Summary
我们提出了鸡胆膜模型作为替代的，可移植的，体内模型，用于妇科和泌尿细胞系和患者衍生肿瘤的移植。
Abstract
小鼠模型是体内癌症研究的基准测试。然而，成本、时间和道德方面的考虑导致了对替代体内癌症模型的呼吁。鸡胆膜 （CAM） 模型提供了一种廉价、快速的替代方案，允许直接可视化肿瘤发育，并适用于体内成像。因此，我们寻求开发一个优化的协议，将妇科和泌尿肿瘤移植到这个模型中，我们在这里介绍。受精后约7天，空气细胞移动到卵子的血管侧，在壳中形成开口。然后，来自鼠和人体细胞系和原发组织的肿瘤可以移植。这些通常播种在细胞外基质和介质的混合物，以避免细胞分散，并提供营养支持，直到细胞招募血管供应。然后，肿瘤在卵子孵化前可能再长14天。通过植入用萤火虫荧光素酶稳稳地转导的细胞，生物发光成像可用于敏感检测膜上的肿瘤生长和整个胚胎的癌细胞。该模型可能用于研究肿瘤原性、入侵、转移和治疗效果。与传统的鼠种模型相比，鸡CAM模型需要的时间和财政资源要少得多。由于卵子具有免疫功能低下和免疫耐受性，任何生物体的组织都有可能被植入，而无需植入人体组织所需的昂贵的转基因动物（如小鼠）。然而，该模型的许多优点也可能有局限性，包括肿瘤生成时间短和免疫功能低下/免疫耐受状态。此外，虽然这里呈现的所有肿瘤类型在鸡胆膜模型中，它们这样做与肿瘤生长的程度不同。
Introduction
老鼠是研究人类疾病（包括恶性肿瘤）的经典模型有机体。作为哺乳动物，它们与人类有许多相似之处。它们的遗传相似性很高，使得转基因操作小鼠基因组提供了对人类疾病基因控制的巨大洞察力。在小鼠的处理和实验方面拥有丰富的经验，因此它们成为生物医学研究的首选模式。然而，除了伦理和科学的关注，关于鼠模型，他们也可以是相当昂贵和耗时2，3。肿瘤的发展可能需要数周甚至数月的时间。仅在一个典型的机构的住房可以运行在数百到数千美元，而肿瘤正在发展。卵巢癌是这个缺点的一个例子，因为它在鼠模型中的生长很容易需要几个月。研究进展的延迟可能会影响卵巢癌患者持续低的5年生存率只有47%（即，在30年内只增加10%的存活率）4。同样，泌尿癌（肾癌、前列腺癌和膀胱癌）占美国所有癌症病例的19%，占癌症相关死亡的11%4。因此，研究妇科和泌尿癌的新型体内方法可以节省实验室大量的时间、人力和资金，即使这种模式只应用于最初的筛选实验。此外，由此带来的研究结果的加速可能对每年被诊断患有这些癌症的177，000人产生重大影响。
鸡CAM模型提供了许多优势，解决上述问题。研究血管生成5，6，肿瘤细胞入侵7，8，和转移7，9，小鸡胚胎CAM模型已经用于研究多种形式的癌症，包括胶质瘤10，11，12，头颈部鳞状细胞癌13，14，白血病15，16，胰腺癌17，结肠直肠癌18。此外，CAM模型已经生成神经母细胞瘤19，伯基特淋巴瘤20，黑色素瘤21，和猫纤维肉瘤22。先前的研究也提出了膀胱癌23和前列腺癌细胞系24的移植，但协议细节有限。鸡蛋不仅比老鼠便宜得多，而且能产生高度可重复的结果25，26。它们显示血管发育迅速，肿瘤移植可在几天内发生，并通过打开的窗口纵向可视化。卵子受精和孵化之间的21天时间，实验可以在几周内完成。此外，成本低、住房需求有限、面积小，很容易进行大型实验，使小鼠研究望而却步。
因此，我们寻求优化CAM模型，用于妇科和泌尿癌的移植。由于早期鸡胚胎27的免疫功能低下，小鼠和人体细胞都可以轻松植入。因此，我们已经成功地移植了卵巢癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌。对于每种肿瘤类型，CAM 欣然接受已建立的小鼠和/或人类肿瘤细胞系。重要的是，新收获的原发性人类肿瘤组织也可以从消化细胞或固体组织碎片中移植，成功率高。每种癌症类型和细胞源都需要优化，我们在这里分享。
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Protocol
此处介绍的所有实验都经过加州大学洛杉矶分校 （UCLA） 相关道德委员会的审查和批准。UCLA 机构审查委员会已批准使用非识别的初级人类肿瘤（协议编号 17-000037、17-001169 和 11-001363）。在加州大学洛杉矶分校，动物研究委员会审查不需要使用鸡胚胎的实验;仅当卵子孵化时，才需要协议批准。然而，最佳实践，如AVMA动物安乐死指南，被用来处理鸡胚胎的道德和尽可能避免疼痛。在使用 CAM 模型进行研究之前，研究人员应验证其机构的监督要求。
1. 准备鸡蛋
- 在接收鸡蛋之前，按照制造商的说明，将鸡蛋孵化器组装并平衡到 37.8 °C （100 °F）， 湿度为 60-70%。
注：为了将污染风险降至最低，可以使用高压灭水来控制湿度。 - 收到受精后，罗得岛红鸡蛋从经认证的实验室级鸡蛋供应商，用纸巾擦干壳的表面。轻湿纸巾可用于去除粘附材料。立即干燥。
注意：用低于 43.3 °C 的液体润湿外壳会将细菌引入鸡蛋中。如果选择清洗或消毒鸡蛋，液体的温度必须在43.3-48.9°C之间。温度越高，鸡蛋就沸腾了。消毒剂的选择应基于引起关注的微生物。 - 使用铅笔或记号标记在鸡蛋上标记日期。这被视为开发日 0。
- 将卵子放入卵孵化器中，通过旋转孵育至少7天，以允许CAM发育。可使用自动旋转器，或鸡蛋每天旋转180°2-3x。
2. 打开鸡蛋
注：当 CAM 完全发育时，应打开鸡蛋。这通常是在开发第 7 天或第 8 天。
- 用70%乙醇对生物安全柜进行消毒。类似消毒和放入生物安全柜蛋架，蛋烛台，标记，无绳旋转工具与碳化硅研磨石和圆形切割轮，18 G针，移液控制器与四分之一英寸真空管，包装胶带，办公室剪刀、弯曲剪刀、Semken（或类似）钳子、棉球和 6 x 7 厘米透明薄膜敷料。尽可能使用无菌、一次性或高压灭菌工具。
- 关闭鸡蛋旋转器。将大约 1-3 个鸡蛋放入蛋架上的生物安全柜中。在黑暗中，将蛋烛器放在蛋壳上，以识别空气细胞。标记空气单元的位置。
注：来自鸡蛋蜡烛的照明强度对于可视化鸡蛋内部至关重要。如果空气电池或血管始终难以看到，请尝试更换鸡蛋蜡烛电池。 - 将鸡蛋蜡烛移到外壳上，找到一个大型血管网络。如有必要，旋转鸡蛋。理想的血管将在卵子中间附近分枝。使用标记在血管上绘制用于植入的血管。
- 打开引擎盖上的灯。使用装有碳化硅研磨石的无绳旋转工具，在壳体中直接在空气单元中心钻一个小孔。钻，直到大部分外壳已去除，但白色，内膜是完整的。
注：在瞄准血管之前，在空气细胞上钻孔，可以确定空气细胞上特定蛋壳的厚度，而不是通过CAM和血管。如果CAM或血管被打乱，则卵子不能用于植入。 - 钻开另一个小孔，血管窗口将像空气细胞那样打开（步骤 2.4）。
- 使用18G针，轻轻刺穿空气细胞和血管的白色内膜。如果无法穿透外壳，则小心钻多一点。确保整个钻孔区域的白膜（但不是 CAM）被打乱。不需要拆卸膜片。
注：如果 CAM 或血管在此步骤中中断，则丢弃鸡蛋。如果钻孔中出现血液或白蛋白泄漏，则损害明显。 - 关闭发动机罩指示灯。使用鸡蛋蜡烛器，验证空气细胞是否从卵子末端转移到血管上的区域。如有必要，将插入真空管的真空管放在原始空气单元孔周围的移液器控制器中，并在短时间内轻轻施加吸力以移动空气单元。
- 使用标记勾勒出空气单元在空气-CAM 边界内约 0.5 厘米的新位置。在新的空气单元上贴上一块包装胶带。如有必要，使用标准办公室剪刀将胶带修剪到适当的尺寸。
