Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

Sommario

Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l'innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.

Abstract

I modelli murini sono i test di riferimento per gli studi sul cancro in vivo. Tuttavia, i costi, i tempi e le considerazioni etiche hanno portato a richieste di modelli alternativi di cancro in vivo. Il modello di membrana corioalltoica di pollo (CAM) fornisce un'alternativa rapida e economica che consente la visualizzazione diretta dello sviluppo del tumore ed è adatta per l'imaging in vivo. Come tale, abbiamo cercato di sviluppare un protocollo ottimizzato per l'ingoiare i tumori ginecologici e urologici in questo modello, che presentiamo qui. Circa 7 giorni dopo la fecondazione, la cella d'aria viene spostata sul lato vascolarizzato dell'uovo, dove viene creata un'apertura nel guscio. I tumori da linee cellulari murine e umane e tessuti primari possono quindi essere innestati. Questi sono tipicamente semi in una miscela di matrice extracellulare e mezzo per evitare la dispersione cellulare e fornire supporto nutritivo fino a quando le cellule reclutano una fornitura vascolare. I tumori possono quindi crescere fino a 14 giorni aggiuntivi prima della schiusa delle uova. Impiantando cellule correttamente trasdotte con luciferasi della lucciola, l'imaging della bioluminescenza può essere utilizzato per il rilevamento sensibile della crescita tumorale sulla membrana e le cellule tumorali si diffondono in tutto l'embrione. Questo modello può essere potenzialmente utilizzato per studiare la tumorigenicità, l'invasione, la metastasi e l'efficacia terapeutica. Il modello di pollo CAM richiede molto meno tempo e risorse finanziarie rispetto ai modelli murini tradizionali. Poiché le uova sono immunocompromesse e tolleranti immunitarie, i tessuti di qualsiasi organismo possono essere potenzialmente impiantati senza costosi animali transgenici (ad esempio, topi) necessari per l'impianto dei tessuti umani. Tuttavia, molti dei vantaggi di questo modello potrebbero potenzialmente essere anche limitazioni, tra cui il breve tempo di generazione del tumore e lo stato di tolleranza immunocompromessa/immune. Inoltre, anche se tutti i tipi di tumore presentati qui innesto nel modello di membrana corioallantoica di pollo, lo fanno con vari gradi di crescita del tumore.

Introduzione

I topi sono serviti come il classico organismo modello per lo studio delle malattie umane, compresa la malignità. Come mammiferi, condividono molte somiglianze con gli esseri umani. Il loro alto grado di somiglianza genetica ha permesso la manipolazione transgenica del genoma del topo per fornire enormi informazioni sul controllo genetico delle malattie umane¹. Un'ampia esperienza nella gestione e sperimentazione dei topi ha portato al loro essere il modello di scelta per la ricerca biomedica. Tuttavia, oltre alle preoccupazioni etiche e scientifiche riguardanti i modelli murini, possono anche essere piuttosto costose e dispendiose in termini d....

Protocollo

Tutti gli esperimenti qui presentati sono stati esaminati e approvati dai comitati etici competenti dell'Università della California, Los Angeles (UCLA). L'uso di tumori umani primari e identificati è stato approvato dall'UCLA Institutional Review Board (numeri di protocollo 17-000037, 17-001169 e 11-001363). All'UCLA, la revisione del Comitato per la ricerca sugli animali non è necessaria per gli esperimenti che utilizzano embrioni di pollo; l'approvazione del protocollo è necessaria solo quando le uova saranno covate. Tuttavia, le migliori pratiche, come le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali, sono state utilizzate per gestire gli embrioni di pollo in mod....

Risultati

Finora, abbiamo trovato questo metodo di impianto per avere successo per i tumori ovarici, renali, prostatici e della vescica. Ognuna è stata ottimizzata per identificare condizioni specifiche per l'impianto, anche se ci può essere flessibilità. Tra i tipi di tumore testati, la crescita del cancro ovarico era molto meno pronunciata e in genere non visibile senza l'assistenza dell'imaging a bioluminescenza (Figura 1). Tuttavia, un irrigidimento della CAM potre.......

