Presentamos el modelo de membrana corioalantoica de pollo como un modelo alternativo, trasplantable, in vivo para el injerto de líneas celulares de cáncer ginecológico y urológico y tumores derivados del paciente.
Los modelos de ratón son las pruebas de referencia para los estudios de cáncer in vivo. Sin embargo, el costo, el tiempo y las consideraciones éticas han llevado a llamadas a modelos alternativos de cáncer in vivo. El modelo de membrana corioalantoica de pollo (CAM) proporciona una alternativa rápida y económica que permite la visualización directa del desarrollo tumoral y es adecuado para la toma de imágenes in vivo. Como tal, buscamos desarrollar un protocolo optimizado para injertar tumores ginecológicos y urológicos en este modelo, que presentamos aquí. Aproximadamente 7 días después de la fertilización, la célula de aire se mueve al lado vascularizado del óvulo, donde se crea una abertura en la cáscara. Los tumores de las líneas celulares murinas y humanas y los tejidos primarios pueden ser injertados. Estos son típicamente sembrados en una mezcla de matriz extracelular y medio para evitar la dispersión celular y proporcionar apoyo nutritivo hasta que las células reclutan un suministro vascular. Los tumores pueden crecer hasta 14 días más antes de la eclosión de los huevos. Mediante el implante de células transducidas establemente con luciferasa luciérnaga, la imagen de bioluminiscencia se puede utilizar para la detección sensible del crecimiento tumoral en la membrana y la célula cancerosa diseminado por todo el embrión. Este modelo se puede utilizar potencialmente para estudiar la tumorigeniidad, invasión, metástasis, y eficacia terapéutica. El modelo CAM de pollo requiere significativamente menos tiempo y recursos financieros en comparación con los modelos murinos tradicionales. Debido a que los óvulos son inmunocomprometidos e inmunes tolerantes, los tejidos de cualquier organismo pueden implantarse potencialmente sin animales transgénicos costosos (por ejemplo, ratones) necesarios para la implantación de tejidos humanos. Sin embargo, muchas de las ventajas de este modelo podrían ser potencialmente también limitaciones, incluyendo el corto tiempo de generación de tumores y el estado inmunocomprometido/inmune tolerante. Además, aunque todos los tipos de tumores presentados aquí se injertan en el modelo de membrana corioalantoica de pollo, lo hacen con diferentes grados de crecimiento tumoral.
Los ratones han servido como el organismo modelo clásico para el estudio de enfermedades humanas, incluyendo la neoplasia maligna. Como mamíferos, comparten muchas similitudes con los humanos. Su alto grado de similitud genética ha permitido la manipulación transgénica del genoma del ratón para proporcionar una enorme visión del control genético de las enfermedades humanas1. La amplia experiencia en el manejo y la experimentación con ratones ha dado lugar a que sean el modelo de elección para la investigación biomédica. Sin embargo, además de las preocupaciones éticas y científicas con respecto a los modelos murinos, también pueden ser bastante costosos y llevar mucho tiempo2,3. El desarrollo de tumores puede tomar semanas o incluso meses. La vivienda en una institución típica por sí sola puede correr en cientos a miles de dólares mientras se desarrollan los tumores. El cáncer de ovario es un ejemplo de este inconveniente porque su crecimiento en modelos murinos puede tomar fácilmente meses. Los retrasos en los progresos de la investigación pueden afectar a la tasa de supervivencia persistentemente baja de 5 años de los pacientes con cáncer de ovario, de sólo el 47% (es decir, un aumento de la supervivencia de sólo el 10% en 30 años)4. Del mismo modo, los cánceres urológicos (cáncer de riñón, próstata y vejiga) constituyen el 19% de todos los casos de cáncer en los Estados Unidos y el 11% de las muertes relacionadas con el cáncer4. Por lo tanto, un enfoque in vivo novedoso para estudiar los cánceres ginecológicos y urológicos podría ahorrar a un laboratorio tiempo considerable, trabajo y dinero, incluso si este modelo sólo se aplica a los experimentos de cribado iniciales. Además, la aceleración resultante de los resultados de la investigación podría afectar significativamente a las 177.000 personas diagnosticadas con estos tipos de cáncer anualmente.
El modelo CAM de pollo ofrece muchas ventajas que abordan los problemas antes mencionados. Un modelo popular para estudiar la angiogénesis5,6, la invasión de células tumorales7,8, y la metástasis7,9, el modelo CAM embrionario pollito ya se ha utilizado para estudiar muchas formas de cáncer, incluyendo glioma10,11,12, cabeza y cuello carcinoma de células escamosas13,14, leucemia15,16, cáncer de páncreas17,y cáncer colorrectal18. Además, se han generado modelos CAM para neuroblastoma19,linfoma Burkitt20,melanoma21y fibrosarcoma felino22. Estudios previos también han presentado injerto de cáncer de vejiga23 y líneas celulares de cáncer de próstata24,pero con detalles de protocolo limitados. No sólo los huevos son mucho más baratos que los ratones, sino que también producen resultados altamente reproducibles25,26. Muestran un rápido desarrollo de la vasculatura, y el injerto tumoral puede ocurrir en tan solo unos días y visualizarse longitudinalmente a través de la ventana abierta. Con el plazo de 21 días entre la fertilización de óvulos y la eclosión, los experimentos se pueden completar en pocas semanas. Además, el bajo costo, las necesidades limitadas de vivienda y el pequeño tamaño permiten fácilmente experimentos a gran escala que serían prohibitivos para los estudios con ratones.
Por lo tanto, buscamos optimizar el modelo CAM para el injerto de cánceres ginecológicos y urológicos. Debido al estado inmunocomprometido del embrión de pollo temprano27,tanto el ratón como las células humanas se pueden implantar fácilmente. Como tal, hemos injertado con éxito cánceres de ovario, riñón, próstata y vejiga. Para cada uno de estos tipos de tumores, el CAM acepta fácilmente las líneas celulares tumorales establecidas y/o humanas. Es importante destacar que los tejidos tumorales humanos primarios recién cosechados también pueden injertar de células digeridas o trozos de tejido sólido con altas tasas de éxito. Cada uno de estos tipos de cáncer y fuentes celulares requiere optimización, que compartimos aquí.
La expansión e injerto de tumores utilizando el modelo CAM permite un crecimiento tumoral más rápido y directamente observable que los modelos animales in vivo existentes. Además, los costos son significativamente más bajos una vez que se completa la compra inicial de equipos, especialmente en comparación con el costo de los ratones inmunocomprometidos. El estado inicial inmunocomprometido de los embriones de pollo permite fácilmente el injerto de tejido humano y murino. Incluso con estos puntos fuertes, el modelo…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer al Dr. Fuyuhiko Tamanoi y Binh Vu por la formación inicial sobre este método. Las conversaciones con la Dra. Eva Koziolek han sido fundamentales para optimizar este enfoque y han sido muy apreciadas. Este trabajo no habría sido posible sin la financiación de las siguientes fuentes: el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco Beca Postdoctoral (27FT-0023, al ACS), el Programa de Investigación del Cáncer de Ovario del Departamento de Defensa (DoD) (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco Premio Piloto de Alto Impacto (27IR-0016), y apoyo institucional de la UCLA, incluyendo una Beca de Semillas de JCCC (NCI/NIH P30CA016042) y una Beca 3R de la Oficina del Vicerrectorado de Investigación a LW.
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |