mL rør og tilsett 8 mL Hank ' s balanserte saltløsning (HBSS) for å fortynne enzymene. Snurr ned cellene ved 300 x g i 5 min. suspendere cellene i 1 ml PBS og overføre dem til en 1,5 ml tube. Filtrer cellene ved hjelp av en celle sil i 40 μm.
  9. Ta 15 μL volum fra hver prøve og bland med samme mengde 0,04% trypan blå. Last inn dette på et celle opptellings kammer, og Tell cellene i en celle teller.
    Merk: for å generere høykvalitets resultater anbefales celle levedyktighet å være høyere enn 95%.

2. enkelt celle multipleksing barcoding

Merk: dette trinnet tar minst 40 min som varierer basert på antall prøver behandlet. Et rent benk område behandlet med RNase rensing løsning er nødvendig for pre-forsterkning trinn (trinn 2,11 til 3,11), og en egen ren benk område er nødvendig for post-forsterkning trinn (trinnene etter 3,11).

  1. Lipid basert barcoding prosedyre (valgfri prosedyre 1)
    1. Basert på celle konsentrasjon, holde mindre enn 5 x 105 celler per prøve. Sørg for at celle fjæringen er fri for rusk og celle aggregater.
    2. Forbered 2 μM anker/Barcode lagerløsning og 2 μM co-anchor lagerløsning for hver prøve (tabell 1).
      Merk: ankeret og co-anker var vennlig begavet av Dr. Zev J. Gartner Lab. Å syntetisere disse lipid-modifiserte oligonukleotider, ble DNA-sekvenser bøyd med fettsyrer på en solid støtte og renset ved reversert-fase høy ytelse flytende kromatografi (HPLC)18,19.
    3. Vask cellene to ganger med PBS og samle cellene på 300 x g i 5 min. suspendere celler i 180 ΜL av PBS.
    4. Tilsett 20 μL av anker/strekkode lagerløsning og Pipetter opp og ned forsiktig for å blande. Ruge på isen i 5 min.
    5. Tilsett 20 μL av co-anchor lagerløsning og pipette opp og ned forsiktig for å blande, så ruge på isen for ytterligere 5 min.
    6. Tilsett 1 mL kald PBS med 1% BSA og sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Vask minst 2 ganger med iskald 1% BSA i PBS.
    7. Kombiner alle prøvene sammen og Filtrer gjennom 40 μm-siler. Telle cellene og holde cellen suspensjon på isen for å bruke i del 3.
  2. Antistoff BAS ert barcoding prosedyre (valgfri prosedyre 2)
    1. Sentrifuger 1 x 106-2 x 106 celler for hver prøve (fra trinn 1,8) ved 300 x g i 5 min og suspendere dem i 100 μL av farge buffer (tabell 1) i 1,5 ml lav bind rør.
    2. Tilsett 10 μL FC-blokkerende reagens-og ruge i 10 minutter ved 4 ° c.
    3. Klargjør antistoffer (se tabell over materialer) ved sentrifugering ved 14 000 x g i 10 min ved 2-8 ° c.
    4. Tilsett 1 μg av hvert oligo antistoff for å 50 μL av cellefarge buffer for å lage antistoff farge løsning20. Tilsett en antistoff farge løsning på hvert prøverør. Ruge i 30 min ved 4 ° c.
    5. Vask celler 3 ganger med 1 mL PBS, spinn i 5 min ved 350 x g ved 4 ° c.
    6. Pool alle prøvene til ønsket proporsjoner i 1 mL farge buffer, spin i 5 min ved 350 x g ved 4 ° c.
    7. Resuspend celler i PBS ved passende konsentrasjon (opptil 1 500 celler/μL) og filter celler gjennom en 40 μm celle sil. Gå umiddelbart videre til neste trinn.

3. dråpe generasjon og mRNA omvendt transkripsjon

Merk: dette trinnet tar ca 90 min for en multiplekset reaksjon.

  1. Likevekt gel perlene (se tabell over materialer) til romtemperatur i 30 min. Ta ut reagenser fra gel-in-emulsjon (GEMs) Kit (se tabell over materialer) og oppbevar dem ved angitt temperatur.
  2. Monter chip B i en chip holder (se tabell over materialer).
  3. Dispensere 75 μL av 50% glyserol i de ubrukte brønnene i rad 1; 40 til μL i rad 2; 280 til μL i rad 3. Ikke Legg glyserol i noen utvinning brønner på den øverste raden av brikken.
  4. Forbered Master Mix på isen i henhold til tabell 1. Legg passende volum av celle fjæring og nuklease vann for å mestre mix i henhold til en celle suspensjon volum kalkulator tabell17 og forsiktig pipette blandingen. Dispensere 75 μL av celle blandingen i midten nederst på prøve brønnen i rad 1 uten å innføre bobler.
  5. Vortex gel perler for 30 s ved hjelp av en Vortex adapter og langsomt dispensere 40 μL av gel perler i bunnen midten av gel perle brønnen i rad 2 uten å innføre bobler.
    Merk: det er viktig å vente 30 s mellom å legge celler og gel perler for å unngå fukting svikt.
  6. For partisjonering oljebrønn i rad 3, dispensere 280 μL av partisjonering olje gjennom sideveggen av brønnen.
    Merk: lasting mindre enn 270 μL av partisjonering olje vil føre til unormal GEMs generasjon.
  7. Fest pakningen på brikken, ikke trykk ned på pakningen og holde den horisontal for å unngå fukting av pakningen.
  8. Legg den sammensatte brikken med pakningen i krom kontrolleren og kjøre krom enkelt celle B program (se tabell over materialer), umiddelbart videre til neste trinn når programmet er ferdig.
  9. Ta chip ut og kast pakningen. Brett lokket tilbake for å avdekke brønner på 45 °, Sjekk væskenivået for å sikre at ingen tresko er til stede.
  10. Langsomt aspirer 100 μL av edelstener fra de laveste punktene i utvinningen godt og sjekke ensartethet av GEMs. Dispensere GEMs inn i en ny polymerase kjedere reaksjon (PCR) tube på is med pipette tips mot sideveggen av røret.
    Merk: Hvis overflødig vandig lag er observert, er det foreslått å re-klargjøre prøvene. Viktigere, ta et bilde av blandingen når GEMs er fortsatt i pipette tips. Dette bildet kan se om det er en fukting svikt, delvis emulgert edelstener, og reagens tresko. Fotografiet kan også brukes som bevis for å få refusjon fra reagens selskapet med erstatnings reagenser og-brikker.
  11. Sett røret i en termisk cycler og utføre omvendt transkripsjon prosedyre (tabell 2).
    Merk: Stopp her eller gå videre til neste trinn. PCR-produktet kan oppbevares ved-20 ° c i opptil en uke.

4. cDNA forsterkning

Merk: dette trinnet tar ca 150 min.

  1. Post enkelt celle omvendt transkripsjon opprydding
    1. Ta ut cDNA forsterkning reagenser fra GEMs Kit (se tabell over materialer) og holde dem på deres indikerte temperatur.
    2. Tilsett 125 μL av gjenvinnings middel i prøven ved romtemperatur for å få en bifasisk blanding. Ingen ugjennomsiktig væske bør observeres og unngå pipettering eller virvlingen blandingen.
    3. Etter å ha ventet på 60 s, Fjern langsomt 125 μL av utvinnings middel fra bunnen av røret.
    4. Vortex de magnetiske perlene (se tabell over materialer) grundig for 30 s og umiddelbart bruke den til å forberede perler opprydding blanding (tabell 1). Reagenser bør legges til sekvensielt som oppført.
    5. Vortex perlene opprydding blandingen og tilsett 200 μL til prøven. Pipetter blandingen 10 ganger og ruge den i 10 min ved romtemperatur.
    6. Legg til reagensene sekvensielt som listet opp i tabell 1 for å klargjøre eluering løsningen og eluere cDNA som følger.
      1. Plasser prøvene på magneten (høy posisjon) (se tabell over materialer) til løsningen tømmes, og fjern deretter supernatanten.
      2. Tilsett 200 μL av 80% etanol til pellet. Vent 30 s, og deretter fjerne etanol.
      3. Gjenta trinn 4.1.6.2 for ytterligere 2 ganger. Sentrifuger kort og plasser på magneten (lav posisjon). Forsiktig fjerne de resterende etanol og lufttørke i mindre enn 2 min.
        Merk: ikke overstige lufttørking forbi 2 min, ellers vil eluering effektivitet reduseres.
      4. Fjern prøven fra magneten. Tilsett 35,5 μL av eluering oppløsning og pipette for å blande 15 ganger. Ruge 2 min ved romtemperatur.
      5. Plasser prøven på magneten (høy posisjon) til løsningen tømmes. Overfør 35 μL av prøven til en ny slange strimmel.
        Merk: denne rensing prosedyren brukes også i trinn 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5,8, 6.1.10, og 6.2.6. Vær oppmerksom på konsentrasjonen av magnetiske perler og volumet av EB buffer/ultrarent vann som brukes til å eluere prøvene på hvert trinn.
    7. Kvantifisere størrelsen, konsentrasjonen og integriteten til eluert cDNA ved hjelp av et automatisert elektroforese instrument21 (se tabell over materialer) (figur 2).
  2. Forsterkning av cDNA
    1. cDNA forsterkning ved hjelp av lipid-baserte barcoding strategi (valgfri prosedyre 1)
      1. Forbered forsterkning reaksjons blanding (tabell 1) på is.
      2. Legg til forsterkningen reaksjonsblandingen til 35 μL av cDNA prøver (fra trinn 4.1.6.7). Pipetter blandingen, og sentrifuger kort. Ruge blandingen i en termisk cycler etter cDNA forsterknings prosedyre (tabell 2).
      3. Etter virvlingen grundig, tilsett 120 μL av Velg reagens og 100 μL av ultrarent vann til 100 μL av prøve for å få en 0,6 x konsentrasjon av valgt reagens (se tabell over materialer). Pipetter blandingen i 15 ganger.
      4. Ruge i 5 minutter ved romtemperatur og plasser deretter prøven på magneten til løsningene blir tydelige.
        Merk: endogene cDNA i perlene brøk og multipleksing Barcoded cDNA er i supernatanten.
      5. Overfør supernatanten til en 1,5 mL lav bind rør for multipleksing Barcoded cDNA biblioteket konstruksjon på trinn 6,1.
      6. Rengjør endogene cDNA ved å følge trinnene i 4.1.6 og eluere dem med 40 μL av EB-buffer.
      7. Kjør 1 μL av renset cDNA-prøve på et automatisert elektroforese instrument (se tabell over materialer) for å analysere/kvantifisere cDNA.
      8. Alikvot 10 μL av cDNA i et nytt PCR rør for endogene biblioteket konstruksjon.
        Merk: Stopp her eller gå videre til neste trinn. Den resterende prøven kan lagres i-20 ° c i opptil 4 uker for å generere flere biblioteker om nødvendig.
    2. cDNA forsterkning i antistoff-basert barcoding strategi (valgfri prosedyre 2)
      1. Tilsett 2 pmol av HTO og ADT tilsetnings primer og 15 μL av cDNA primere til 50 μL av forsterkning reaksjons blanding (tabell 1) og utføre cDNA forsterkning med cDNA forsterkning prosedyre (tabell 2).
      2. Bruk 0,6 x Velg reagens for å skille endogene cDNA (perler brøk) og multipleksing strekkode cDNA (i supernatanten). Husk å lagre supernatanten for å utføre barcoding bibliotek konstruksjon i trinn 6,2.
      3. Rens og eluere den endogene transkripsjon cDNA ved å følge trinnene i 4.1.6, utføre kvalitetskontroll (QC) av bibliotekene og alikvot 10 μL i en ny PCR tube for endogene biblioteket konstruksjon.

5. endogene transkripsjon biblioteket forberedelse

Merk: dette trinnet tar ca 120 min.

  1. Hold Gene Expression biblioteket konstruksjon reagenser fra biblioteket Kit (se tabell over materialer) ved den indikerte temperatur, henholdsvis.
  2. Forbered fragmentering blanding (tabell 1) på is, pipette å mikse og sentrifuger kort.
  3. Tilsett 25 μL EB-buffer på 10 μL renset cDNA-prøve (fra trinn 4.2.1.8 eller 4.2.2.3) og legg deretter til den nylig tilberedte, 15 μL fragmentering i prøven, Pipetter blandingen 15 ganger på is og sentrifuge kort.
  4. Overfør prøven til en forhånds kjølt termisk cycler og start PCR-programmet for fragmentering, slutt reparasjon og A-Tailing (tabell 2).
  5. Vortex Velg reagens for å suspendere magnetiske perler og suksessivt bruke 0,6 x og 0,8 x velge reagenser for å lage en tosidig størrelse utvalg i henhold til brukerhåndboken17,22. Bruk 50 μL av EB-buffer til å eluere DNA-en.
  6. Forbered adapter ligation blanding (tabell 1), deretter Pipetter blandingen grundig og sentrifuger kort.
  7. Tilsett 50 μL av adapter ligation blanding til 50 μL av prøve, Pipetter Mix igjen for 15 ganger og sentrifuge kort. Utfør adapter ligation i henhold til protokollen i en termisk cycler (tabell 2).
  8. Bruk 0,8 x Velg reagens for å rense det ligation produktet og eluere renset prøven med 30 μL av EB buffer (se trinn 4.1.6).
  9. Forbered eksempel indeksen PCR-blanding (tabell 1) og tilsett 60 μL i renset prøven. Tilsett 10 μL av prøve indeks på prøven, Pipetter blandes opp og ned for 5 ganger og sentrifuge kort, ruge i en termisk cycler etter eksempel indeks protokollen (tabell 2).
    Merk: Stopp her eller gå videre til neste trinn. Hvis det brukes mer enn én brønn, velger du én bestemt eksempel indeks (se tabell over materialer) for hver brønn. Husk å registrere indeksen ID brukes for hver brønn og sikre ingen overlapping i en multiplekset sekvensering kjøre.
  10. Suksessivt bruker 0,6 x og 0,8 x velge reagenser for å lage en tosidig størrelse utvalg å erverve 35 μL av renset endogene cellulære bibliotek DNA17.
  11. QC den endogene mobilnettet biblioteket før sekvensering (figur 2).

6. utarbeidelse av multipleksing eksempel strekkode cDNA Libraries

Merk: dette trinnet tar minst 120 min.

  1. Eksempel på generering av strekkode bibliotek for lipid-basert multipleksing-strategien (valgfri prosedyre 1)
    1. Tilsett 520 μL av Velg reagens og 360 μL av isopropanol for å prøve strekkode cDNA fra trinn 4.2.1.5 for å få en 3,2 x Velg reagens konsentrasjon. Pipetter blandingen 10 ganger og ruge ved romtemperatur i 5 min.
    2. Plasser røret på et magnetisk stativ og vent til løsningen er klar. Kast deretter supernatanten.
    3. Bruk 500 μL av 80% etanol for å vaske perlene to ganger på en magnet og vent 30 s etter hver vask.
    4. Kort sentrifuger perlene og plasser på en magnet. Fjern de resterende etanol med en P10 micropipette og la perler i 2 min.
    5. Fjern slangen fra magnet stativet og resuspend perlene i 50 μL av EB-bufferen. Pipet opp og ned for å blande godt. Ruge ved romtemperatur i 2 min.
    6. Returner røret til en magnet og vent til løsningen er klar. Overfør supernatanten (eksempel strekkode cDNA) til et nytt PCR-rør. Vær forsiktig så du ikke overføre noen perler.
    7. Kvantifisere konsentrasjonen av prøven strekkode cDNA23.
    8. Forbered lipid strekkode biblioteket blanding (tabell 1), tilsett 3,5 ng av renset Barcoded cDNA (fra trinn 6.1.6) og nuklease vann for et samlet volum på 50 μL.
    9. Oppbevar den i en termisk cycler etter lipid-baserte strekkode biblioteket PCR (tabell 2).
    10. Bruk 1,6 x til å velge reagens for å rense PCR-produktet og eluere DNA med 25 μL av EB-buffer (se trinn 4.1.6).
    11. Kvantifisere biblioteket konsentrasjon ved hjelp av en høy følsomhet DNA analysemetode24 fra den første fortynning av 1:5 (figur 2).
  2. Eksempel på generering av strekkode bibliotek for den antistoff-baserte multipleksing strategien (valgfri prosedyre 2)
    1. Legg ytterligere 1,4 x reaksjons volum av Velg reagens til supernatanten som inneholder prøve strekkoder ervervet fra trinn 4.2.2.3 for å få en 2x Velg reagens ratio.
    2. Vask perlene med 80% etanol ved å følge trinnene i 4.1.6 og eluere Barcoded cDNA med ultrarent vann.
    3. Utfør utvalgs protokollen med 2x Velg reagens for andre gang og eluere ved hjelp av ultrarent vann.
    4. Forbered antistoff strekkode bibliotek blanding (tabell 1), og tilsett 45 μL av renset Barcoded cDNA fra det siste trinnet.
    5. Ruge i en termisk cycler etter antistoff strekkode biblioteket PCR (tabell 2)20.
    6. Bruk 1,6 x Velg reagens for å rense PCR-produktet og eluere den renset prøven med 30 μL av ultrarent vann (se trinn 4.1.6).

7. bibliotek sekvensering

Merk: flere neste generasjons sekvensering plattformer som HiSeq 4000 og NovaSeq kan brukes til å sekvens den endogene transkripsjon bibliotekene og multipleksing strekkode bibliotekene.

  1. Bruk en neste generasjons sekvensering plattform av valget for å sekvens den endogene transkripsjon bibliotekene og multipleksing strekkode bibliotekene.
  2. Fortynne bibliotekene i henhold til anbefalingene fra en ekspert på en sekvensering selskap eller sekvensering anlegget. Minimum 20 000 leser per celle er anbefalt for den endogene transkripsjon biblioteket og 3000 leser for strekkode bibliotekene.

8. data analyse

Merk: de-multiplex sekvensering data ved hjelp av Sky-baserte ressursen BaseSpace eller ved å kjøre bcl2fastq-pakken på en UNIX-server.

  1. Endogene transcriptome dataanalyse
    1. Med fastq data generert fra demultiplexing programvare, kjøre "mkfastq" på kommersielt tilgjengelig dataanalyse rørledning (se tabell over materialer) for å ytterligere Demultiplex hver GEMs strekkode.
    2. Kjør "Count" for å utføre justering, filtrering, strekkode telling, og UMI telling.
    3. Hvis du vil, kan du kjøre "aggr" for å samle flere sekvenser baner fra et enkelt eksperiment.
    4. Bruk "celle Browser" (se tabell over materialer) for å visualisere data, klynge celler, identifisere differensielt uttrykt gener, og generere tSNE eller genuttrykk heatmap tomter.
    5. Du kan også bruke en godt vedlikeholdt R-basert plattform25 (se tabell over materialer) for å normalisere og skalere data, identifisere differensielt uttrykte gener, og generere tSNE/UMAP plott og genuttrykk heatmaps (Figur 3).
  2. Multipleksing strekkodedata analyse
    1. Analyse av data fra lipid basert barcoding strategi
      1. Bruk den kommersielt tilgjengelige dataanalyse rørledningen eller deMULTIplex R-pakken (https://GitHub.com/Chris-McGinnis-UCSF/multi-SEQ) for å konvertere eksempel strekkode FASTQ-filene til en prøve strekkode UMI Count-matrise.
      2. Last inn strekkoden UMI Count Matrix sammen med endogene transcriptome data til en R-basert plattform (se tabell over materialer) for integrasjons analyse (Figur 3).
    2. Analyse av data fra antistoff-basert barcoding strategi
      1. Bruk "Count" fra den kommersielt tilgjengelige dataanalyse rørledningen for å tilordne strekkodene ved å tilby CSV-filen for biblioteket og hashtag-funksjonen for funksjons referanse.
      2. Last output enhetlig funksjonen-strekkode matrise, som inneholder genuttrykk teller sammen funksjonen strekkode teller for hver celle strekkode, til en R-basert plattform for nedstrøms analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne studien, brukte vi musen embryonale hjertet som et eksempel for å vise hvordan multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering ble utført for å behandle de forskjellige prøvene fra separate deler av et organ samtidig. E 18.5 CD1 mus hjerter ble isolert og dissekert i venstre Atrium (LA), høyre Atrium (RA), venstre ventrikkel (LV) og høyre ventrikkel (RV). Den atrieflimmer og ventrikkel celler ble deretter Barcoded uavhengig ved hjelp av en lipid-baserte barcoding prosedyre og blandes sammen før GEMs generasjon og omvendt-transkripsjon. Skjematisk oversikt er vist i figur 1. Vi kvantifisert cDNA-konsentrasjonen før bibliotek konstruksjonen (figur 2A). En av forskjellene i å utføre multiplekset scRNA-SEQ fra standard scRNA-SEQ er at den endogene cDNA biblioteket og prøven strekkode cDNA biblioteket ble kjøpt separat etter cDNA forsterkning og rensing (trinn 4.2.1 og 4.2.2.2). De to bibliotekene ble også kvalifisert i vårt eksperiment (figur 2B, C). Neste generasjons sekvensering og dataanalyse ble utført etterfulgt av biblioteket konstruksjon og QC.

Vi brukte HiSeqX plattform til å sekvens begge bibliotekene i samme sekvensering kjørefelt. Med sekvensering data, vi først skilte den endogene transkripsjon data og strekkodedata ved hjelp av BaseSpace programmet. Da vi analysert strekkode uttrykk i hver enkelt celle og fant 8 grupper av enkeltceller som unikt uttrykker en type strekkode, som representerer celler fra 8 forskjellige prøver (Figur 3A). I tillegg har vi også funnet ut at noen celler ikke uttrykker noen strekkode, som vi definerte som negative celler, og noen celler uttrykker to forskjellige strekkoder, som representerer doublets (Figur 3B). Oppsummert fant vi at rundt 70% av cellene er singleter, 25% av cellene er negative og 5% av cellene er doublets.