注：胶带可能会干扰通过外壳的气流，并且不应大于完全覆盖空气单元所需的流量。 - 将卵子返回到孵化器以温暖而不旋转，新的空气细胞朝上。重复步骤 2.2-2.9，以便打开剩余的鸡蛋。
注： 协议可能在此处暂停。如果不确定 CAM 开发的质量，则少量鸡蛋应在打开剩余鸡蛋之前通过步骤 2.16 进行。 - 将大约 1-3 个带有重新定位空气单元的鸡蛋放在生物安全柜的蛋架上。
注意：应小心避免在打开的鸡蛋中引入污染。因此，务必在生物安全柜内打开鸡蛋，并尽可能使用无菌工具和设备。 - 使用装有圆形切割轮的无绳旋转工具，在步骤 2.8 中绘制的空气单元边界上切割一条小线。确保在实际空气-CAM 边界内约为 0.5 厘米，以避免干扰 CAM 或血管。完全穿过外壳，但要小心不要深入到破坏CAM或血管。
- 使用弯曲的剪刀，在剩余的空气单元周围剪切，在壳体中创建一个窗口。
注：如果去除的外壳上存在血液或膜，则卵子不适合植入。如果高比例的鸡蛋没有干净地打开，请考虑等待至少1天打开剩余的鸡蛋，以允许更好的CAM形成。如果剩余的卵子的壳没有穿孔，则应恢复孵化器内卵子的旋转。 - 验证胚胎的存活性。可存活的胚胎将表现出广泛的血管、透明白蛋白、胚胎运动或可见的心跳。
- 使用 Semken 钳子，从无菌棉球中拉出小块棉。轻轻涂抹 CAM 表面，以清除壳体灰尘和碎屑。
注：清除碎屑必须在鸡蛋打开的同一天进行。 - 用一块 6 x 7 厘米透明薄膜敷料盖住壳盖。
- 将鸡蛋送回孵化器。确保鸡蛋牢固地坐，打开的窗口朝上，CAM 不接触透明薄膜敷料。使用一块蛋架，鸡蛋旋转器的边缘，或其他合适的项目来支撑任何鸡蛋，继续滚动。
- 重复步骤 2.10-2.16，以便打开所有剩余的鸡蛋。
注：卵子的打开不需要在植入的同一天完成。等待至少1天可以帮助消除鸡蛋的生存能力受到损害，打开外壳。
3. 准备移植癌细胞悬浮液（选项1）
注：这是在植入之前完成的，最好在第7天和第10天之间完成。有关植入日期的更多信息，请参阅步骤 5 或 6 开头的说明。这种方法用于所有细胞系和培养的肾癌肿瘤消化。
- 在冰上解冻细胞外基质溶液。
- 使用机械和/或酶消化，使用适合植入的细胞类型的方法获得单个细胞悬浮液。
- 重新悬浮要植入适当培养基的细胞总数。每个卵子植入1-2 x 106个细胞是典型的。
注：用于植入细胞系的介质通常是用于培养细胞的完整介质，包含FBS或血清替代。肿瘤消化的植入通常使用用于培养相同癌症类型的细胞系的完整培养媒介。但是，如果需要，可以对介质配方进行实验调整。肿瘤发育和生长的影响需要通过经验来确定。 - 使用适合所用细胞的离心机速度和时间对细胞进行颗粒。典型速度为250-300 x g，时间为5-10分钟。
- 通过移液从颗粒细胞中取出上清液。通过轻拂或移液机械地将细胞重新悬浮在残废介质中。放在冰上冷却。使用适当大小的移液测量电池和介质的体积。
- 计算植入体积，使1-2 x 106个细胞植入每个卵子20-100μL的体积中，最终细胞外基质浓度为2.7-4mg/mL蛋白。根据此计算添加培养基、任何所需的生长因子或添加剂以及细胞外基质溶液。保持冰上，直到准备植入。
注：对于步骤 3.3 和 3.6 中的计算，应加入至少半卵植入的额外体积，以确保组内所有卵子的体积充足。用于植入卵巢癌细胞系（即SKOV3和ID8），每个卵子植入106个细胞。用于植入肾细胞癌细胞系RENCA，培养细胞来自消化原发性人肾细胞癌、前列腺癌细胞系（即CWR、C4-2和MyC-CaP）和膀胱癌细胞系（即HT-1376和T24），植入2 x106细胞。
4. 准备肿瘤片植入（选项2）
注：这是在植入之前完成的，最好是发生在第7天到第10天之间。有关植入日期的更多信息，请参阅步骤 5 或 6 开头的说明。原发性卵巢癌和膀胱癌被植入肿瘤片。
- 在冰上解冻细胞外基质溶液。在含有任何所需生长因子或添加剂的适当介质中稀释至最终蛋白质浓度为2.7-4mg/mL。保持冰上。
注：肿瘤片的植入通常使用用于培养相同癌症类型的细胞系的完整培养介质。但是，如果需要，可以对介质配方进行实验调整。肿瘤移植和生长的影响需要从经验上确定。 - 使用手术刀或剪刀，从新鲜肿瘤中切除碎片。理想尺寸在每侧 2-5 mm 之间。保持组织浸入介质中，直到准备植入。
5. 使用不粘环进行植入（选项 1）
注：如果CAM完全开发，细胞可能从开发第7天开始植入。植入可能发生在孵化前的任何时间，允许足够的时间进行肿瘤发育和所需的实验，但请注意，胚胎的免疫细胞开始出现在第10天后受精27。肿瘤的生长率因细胞类型而有很大差异，需要根据感兴趣的细胞类型进行经验确定。卵巢癌和前列腺癌细胞采用不粘环法植入。请注意，当不粘环不可用时，移液尖可能会切割到类似大小并使用。
- 使用 70% 乙醇对生物安全柜和所有必需的工具进行消毒：蛋架、弯曲虹膜钳、不粘环（1/4 英寸内径）、玻璃搅拌棒、适当的体积移液器和吸头、6 x 7 厘米透明薄膜敷料、办公室剪刀以及标记或铅笔。应尽可能使用无菌、一次性或高压灭菌工具。
- 将鸡蛋植入生物安全柜的蛋架上。选择可管理的鸡蛋数量。典型值最多有 6 个。避免让鸡蛋在使用时大幅冷却。
- 将边缘朝打开的窗口滚动，避免拉开外壳，从而从壳体上拆下透明薄膜敷料。检查鸡蛋是可行和健康。理想的鸡蛋将有一个大容器在开放区域的中心与较小的容器从它分支。
- 使用弯曲的虹膜钳，在容器上放置一个无菌的不粘环，最好是在分支点上。使用无菌玻璃搅拌棒轻轻磨蚀 CAM。
- 将细胞悬架从步骤 3.6 移入不粘环的中心。或者，使用钳子将步骤 4.2 中的肿瘤片放入不粘环的中心，并使用步骤 4.1 中生成的 20-50 μL 细胞外基质溶液覆盖。
- 使用一块 6 x 7 厘米透明薄膜敷料密封开口。用适当的植入物标记卵子。
注：对群中的鸡蛋进行编号有助于纵向观察。 - 将鸡蛋返回到孵化器。确保壳的开口直立，鸡蛋是安全的。
注：鸡蛋可以返回卵子孵化器，无需旋转。或者，使用CO2停用的37-38°C细胞培养箱和湿度计监测湿度（应为50%-80%）可获得高植入后生存能力。
6. 无不粘环的植入（选项 2）
注：如果CAM完全开发，细胞可能从开发第7天开始植入。植入可能发生在孵化前的任何时间，允许足够的时间进行肿瘤发育和所需的实验，但请注意，胚胎的免疫细胞开始出现在第10天后受精27。该方法用于植入肾细胞癌细胞和膀胱癌细胞。
- 使用 70% 乙醇对生物安全柜和所有必需的工具进行消毒：适当的体积移液器和吸头、无菌 10 厘米组织培养皿、蛋架、6 x 7 厘米透明薄膜敷料、办公室剪刀和标记。
- 将步骤 3.6 中生成的细胞悬浮液的接种体积吸入适当大小的移液头（200 μL 是典型的）。握住尖端的顶部时，小心地弹出移液器尖端，并水平放入无菌的 10 厘米组织培养盘中。
- 对组内的所有样品重复步骤 6.2，每个组有一个菜。
- 将吸头放入37°C培养箱中15-30分钟，使细胞外基质部分聚合。
- 孵育15分钟后，开始检查聚合。少量液体通常从尖端泄漏到盘子上。这种液体的聚合可用于估计尖端液体的聚合程度。
- 将要植入鸡蛋架的鸡蛋放在生物安全柜中。选择可管理的鸡蛋数量。典型值最多有 6 个。避免让鸡蛋在使用时大幅冷却。
- 将边缘朝打开的窗口滚动，从壳体上拆下透明薄膜修整。这样可以避免拉走外壳碎片。
- 检查鸡蛋是可行和健康。理想的鸡蛋将有一个大容器在开放区域的中心与较小的容器从它分支。
- 将一个移液头放在适当大小的移液管上。按下柱塞，将部分聚合的电池悬架强制在大型、发育良好的容器上，最好是在分支点上。
- 使用一块 6 x 7 厘米透明薄膜敷料密封开口。
- 用适当的植入物标记卵子。
注：对群中的鸡蛋进行编号有助于纵向观察。 - 将鸡蛋返回到孵化器。确保壳的开口直立，鸡蛋是安全的。
注：鸡蛋可以返回专用的卵孵化器，无需旋转。或者，使用CO2停用的37-38°C细胞培养箱和湿度计监测湿度（应为50%-80%）可获得高植入后生存能力。
7. 萤火虫荧光素酶标记肿瘤的生物发光成像
注：如果植入的细胞通过基因编码萤火虫荧光素酶或其他成像因子进行稳定转导，则生成的肿瘤可以使用生物发光成像进行可视化。由于蛋壳的背景很高，因此不建议对完整鸡蛋进行荧光成像。这是端点分析，因为外壳的打开会大大降低存活率。肿瘤可以在任何时候成像，适合实验需要和肿瘤生长的速度。然而，平均而言，卵孵化21天后受精。因此，开发第 18 天是避免不需要的孵化的适当终结点。
- 如有必要，将鸡蛋运送到成像设施。将鸡蛋贴在10厘米的组织培养皿上。将它们返回到 37.8 °C （100 °F） 的鸡蛋孵化器，并消除或停用旋转机制。湿度对运输和成像并不重要。
- 使用弯曲的虹膜钳，轻轻地将 CAM 从外壳上推开，直到 CAM 与白蛋白和胚胎齐平。使用宽尖试样钳，分离外壳的碎片，以充分扩大外壳开口，实现肿瘤可视化。
- 将至少50μL的30mg/mL D-荧光素注射到蛋白蛋白中。在包含植入细胞的区域，也可以将类似体积的D-荧光素移液到不粘环或CAM表面。这确保了在缺乏理想血管供应的情况下实现最佳的生物发光。孵育8分钟。
- 将20-50 μL的胶质注射到鸡蛋的白蛋白中，对卵子进行麻醉。再孵育2分钟。或者，卵子可以放入含有2-2.5%蒸发的半透明胶的感应室。当胚胎运动停止时，获得足够的麻醉深度。
注：较大体积的胶质（100μL）可用于对鸡蛋实施安乐死。 - 使用制造商说明确定的适当设置，将鸡蛋放入生物发光成像设备和图像中。在本研究中，使用1分钟的暴露时间。
- 要成像剩余的CAM和胚胎，打开鸡蛋到10厘米的组织培养盘。
- 用双手的手指抓住鸡蛋，靠近鸡蛋的中间，拇指放在壳开口的两侧。
- 用拇指轻轻拉开鸡蛋的两半，同时用手指轻轻按压鸡蛋。
- 当壳体与CAM和胚胎相距约一半时，将卵子倒置在10厘米的组织培养盘上。
- 继续分离外壳的两半。如果 CAM 粘在壳壳内部，请轻轻地用手指将 CAM 从壳体上推开。
- 如果需要，胚胎可以翻转到另一个菜中。
- 如有必要，可以像步骤 7.4 中那样管理额外的单体。
8. 肿瘤收获
注：肿瘤可随时收获，适合实验需要和肿瘤生长速度。然而，平均而言，卵孵化21天后受精。因此，开发第 18 天是避免不需要的孵化的适当终结点。
- 用钳子抓住肿瘤。使用剪刀（弹簧虹膜剪刀工作良好）或手术刀，小心切除肿瘤从CAM。
- 如果肿瘤已转用萤火虫荧光酶基因，可以进行再成像，以验证难以可视化的肿瘤的成功切除。
注：切除的肿瘤可以通过适合特定实验的任何方法进行分析。肿瘤也可以重新植入CAM或小鼠。为了确认肿瘤身份，肿瘤可以固定，石蜡嵌入，并检查与血氧素和欧辛或免疫组织化学染色。
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Representative Results
到目前为止，我们发现这种植入方法对于卵巢癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌是成功的。每种产品都经过优化，以确定植入的特定条件，尽管可能具有灵活性。在已测试的肿瘤类型中，卵巢癌的生长远没有那么明显，如果没有生物发光成像的帮助，通常不可见（图1）。然而，在植入区域，用钳子可以感觉到CAM的僵硬。这可能有助于确定在缺乏生物发光成像的情况下可能的肿瘤生长，尽管还需要通过方法学或其他合适的方法进行进一步验证。我们成功地移植了人类和鼠细胞系，这些细胞系显示形态与其他体内模型一致（图1A和1B）。此外，肿瘤片的植入是可能的（图1C，蓝色箭头表示肿瘤）。在这种情况下，植入的肿瘤来自一个患有高等级、转移性、卵巢性癌的患者。由此产生的肿瘤在形态上类似于其原产肿瘤，并表达出人类特异性的蛋白质，如细胞角蛋白8/18，很容易允许它们从CAM和鸡胚胎组织分化。
优化肿瘤移植和生长时，在植入时可加入适当的生长因子或激素。例如，在植入时，在ID8细胞中观察到肿瘤大小（以总辐射通量测量）的细微、非显著性增加，当在植入时补充三单位（U）的人类卵泡刺激激素（FSH）时（图1D）。选择FSH促进卵巢癌生长源于ID8细胞中FSH受体的表达，以及绝经后妇女通常发现的高水平FSH，她们占卵巢癌病例的大多数。对于其他难以生长的癌症类型，也可以采用类似的方法，以提高 CAM 模型的效用。此外，FSH仅在细胞植入时添加。补充生长因子或激素可以通过在介质中以适当的间隔将适量的添加剂移入不粘环中来实现，这可以增强效果。
对于肾癌，从已建立的细胞系（如RENCA）植入2 x 106透明细胞肾癌细胞，产生快速、强健的肿瘤形成，但也可以使用较低的细胞剂量（图2A，植入后10天）。由此产生的肿瘤形态类似于通过标准小鼠在体内模型28获得的肿瘤。植入标有萤火虫荧光素酶的RENCA细胞允许生物发光成像。原发性人类肿瘤也可以植入。肿瘤片块持续和招募血管，没有显着增长。然而，从在体外扩张的初级、透明细胞肾癌的消化细胞的植入，其生长方式与已建立的细胞系相似（图2B）。肾细胞癌细胞可以使用不粘环法或无不粘环的方法播种。
多个人类和鼠前列腺癌细胞系被检测为CAM移植（图3）。当使用不粘环植入 2 x 106个细胞时，每个细胞都长得很好。对结果肿瘤进行组织学评估，与每个细胞系的期望一致。此外，植入稳定标有萤火虫荧光酶的细胞，允许通过生物发光成像进行肿瘤识别（图3A）。
膀胱癌是在CAM模型中从已建立的细胞系和原发性人体组织片段中建立的（图4）。当植入2 x 106细胞时，细胞系生长良好，没有不粘环（图4A和4B），尽管植入环是成功的。原发性人类肿瘤可以从组织块中植入（图4C）。所陈述的病例源自一个患有高等级、非肌肉侵入性、泌尿癌的患者。由于肿瘤消化优化，尚未尝试植入消化细胞。由此产生的CAM肿瘤的癌细胞保留了原始肿瘤的形态，但具有改变的基质成分。肿瘤生长小于肾细胞癌和前列腺癌，虽然仍然容易看到。
为了确保在端点有大量可存活的可测定卵子，在孵育和打开卵子时必须小心谨慎。如果孵化条件在植入之前或之后是不理想的，那么胚胎的生存能力可能会受到损害。如果发生重大胚胎死亡，请根据制造商的说明对培养箱条件进行故障排除。根据我们的经验，温度和湿度稳定性似乎比其精确值更重要。因此，我们发现，在经过改造的细胞培养中孵化接种卵子，CO2培养箱比将卵子留在小型专用卵孵化器中具有优越的生存能力，这些孵化器需要更频繁的开口来补充控制湿度的水。尽量减少接种卵子进行肿瘤检查的频率，也可以提高胚胎的生存能力。
CAM 植入的另一个关注点是接种时 CAM 的完整性。如果 CAM 在打开外壳后未完好无损，则不粘环和植入的细胞将沉入胚胎的白蛋白中（参见步骤 2.12 之后的注释）。这会导致癌细胞扩散。一些肿瘤可能仍然形成，但癌症，从邻近的癌细胞，如卵巢癌，接受显着的生长和生存信号，不会可靠地形成肿瘤在这种情况下。如果使用不粘环进行植入，则 CAM 的故障可以通过将环下沉到白蛋白中来识别。这必须与环和植入的细胞通过胚胎运动移动到卵子底部的情况区分开来。在这些情况下，将在 CAM 和壳体底面之间找到环。胚胎运动无法控制。然而，环放置会使胚胎更难破坏植入的细胞。与放置在场中心的环相比，放置在步骤 2.7 生成的气囊边缘的环更有可能被胚胎移动。
图1：卵巢癌的代表性肿瘤发展。成功植入的卵巢癌细胞包括： （A） 人类SKOV3细胞系， （B） 鼠 ID8 细胞系， 和 （C） 原发性肿瘤.代表血氧林和欧辛染色与生物发光成像一起，酌情。对于由植入原发性肿瘤（C）的血氧林和eosin染色引起的CAM肿瘤，包括CAM肿瘤和原发性肿瘤的细胞角蛋白8/18（CK 8/18）染色。第一个面板中的蓝色箭头表示肿瘤。（D） ID8 植入物的肿瘤大小，带和无 3U FSH，计算为生物发光成像产生的总通量（n = 3 表示未经处理，n = 4 用于 FSH 补充）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：透明细胞肾细胞癌的代表性肿瘤发展。因植入 （A） 从消化的人类原发性肿瘤衍生的小鼠肾细胞癌细胞系、 RENCA 或 （B） 培养细胞引起的肿瘤.与切除的肿瘤相邻的测量尺度 （B） 显示 1 mm 标记.（A）和B）中的相应组织学显示血氧素和欧辛染色。在 （A） 中，还显示了萤火虫-荧光酶标记的RENCA细胞的代表性生物发光成像。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：前列腺癌细胞系的代表性肿瘤发育。代表性肿瘤和血氧素和欧辛染色由人类前列腺癌细胞系（A） CWR 和 （B） C4-2 以及小鼠细胞系 （C） MyC-CaP 的植入引起。萤火虫荧光素酶标记CWR细胞产生的肿瘤的生物发光成像显示在（A） 中。与切除的肿瘤相邻的测量刻度显示 1 mm 标记。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：膀胱癌的代表性肿瘤发展。由植入已建立的人类膀胱癌细胞系（A） HT-1376， （B） T24 和 （C） 原发性人类膀胱肿瘤引起的代表性肿瘤.在 （C）， 显示所得 CAM 肿瘤和原发性肿瘤的血氧林和欧辛染色.与切除的肿瘤相邻的测量刻度显示 1 mm 标记。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
使用CAM模型的肿瘤扩张和移植允许比体内动物模型更快速和直接地观察到肿瘤生长。此外，一旦完成设备的初始购买，成本就会大大降低，特别是与免疫功能低下小鼠的成本相比。鸡胚胎的初始免疫功能低下状态很容易允许人体和鼠群组织移植。即使有这些优势，CAM 模型也有局限性。如果有必要进行长期治疗研究，短期可能是有益的，也可能有害。CAM模型的免疫功能低下/免疫耐受状态可能使肿瘤免疫相互作用的研究复杂化。对于这些研究，可能有必要对感兴趣的免疫细胞进行人工植入，可能补充免疫室。此外，尽管我们在CAM模型中呈现了所有肿瘤类型，但它们的生长程度不同。例如，肾细胞癌迅速形成大肿瘤，但卵巢癌肿瘤很难可视化没有生物发光成像的帮助。肿瘤的生长和速度需要评估特定的肿瘤类型，以确定CAM是否将是一个合适的实验模型。
成功的肿瘤移植需要仔细完成协议的具体步骤。首先，卵子需要在理想条件下孵育，以在移植前实现最佳的胚胎存活和CAM形成。由于批次的自然变异性，我们建议从特定的鸡蛋供应商处获得多余的鸡蛋。我们还发现，凉爽、多雨的天气会导致卵子的真菌生长。在潮湿的天气，可能需要更多的鸡蛋被移植，以获得足够的产量在终点。这种季节性变化可能是区域特定的。适当的CAM形成对于成功的肿瘤移植至关重要。不应忽略打开时仍连接到壳体的任何 CAM 迹象。如果几个鸡蛋在打开第一批时没有完整的 CAM，那么我们建议将剩余的鸡蛋的打开时间至少再延长 1 天。
如果获得较差的生存能力或移植，可能有几个步骤是错误的。首先，供应商的胚胎生存能力可能较差。没有空气细胞和可见的血管表明一个不可行的卵子。有时，胚胎运动可以可视化，以确认生存能力。不过，首先，确保新电池在蛋烛台，因为可视化需要强光。浮动测试也可以进行评估的可行性（各种说明和视频可在线获得）。另一种可能的解释是孵化器。使用独立的湿度计和温度计，确保设置准确和稳定。制造商对孵化器的说明应包含详细的故障排除说明，以评估正确的设置。不正确的培养箱设置也可能危及 CAM 的开发。使用胶带和/或标记，确定鸡蛋旋转器是否实际旋转鸡蛋。如果不粘环沉入白蛋白在高比例的移植鸡蛋，那么CAM没有充分发展。最后，我们发现，频繁检查植入卵，导致温度和湿度波动，可能会降低植入后的可行性。如果植入的卵子最初是可行的，但在整个移植期，其生存能力降低，则应减少对卵子的检查频率。生存能力下降的原因也可能在植入后孵化器设置不准确或不当。
当为新单元类型优化此方法时，可以控制多个因子。第一个是单元格编号。我们通常从细胞系植入5 x 105-2 x 106个细胞。植入的肿瘤片通常每侧2-5毫米。这些金额可以调整，以改善移植或大小。然而，我们发现肿瘤生长减少超过一定的阈值，这是细胞类型依赖。其他附加参数包括是否存在不粘环。此选择通常基于环是否会妨碍端点分析，尽管它也可能影响成功移植。不粘环的存在也可能允许以所需的间隔用中等物覆盖新生的移植物，以提高血管招募前的生存率（如果需要的话）。细胞外基质类型、浓度和介质的选择，其中基质被稀释也可能影响移植。增加生长因子或激素可能进一步提高肿瘤的取走率或大小。添加剂和浓度的选择需要根据适合特定细胞类型和不受实验影响的情况进行。如果使用不粘环，这些环也有可能每隔一段时间补充一次。
该模型系统的未来应用取决于要测试的假设。例如，这些肿瘤移植可用于测试新的治疗方法，以减少肿瘤大小或耗尽肿瘤的亚群。与宿主肿瘤微环境的细胞联合植入可以研究这些细胞对各种参数的影响，包括肿瘤生长和治疗阻力。在免疫功能低下的动物模型中建立异种移植物之前，该模型还可以作为逐步扩大原发性人类肿瘤的机会。初步适应CAM移植可能促进肿瘤在鼠模型中的取肿瘤率。这些应用程序还有待测试，但需要进一步探索。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢Tamanoi博士和Binh Vu博士对这种方法的初步培训。与Eva Koziolek博士的讨论有助于优化这种方法，并对此非常赞赏。如果没有以下来源的资助，这项工作就不可能进行：烟草相关疾病研究计划博士后研究金（27FT-0023， 到ACS，国防部（国防部）卵巢癌研究计划（W81XWH-17-1-0160），NCI/NIH（1R21CA216770），烟草相关疾病研究计划高影响试点奖（27IR-0016）和加州大学洛杉矶分校机构支持， 包括JCCC种子赠款（NCI/NIH P30CA016042）和从研究部副部长办公室到LW的3R补助金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
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