Discussione

L'espansione e l'innesto del tumore con il modello CAM consentono una crescita tumorale più rapida e direttamente osservabile rispetto ai modelli animali in vivo esistenti. Inoltre, i costi sono significativamente più bassi una volta completato l'acquisto iniziale di attrezzature, soprattutto se confrontato con il costo dei topi immunocompromessi. Lo stato iniziale, immunocompromesso degli embrioni di pollo, consente facilmente l'innesto di tessuto umano e murino. Anche con questi punti di forza, il modello CAM ha delle .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
-010 Teflon (PTFE) Bianco 55 Duro Shore D O-Ring	L'O-Ring Store	TEF010	Anello antiaderente per la semina cellulare. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Politetrafluoroetilene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Linea cellulare di cancro alla prostata umana.
Le cellule CWR22Rv1			CWR sono state il gentile dono del Dr. David Agus (Keck Medicine della University of Southern California)
Anticorpo citocheratina 8/18 (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0,02mg	Utilizzato a una diluizione di 1:100 per l'analisi immunoistochimica dei tumori ovarici CAM umani.
D-Luciferina Firefly, sale di potassio	Goldbio	LUCK-1G
Forbici Operative Delicate; Curvo; Acuto-tagliente; Lunghezza lama 30 mm; 4-3/4 pollici Lunghezza totale Roboz	Surgical	RS6703	Questo è fornito come esempio. Anche qualsiasi forbice curva simile funzionerebbe.
Kit di attrezzi Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max	Dremel	8050-N/18	Questo kit contiene tutti gli strumenti necessari.
Uova di gallina fecondate (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	Dovrebbe essere identificato un fornitore locale di uova, poiché questo fornitore consegna solo a livello regionale.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Linea cellulare di cancro alla vescica umana.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	È possibile utilizzare altre incubatrici per uova, ma la loro affidabilità dovrebbe essere verificata. Dopo l'impianto, può essere utilizzato anche un incubatore cellulare con CO2 disabilitata.
ID8			Non disponibile in commercio, vedere PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Possono essere utilizzati altri candelabri; tuttavia, questo è preferito tra quelli che abbiamo testato. Questo candelabro è incluso nel suddetto kit incubatrice.
Pinze a iride, 10 cm, curve, seghettate, punte da 0,8 mm	World Precision Instrument	15915	Questo è fornito come esempio. Anche qualsiasi pinza curva simile funzionerebbe. Per questo metodo sono state utilizzate più marche.
Clipper per isoflurano	che distribuisce	0010250
sistema di imaging in vivo IVIS Lumina II	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC;	Soluzione di		matrice extracellulare
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	cellulare di cancro alla prostata murino.
Controller per pipette portatile Pipet-Aid XP	Drummond Scientific	4-000-101	Qualsiasi controller per pipette simile sarebbe appropriato.
Aghi ipodermici PrecisionGlide	BD	305196	Questo è fornito come esempio. Qualsiasi ago da 18G funzionerebbe in modo simile.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forcipe	Strumenti di Fine Science	11008-13	Questo è fornito come esempio. Qualsiasi pinza simile o un altro stile che si adatti alle preferenze del ricercatore sarebbe appropriato.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Linea cellulare di carcinoma ovarico umano.
Pinza per campioni Microscopia	elettronica Scienze	72914	Questo è fornito come esempio. Le pinze utilizzate per estrarre il guscio per l'imaging a bioluminescenza sono lunghe circa 12,8 cm con punte larghe 3 mm.
Batuffoli di cotone sterili	Fisherbrand	22-456-885	Questo è fornito come esempio. Sarebbero sufficienti batuffoli di cotone sterili.
Aste di agitazione con poliziotto di gomma; diametro 5 mm, lunghezza 6 pollici	United Scientific Supplies	GRPL06	Questo è fornito come esempio. Funzionerebbero anche aste di agitazione in vetro simili.
cellulare di cancro alla vescica umana	T24	ATCC	HTB-4
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Piastre per colture tissutali, diametro 10 cm	Corning	353803	Questo è fornito come esempio. Può essere utilizzato qualsiasi piatto simile sterile da 10 cm. Non è necessario un trattamento di coltura tissutale.
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 parete (50 piedi)	Tygon	AACUN017	Questo è fornito come esempio. Funzionerebbe anche qualsiasi tubo di dimensioni simili.

354248 Linea Linea .