Med de singlet cellene kan vi utføre ytterligere nedstrøms analyser for å forstå de cellulære heterogenitet og molekylære forskriftene. De potensielle analysene kan være celle type merknad (Figur 4A), Novel/sjelden celle type identifikasjon (Figur 4B), anatomisk sone sammenlignende analyse (Figur 4C), og Gene ontologi veien analyse som celle syklus fase separasjoner (Figur 4D).

Figure 1
Figur 1: multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering arbeidsflyt. Embryonale dagen 18,5 scenen hjerter ble analysert ved hjelp av en multiplekset dråpe-basert enkelt celle sekvensering prosedyre. RT = omvendt transkripsjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: REPRESENTATIVE QC-resultater på forskjellige trinn. (A) QC-analyse av cDNA fra trinn 4.1.7. Mål fragment størrelsen er 200 til 9000 BP. (B) endogene biblioteket og (C) Barcode biblioteket ble analysert med et automatisert elektroforese instrument. Målet fragment størrelse for endogene biblioteket er 300-600 BP, og strekkode biblioteket DNA størrelse er rundt 172 BP. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Demultiplexing den sekvensering data fra lipid basert barcoding strategi. (A) uten tilsyn analyse av strekkode uttrykket. X-aksen representerer enkeltceller, og y-aksen representerer strekkoder. Hver av de 8 enkelt celle populasjoner ble identifisert å unikt uttrykke en av de 8 strekkoder. Merk noen celler uttrykker mer enn én strekkode, og noen celler uttrykker ingen strekkoder. (B) t-sne plott av singlet celler, doublet celler, og negative celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: avansert analyse av enkelt celle transcriptional data. (A-D) Enkelt celledata kan analyseres på forskjellige måter for å forstå de cellulære heterogenitet og molekylære veiene. Vi har listet opp flere applikasjoner her som eksempler. Enkeltceller ble lastet inn i en R-pakke for å identifisere celletyper (A), sjeldne celle populasjoner (B), celle anatomiske soner (C) og celle syklus faser (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Navn på blanding Sammensetning
Kollagenase blanding 10 mg/mL kollagenase A og 10 mg/mL kollagenase B, oppløst i HBSS + + med 40% FBS.
2 μM anker/strekkode lagerløsning Bland 50 μM-anker og 10 μM strekkode tråd i 1:1 molar-forhold i PBS (uten FBS eller BSA) for et total volum på 25 μL.
2 μM co-anchor lagerløsning Fortynne 1 μL 50 μM co-anchor med 24 μL PBS (uten FBS eller BSA).
Farge buffer PBS inneholder 2% BSA, 0,01% mellom 20
Master blanding 20 μL RT reagens, 3,1 μL oligo, 2 μL reduksjonsmiddel B, 8,3 μL RT enzym C.
Perler opprydding blanding 182 μL oppryddings buffer, 8 μL reagens utvalg, 5 μL reduksjonsmiddel B, 5 μL Nuklease-fritt vann.
Forsterkning reaksjon blanding 1 μL av 10 μM lipid-merket tilsetnings primer, 15 μL cDNA primer, 50 μL amp Mix
Eluering løsning 98 μL buffer EB, 1 μL 10% mellom 20, 1 μL reduksjonsmiddel B.
Fragmentering blanding 5 μL fragmentering buffer, 10 μL fragmentering enzym.
Adapter ligation blanding 20 μL ligation buffer, 10 μL DNA-Ligase, 20 μL adapter oligos.
Eksempel indeks PCR-blanding 50 μL amp mix, 10 μL SI primer
Lipid strekkode bibliotek blanding 26,25 μL av 2 × varm start master mix, 2,5 μL av 10 μM RPIX primer, 2,5 μL av 10 μM TruSeq Universal adapter primer (se tabell over materialer)
Antistoff strekkode bibliotek blanding 50 μL av 2 × varm start master mix, 2,5 μL av 10 μM RPIX primer, 2,5 μL av 10 μM P5-smart-PCR hybrid oligo

Tabell 1: reagens blandinger som brukes i protokollen.

Incubating prosedyre Temperatur(1) Tid
GEM-RT Inkubasjons Lokk temperatur 53 ° c
Trinn 1 53 ° c 45 min
Trinn 2 85 ° c 5 min
Trinn 3 4 ° c Holde
10x Genomics cDNA forsterkning Lokk temperatur 105 ° c
Trinn 1 98 ° c 3 min
Trinn 2 98 ° c 15 s
Trinn 3 63 ° c 20 s
Trinn 4 72 ° c 1 min
Trinn 5 Gjenta trinn 2 til 4 for 12 sykluser totalt (2)
Trinn 6 72 ° c 1 min
Trinn 7 4 ° c Holde
Bibliotek konstruksjon Lokk temperatur 65 ° c
Pre-Cool blokk 4 ° c Holde
Fragmentering 32 ° c 5 min
Slutt reparasjon og A-Tailing 65 ° c 30 min
Holde 4 ° c Holde
Adapter ligation Lokk temperatur 30 ° c
Trinn 1 20 ° c 15 min
Trinn 2 4 ° c Holde
Eksempel indeks PCR Lokk temperatur 105 ° c
Trinn 1 98 ° c 45 s
Trinn 2 98 ° c 20 s
Trinn 3 54 ° c 30 s
Trinn 4 72 ° c 20 s
Trinn 5 Gjenta trinn 2 til 4 for 12 sykluser totalt (3)
Trinn 6 72 ° c 1 min
Trinn 7 4 ° c Holde
Lipid strekkode bibliotek PCR
Trinn 1 95 ° c 5 min
Trinn 2 98 ° c 15 s
Trinn 3 60 ° c 30 s
Trinn 4 72 ° c 30 s
Trinn 5 Gjenta trinn 2 til 4 for 10 sykluser totalt (4)
Trinn 6 72 ° c 1 min
Trinn 7 4 ° c Holde
Antistoff strekkode bibliotek PCR
Trinn 1 95 ° c 3 min
Trinn 2 95 ° c 20 s
Trinn 3 60 ° c 30 s
Trinn 4 72 ° c 20 s
Trinn 5 Gjenta trinn 2 til 4 for 8 sykluser totalt (5)
Trinn 6 72 ° c 5 min
Trinn 7 4 ° c Holde

Tabell 2: incubating prosedyren som brukes i protokollen. (1) Vær oppmerksom på de forskjellige lokk temperaturen som brukes i hver prosedyre. (2) Angi total syklus numre i henhold til celle belastningen: 13 sykluser for < 500-celle belastning; 12 sykluser for 500-6000 celle belastning; 11 sykluser for > 6000 celle belastning. (3) Angi total syklus numre i henhold til cDNA-inngangen: 14-16 sykluser for 1-25 ng cDNA; 12-14 sykluser for 25-150 ng cDNA; 10-12 sykluser for 150-500 ng cDNA; 8-10 sykluser for 500-1000 ng cDNA; 6-8 sykluser for 1000-1500 ng cDNA. (4) Angi total syklus numre i henhold til cDNA-inngangen: 8-12 sykluser. (5) Angi total syklus numre i henhold til cDNA-inngangen: 6-10 sykluser.

Lipid basert barcoding Oligonukleotider
Forankre LMO 5 '-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGGTAACGATCCAGCTGTCACT-lipid-3 '
Co-anchor LMO 5 '-lipid-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-3 '
Strekkode oligo 5 '-CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNNNA30-3 '
Lipid barcoding additiv primer 5 '-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3 '
RPIX primer 5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCC
TTGGCACCCGAGAATTCCA-3 '
Universell adapter primer 5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCT-3 '
Antistoff-basert barcoding Oligonukleotider
Antistoff barcoding oligo 5 '-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN
NNBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA * A-3 '
HTO additiv primer 5 '-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC-3 '
ADT tilsetningsstoff primer 5 '-CCTTGGCACCCGAGAATTCC-3 '
P5-smart-PCR hybrid oligo 5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTGTCCGCGGAA
GCAGTGGTATCAACGCAGAGT * A * C-3 '

Tabell 3: oligonukleotid sekvenser som brukes i denne protokollen. N = strekkode eller indeks sekvens; * = Phosphorothioate obligasjon

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien har vi demonstrert en protokoll for å analysere enkelt celle transcriptional profiler. Vi har også gitt to valgfrie metoder for å multiplex prøver i scRNA-SEQ arbeidsflyt. Begge metodene har vist seg å være gjennomførbart på ulike laboratorier og gitt løsninger for å kjøre en kostnadseffektiv og batch effekt-gratis enkelt celle eksperiment18,26.

Det er noen skritt som bør følges nøye når du går gjennom protokollen. En ideell enkelt celle suspensjon bør ha > 90% av levedyktige celler og celle tettheten bør også være innenfor et bestemt område27. Det er viktig å få en god kvalitet på celler for å minimere tilstedeværelsen av cellulære aggregater, rusk og fibre. Cellulære aggregater har negativ innvirkning på prøve multipleksing og har en potensiell risiko for å tette dråpe produksjons maskinen17. Generelt sett, en 30-40 μm celle sil er ideell for å fjerne store klumper og rusk og samtidig bevare celleprøver fordi de fleste cellene vil krympe under 30 μm etter dissosiasjon. Enkelt cellekjerner anbefales å bruke i stedet hvis celle diameteren er større enn 30 μm. Ved tidlig embryonale stadier, bør cellestørrelsen for alle typer muse celler være mindre enn 30 μm. Men på senere stadier, cardiomyocytes i hjertet, neurons i hjernen, muskelceller i lemmer, og noen fett celler kan ha en Cellestørrelse større enn 30 μm. Cellestørrelse bør måles for disse typer celler før du starter enkelt celle eksperimenter.

Multipleksing strategiene gir en mulighet til å analysere et stort antall prøver samtidig på en kostnadseffektiv måte. I tillegg, ved profilering flere prøver sammen, kan vi i betydelig grad unngå batch effekter og identifisere celle doublets. Disse fordelene vil være svært attraktivt for enkelt celle feltet. Det er imidlertid noen faktorer som kan begrense bruken. Ettersom flere celler er multiplekset i et enkelt eksperiment, vil også celle doublet forholdet øke. Selv om disse doublets kan identifiseres og fjernes ved å analysere multipleksing strekkodedata, vil det føre til en stor sløsing med sekvensering leser. I tillegg, ettersom flere celler er gruppert sammen, er cellene lettere å bryte og forårsake en økning av ambient mRNA, som vil bli fanget inn i dråper med celler og forstyrre gjenkjennings følsom heten. Vi forventer at ytterligere optimalisering av eksperimentell arbeidsflyt eller bioinformatikk analyse rørledning vil løse disse to problemene i nær fremtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker David M. Patterson og Christopher S. McGinnis fra Dr. Zev J. Gartner Lab for deres type tilførsel av lipid baserte barcoding reagenser og forslag på eksperimentelle trinn og dataanalyse. Dette arbeidet ble grunnlagt av National Institutes of Health (HL13347202).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Tween-20 Bio-Rad 1610781
10x Chip Holder 10x Genomics 120252 330019
10x Chromium Controller 10x Genomics 120223
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250 230003
10x Vortex Adapter 10x Genomics 330002, 120251
10x Vortex Clip 10x Genomics 120253 230002
4200 TapeStation System Agilent G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 25 nmol
Buffer EB Qiagen 19086
CD1 mice Chales River Strain Code 022 ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R Appendorf 2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns 10x Genomics 1000073 Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10x Genomics 120262 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns 10x Genomics 1000094 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 10x Genomics 1000095 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads 10x Genomics 2000059 Store at -80 °C
Collagenase A Sigma/Millipore 10103578001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B Sigma/Millipore 11088807001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL Eppendorf 022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL Eppendorf 022431048
Dynabeads MyOne SILANE 10x Genomics 2000048 Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet Theromo Scientific 12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) Sigma E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Fisher Scientific 26140079 Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl Theromo Scientific 4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl Theromo Scientific 4661000N
Flowmi Cell Strainer Sigma BAH136800040 Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) BioLegend 422301 Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA) Fisher Scientific A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) Fisher Scientific NC0295239 Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090-015
MasterCycler Pro Eppendorf 950W
Nuclease-Free Water (Ambion) Thermo Fisher Scientific AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium Corning Cellgro 21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) Sigma-Aldrich SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes Fisher Scientific 05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) Beckman Coulter B23318 (60ml)
Template Switch Oligo 10x Genomics 3000228 Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3 satijalab https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody BioLegend 155801 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody BioLegend 155803 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody BioLegend 155805 0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher Scientific 25200-056
Universal I5 Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).
  22. SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).
  23. Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).
  24. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).

Tags

Utviklingsmessige Biology enkelt celle mRNA-sekvensering mus embryonale vev hjerte utvikling multiplex strekkode de-multipleksing dataanalyse
Multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering analyse av Mouse embryonale celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, W., Przysinda, A., Li, G.… More

Feng, W., Przysinda, A., Li, G. Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells. J. Vis. Exp. (155), e60647, doi:10.3791/60647 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter