Summary
هنا ، نقدم أداة يمكن استخدامها لدراسة التشكيل ما بعد النسخ من نسخة في الخلايا الظهارية السنخية الأولية باستخدام نظام تعبير غير قابل للاختزال إلى جانب تقنية الكهربية ماصة.
Abstract
دراسة التنظيم بعد النسخ أمر أساسي لفهم تعديل الحمض النووي الريبي رسول معين (مرنا) وتأثيره على التوازن الخلية والتمثيل الغذائي. في الواقع ، يمكن للتقلبات في التعبير عن النص تعديل كفاءة الترجمة وفي نهاية المطاف النشاط الخلوي للنص. وقد وضعت عدة نهج تجريبية للتحقيق في نصف عمر مرنا على الرغم من أن بعض هذه الأساليب لديها قيود تمنع الدراسة السليمة للتشكيل بعد النسخ. يمكن لنظام التعريفي المروج التعبير عن جين ذات أهمية تحت سيطرة مروج الاصطناعية التتراسيكلين المنظمة. تسمح هذه الطريقة بتقدير نصف العمر لـ مرنا معين تحت أي حالة تجريبية دون التوازن الخلوي المزعج. عيب رئيسي واحد من هذه الطريقة هو ضرورة الخلايا transfect، مما يحد من استخدام هذه التقنية في الخلايا الأولية المعزولة التي هي مقاومة للغاية لتقنيات الترانزفيشن التقليدية. وقد استخدمت الخلايا الظهارية الألفية في الثقافة الأولية على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا الخلوية والجزيئية للظهارة السنخية. الخصائص الفريدة والنمط الظاهري للخلايا السنخية الأولية تجعل من الضروري دراسة التشكيلات الما بعد النسخ من الجينات ذات الأهمية في هذه الخلايا. لذلك ، كان هدفنا هو تطوير أداة جديدة للتحقيق في التشكيلات المابعد النسخية من mRNAs ذات الاهتمام في الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية. قمنا بتصميم بروتوكول نقل عابر سريع وفعال لإدراج نظام تعبير البلازميد الذي يتم التحكم فيه بشكل نصي في الخلايا الظهارية السنخية الأولية. هذه الاستراتيجية الاستنساخ، وذلك باستخدام epitope الفيروسية لوضع علامة على بناء، يسمح للتمييز السهل من بناء التعبير من ذلك من mRNAs الذاتية. باستخدام طريقة تعديل دورة القياس الكمي (Cq) ، يمكن بعد ذلك قياس التعبير عن النص في فترات زمنية مختلفة لقياس نصف عمره. توضح بياناتنا كفاءة هذا النهج الجديد في دراسة التنظيم بعد النسخ في مختلف الظروف الفسيولوجية المرضية في الخلايا الظهارية السنخية الأولية.
Introduction
وقد تم تطوير العديد من التقنيات لتحديد نصف عمر mRNAs. تسمح تقنية الاضمحلال التي تطارد النبض ، والتي تستخدم mRNAs المسمى ، بإجراء تقييم متزامن لمجموعة كبيرة من الحمض النووي الريبي مع الحد الأدنى من الاضطراب الخلوي. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يسمح بتقدير مباشر لنصف عمر نسخة جينية واحدة ولا يمكن تنفيذه لدراسة التشكيل بعد النسخ من مرنا بعد التحفيز مع عوامل النمو ، ROS ، alarmins ، أو الالتهاب1.
استخدام مثبطات النسخ، مثل actinomycin D و α-amanitin، هو طريقة بسيطة نسبيا لقياس حركية تدهور مرنا مع مرور الوقت. وتعتمد إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج على التقنيات السابقة (أي مطاردة النبض) على القدرة على تقدير نصف عمر نسخة معينة مباشرة ومقارنة الكيفية التي يمكن أن تؤثر بها العلاجات المختلفة على حركية تدهورها. ومع ذلك ، فإن التأثير الضار الكبير لمثبطات النسخ على فسيولوجيا الخلايا يمثل عيبًا رئيسيًا للنهج2. في الواقع ، فإن تثبيط النسخ الخلوي كله مع هذه الأدوية له آثار جانبية سلبية من اضطراب تخليق العناصر الرئيسية المشاركة في استقرار مرنا ، مثل microRNAs (miRNAs) ، وكذلك التعبير وتوليف البروتينات الملزمة للحمض النووي الريبي ، والتي تعتبر مهمة لتدهور وثبات مرنا. وبالتالي فإن الاضطرابات الشديدة للنسخ الجيني من قبل هذه الأدوية يمكن أن تعدل في الواقع منحنيات تدهور النصوص.
يمثل نظام التعريفي المروج نهجًا ثالثًا لقياس نصف عمر مرنا محددة. يقيس هذا الأسلوب تدهور مرنا محددة بطريقة مماثلة للطرق التي تستخدم مثبطات النسخ. وكثيرا ما تستخدم نوعين من نظم التعريفي: المصل الناجم عن c-fos المروج3 ونظام Tt-Off inducible4. مع نظام c-fos ، لا توجد حاجة إلى استخدام مثبطات النسخ التي يمكن أن تكون سامة للخلية. ومع ذلك، تتطلب هذه الطريقة مزامنة دورة الخلية، مما يمنع تقييم الاستقرار الفعلي للنص أثناء المرحلةالبينية 5. وعلى النقيض من ذلك، يسمح نظام Tet-Off بالتعبير القوي عن جين الاهتمام (GOI) تحت سيطرة مروج اصطناعي منظم من التتراسيكلين. يتطلب هذا النظام وجود عنصرين يجب أن يتم إصابة cotransفي الخلية لتكون وظيفية. أول plasmid (pTet-Off) يعبر عن البروتين التنظيمي tTA-Adv، وهو عامل النسخ الاصطناعية الهجينة تتألف من المثبط prokaryotic TetR (من إتشيريشيا كولاي) تنصهر إلى ثلاثة مجالات تحويل النسخ من البروتين الفيروسي HSV VP16. يتم استنساخ GOI في البلازميد pTRE-Tight تحت سيطرة مروج اصطناعي (PTight)، والذي يتألف من الحد الأدنى من التسلسل للمروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) المنصهر إلى سبعة تكرارات لتسلسل مشغل tetO. النسخ من الجين المصب من فضيق يعتمد على تفاعل TetR مع tetO. في وجود التتراسيكلين أو مشتقها ، دوكسيسيكلين ، يفقد المكتم TtR تقاربه لمشغل tetO ، مما يؤدي إلى وقف النسخ4. خصائص نظام تيت حالا جعله نموذجا مثاليا لدراسة التعبير مرنا محددة في الخلايا eukaryotic مع تجنب الآثار التجنبية المحتملة التي هي ثانوية لعدم وجود تسلسل التنظيمية prokaryotic في الخلية eukaryotic6. عادة، يتم استخدام خطوط خلية Tet-Off المستقرة بشكل مضاعف (HEK 293 و HeLa و PC12) مع هذا النظام لدمج نسخ من بلازميدات المنظم والاستجابة للوصول المريح إلى التعبير الجيني القابل للتحكم7و8و9.
وقد استخدمت عدة نماذج من الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة لدراسة البيولوجيا الخلوية والجزيئية للظهارة السنخية. لسنوات، وقد استخدم الباحثون على نطاق واسع الإنسان أو القوارض الخلايا الأولية10،11 وكذلك خطوط الخلايا الخالدة مثل A549 الإنسان أو الفئران RLE-6TN الخلايا12،13. على الرغم من أنها عموما أقل تكاثرية وأكثر صعوبة للثقافة وtransfect، الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية لا تزال المعيار الذهبي لدراسة وظيفة وخلل وظيفي من ظهارة السنخية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. في الواقع ، لا تظهر خطوط الخلايا الخالدة مثل خلايا A549 الخصائص المعقدة والأنماط الظاهرية للخلايا الأولية ، في حين أن الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية تلخص الخصائص الرئيسية للظهارة السنخية ، ولا سيما القدرة على تشكيل حاجز مستقطب وضيق14،15. لسوء الحظ ، فإن هذه الخلايا مقاومة للغاية لتقنيات الترانزفيشن التقليدية ، مثل تلك التي تستخدم الليبوزومات ، مما يجعل استخدام نظام مستحث ًا للمروج مثل Tet-Off أمرًا صعبًا للغاية.
التشكيل posttranscriptional من mRNAs هي واحدة من أكثر الطرق فعالية لتعديل سريع التعبير الجيني للنص16. وتلعب المنطقة غير المترجمة من قبل مرنا 3 '(3' UTR) دوراً هاماً في هذه الآلية. وقد ثبت أنه، على عكس 5 'UTR، هناك ارتباط أسي بين طول UTR 3 'والتعقيدات الخلوية والمورفولوجية للكائن الحي. هذا الارتباط يشير إلى أن UTR 3 ' ، مثل مناطق ترميز مرنا ، قد تعرضت للاختيار الطبيعي للسماح لتعديل ما بعد النسخ معقدة على نحو متزايد في جميع أنحاء تطور17. يحتوي UTR 3 'على العديد من المواقع الملزمة للبروتينات وmiRNAs التي تؤثر على استقرار وترجمة النص.
في هذا العمل ، وضعنا أداة للتحقيق في دور المجالات المحفوظة للغاية في UTR 3 ' من GOI للسيطرة على استقرار النص. ركزنا على قناة الصوديوم الظهارية ، وحدة ألفا الفرعية (αENaC) ، والتي تلعب دورًا رئيسيًا في فسيولوجيا الظفية الظهارية18. تم نقل الخلايا الظهارية الألفية في الثقافة الأولية بنجاح بشكل عابر مع المكونين من نظام Tet-Off ، والذي يسمح بدراسة دور UTR 3 'في استقرار مرنا مع نظام يؤثر بشكل أدنى على فسيولوجيا الخلايا والتمثيل الغذائي بالمقارنة مع استخدام مثبطات النسخ مع بروتوكولات أخرى. ووُضعت استراتيجية للاستنساخ للتمييز بين تعبير الـ GOI والتعبير عن الجين الذاتي باستخدام نسخة غير منسّبة (V5). ثم تم نقل الاستجابة والبلازميدات التنظيمية إلى الخلايا الظهارية السنخية باستخدام تقنية الكهربية ماصة. وفي وقت لاحق، تم قياس التعبير عن النص من خلال احتضان الخلايا مع الدوكسيسيكلين على فترات زمنية مختلفة. تم تقييم نصف عمر النص من قبل RT-qPCR باستخدام طريقة CQ معدلة باستخدام منتج tTA-Ad مرنا عبر العدوى للتطبيع. من خلال بروتوكولنا، نقدم طريقة مريحة لدراسة التشكيل اللاحق للنسخة من نسخة في ظل ظروف مختلفة وتحديد مشاركة المناطق غير المترجمة بمزيد من التفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوانات ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات التابعة لمركز البحوث التابع لمركز مستشفى جامعة مونتريال.
1. تصميم وتوليد plasmid الاستجابة التعبير عن الجين من الفائدة (GOI)
- استخدام ناقل التتراسيكلين غير قابل للاختزال، مثل pTRE-Tight.
- تحليل تسلسل GOI وموقع الاستنساخ المتعدد (MCS) للمتجه لتحديد مواقع التقييد في MCS غير الموجودة داخليًا في GOI.
- عزل الخلايا الظهارية السنخية الأولية من الذكور Sprague-Dawley الرئتين الفئران كما هو موضح سابقا19,20.
- تنقية مجموع الحمض النووي الريبي من الخلايا الظهارية السنخية عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة قياسية، مثل استخراج الفينول / الكلوروفورم أو استخدام أعمدة تدور الحمض النووي الريبي القائمة على السيليكا.
- عكس نسخ مرنا إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام oligo (dT) وعالية الدقة عكس transcriptase.
- استخدم تقنية "تق بوليميراز" عالية الدقة وتقنيات تفاعل الـ PCR القياسية لتطويق GOI بموقعي تحديد محددين للتعرف على الإنزيم باستخدام الأدوات التمهيدية المصممة.
- وقد التمهيدي إلى الأمام تحتوي على كوزاك توافق الريبوسوم موقع ملزم21 لتحسين مستويات التعبير لدراسة التعبير البروتين بالتوازي مع استقرار مرنا. يجب تضمين تسلسل ترميز المنبع V5 epitope من GOI لتمييز التعبير عن GOI المنقولة من التعبير الذاتي(الجدول 1).
- وقد التمهيدي عكس تحتوي على إشارة polyadenylation بعد وقف codon.
- يمكن إنشاء المسوخ عن طريق الحذف التتابعي لدراسة آثار مناطق UTR 3 'مختلفة على استقرار مرنا من GOI باستخدام التمهيديات العكسية ترميز موقع polyadenylation أن يحذف تدريجيا 3 'نهاية من GOI 3 ' UTR(الشكل 6). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الطفرات الموجهة من PCR لاستهداف منطقة معينة ذات أهمية في UTR3'22.
- هضم ناقلات لا يمكن اختزالها وإدراج مع الانزيمات تقييد المختارة سابقا في درجة حرارة الحضانة المناسبة لمدة 1 ساعة، تليها العلاج مع فوسفاتاز أثناء رد فعل ناقلات لمدة 30 دقيقة لتجنب الربط الذاتي.
- فصل ناقلات هضم وإدراج الأجزاء بواسطة electrophoresis في هلام أغروز 1-1.5 ٪ (تركيز اعتمادا على حجم إدراج).
- باستخدام شفرة وضوء الأشعة فوق البنفسجية، وجمع شظايا الحمض النووي التي تحتوي على إدراج المطلوب وناقلات إلى أن يكون الربط.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. - تنقية الأجزاء التي تم جمعها من هلام أغاروز باستخدام مجموعة تنقية PCR المستندة إلى السيليكا وقياس التركيز عن طريق قياس الطيف الضوئي عند 260 نانومتر.
- Ligate GOI والمتجه المنصهر مع T4 دنا ligase باستخدام ناقل:إدراج نسبة الأضراس من 1:3 لزيادة احتمال الربط. احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 ساعة.
- تحويل رد فعل الربط إلى كولاي المختصة (DH5α).
- إضافة 1-10 نانوغرام من النواقل والجين إلى أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة ثم خلايا الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 s. ضع الأنبوب على الجليد لمدة 2 دقيقة وإضافة 900 ميكرولتر من RT LB المتوسطة. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
- انتشار 100 ميكرولتر من التفاعل على طبق أغار LB مع مضاد حيوي مناسب (على سبيل المثال، 100 ميكروغرام/مل أمبيسيلين للناقل pTRE-Tight) لتحديد البكتيريا المحولة. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- حدد المستعمرات الفردية باستخدام حلقة تلقيح أو طرف 20 ميكرولتر واحتضان بين عشية وضحاها في 5 مل LB المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز. ويمكن تخزين البكتيريا المحولة في مخزونات الجلسرين في -80 درجة مئوية بنسبة 400:600 من LB المتوسطة إلى الجلسرين.
- استخراج الحمض النووي البلازميد باستخدام أعمدة البلازميد السيليكا القائمة وقياس التركيز عن طريق قياس الطيف الضوئي في 260 نانومتر. تأكيد إدخال GOI عن طريق تحليل القيود واتجاهه وعدم وجود طفرات يحتمل إدخالها أثناء RT-PCR عن طريق التسلسل.
2. Transfection من plasmid الاستجابة التعبير عن الجين من الفائدة (GOI) في الخلايا الظهارية السنخية الأولية
- عزل الخلايا الظهارية من النوع الثاني من رئتي الفئران.
- البذور الخلايا بكثافة 1 × 106 خلايا / سم2 في 100 ملم Petri الأطباق مع الحد الأدنى الكامل من المتوسطة الأساسية (MEM كاملة). MEM كاملة MEM تكملها مع FBS 10%, 0.08 ملغم/لتر tobramycin, Septra (3 ميكروغرام/مل تريميثوبريم و 17 ميكروغرام/مل sulfamethoxazole), 0.2% NaHCO3,0.01 M HEPES (pH = 7.3), و 2 mM L-الجلوتامين. ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في 5٪CO2 في حاضنة رطبة.
- في اليوم التالي، ضع 500 ميكرولتر من MEM كاملة دون مضاد حيوي في كل بئر من لوحة بئر 12 جديدة وتدفّن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذه الخطوة ، من المهم استخدام مصل الأبقار الجنيني الخالي من التتراسيكلين الملوث أو مع مستوى منخفض جدًا بحيث لا تتداخل مع القابلية للاختزال.
- إعداد 1.5 مل أنابيب تحتوي على البلازميد مع GOI inducible (GOI plasmid) والناقل التنظيمي (على سبيل المثال، pTet-Off) عن طريق إضافة 1 ميكروغرام من البلازميد GOI و 1 ميكروغرام من ناقلات التنظيمية لكل بئر في RT. لتجارب التعبير المشترك مع البروتينات الملزمة للحمض النووي الريبي (RBP) ، 1 ميكروغرام من متجه تأسيسي (على سبيل المثال ، pcDNA3) التعبير عن RPB من الفائدة يضاف إلى مزيج الحمض النووي(الشكل 7).
- يستنشق المتوسطة وشطف بلطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني (دون الكالسيوم والمغنيسيوم) دافئة في 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين الدفء في 37 درجة مئوية واحتضان الخلايا حتى يتم فصل الخلايا (2-4 دقيقة). تحييد التربسين عن طريق إضافة 10 مل من MEM كاملة دون المضادات الحيوية.
- جمع تعليق الخلية في أنبوب 50 مل، وغسل طبق بيتري مع 4 مل من المتوسط لجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا المتبقية، ومن ثم طرد مركزي تعليق الخلية في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
- يستنشق بلطف وتجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. عد وحساب عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
- الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقيقة. بلطف يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت إعادة تعليق بتركيز 4 × 107 خلايا / مل. إضافة الخلايا من أنبوب 1.5 مل أعدت في الخطوة 2.4 بتركيز 400،000 الخلايا في البئر ومزجها بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
- ضع الأنبوب في جهاز الكهربية واملأه بـ 3.5 مل من المخزن الكهربائي المؤقت.
- أدخل طرف قطب كهربائي مطلي بالذهب في ماصة عن طريق الضغط تمامًا على المكبس. مزيج بلطف محتويات أنبوب 1.5 مل وبعناية تستنشق الخلايا مع ماصة. يجب الحرص على منع فقاعات الهواء من دخول الطرف، لأن هذا سوف يسبب القوس الكهربائي أثناء الكهربية ويؤدي إلى انخفاض كفاءة transfection.
- أدخل الماصة في محطة الكهربحتى يكون هناك صوت نقر.
- حدد بروتوكول الكهربية المناسب للخلايا الظهارية السنخية ، المقابلة لجهد النبض من 1450 V و 2 نبضات بعرض 20 مللي ثانية ، واضغط ابدأ على شاشة اللمس.
- مباشرة بعد الترانسفير، وإزالة ماصة ونقل الخلايا إلى بئر مليئة سابقا مع MEM كاملة دون المضادات الحيوية التي تم التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
- كرر الخطوات 2.11-2.14 للعينات المتبقية.
- يهز بلطف لوحة لنشر الخلايا بالتساوي على سطح البئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪CO2 في حاضنة رطبة. بعد يومين، استبدل الوسط بـ MEM كاملة بالمضادات الحيوية.
- تأكيد نجاح الترانزفيشن من خلال مراقبة التعبير عن eGFP تحت المجهر الفلوري أو عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام متجه التحكم(الشكل 1).
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية وتتطلب خطوة تحويل إضافية باستخدام البلازميد التعبير عن eGFP مختلفة، مثل pcDNA3-EGFP.
3. تحريض تثبيط النسخ من GOI
ملاحظة: يمكن معالجة الخلايا مسبقًا بالعلاجات المطلوبة قبل تحريض الدوكسيسيكلين لتقييم تأثيرها على استقرار مرنا(الشكل 5).
- إعداد محلول مخزون دوكسيسيكلين من 1 ملغ / مل في الماء المغون. تخزين حل الأسهم في -20 درجة مئوية محمية من الضوء. يستخدم الدوكسيسيكلين، وهو مشتق من التتراسيكلين، بدلاً من التتراسيكلين لأنه يحتوي على نصف عمر أطول (2x) من التتراسيكلين. وعلاوة على ذلك، مطلوب تركيز أقل من الدوكسيسيكلين لتعطيل كامل من operon تيت 23.
ملاحظة: يمكن أن يؤثر Doxycycline على التعبير مرنا من GOI الذاتية. للتحقق من ذلك ، يجب اختبار تأثير علاج 24 ساعة مع الدوكسيسيكلين على خلايا السنخية لتأكيد عدم وجود أي تغييرات في تعبير GOI(الشكل 2). - إعداد الطازجة 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين الحل في استكمال MEM 72 ح posttransfection ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
- استبدال المتوسطة مع 1 مل من MEM كاملة تحتوي على 1 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين لكل بئر لمنع النسخ من GOI.
- احتضان آبار متعددة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لكميات مختلفة من الوقت من 15 دقيقة-6 ساعة لتقييم نصف عمر مرنا لـ GOI.
- في نهاية العلاج، وغسل الخلايا مع الجليد الباردة PBS وlyse لهم مع مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفينول الكلوروفورم المتاحة تجاريا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من العازلة لكل بئر وهز لوحة لتجانس الخلايا.
- عزل الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تحديد العائد الحمض النووي الريبي والنقاء عن طريق قياس الطيف الضوئي في 230، 260، و 280 نانومتر. عينات الجيش الملكي النيبالي مع 260:230 و 260:280 نسب من 1.8 و 2.0، على التوالي، تعتبر نقية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
4. تحديد استقرار مرنا من GOI
- علاج 1 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي مع الحمض النووي الريبي خالية من الحمض النووي الخالية من DNAse الأول (درجة التضخيم) لإزالة أي أثر للحمض النووي البلازميد التي يمكن أن تتداخل مع تضخيم الحمض النووي اللاحقة.
- في أنبوب PCR 0.2 مل، والجمع بين 1 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي، 1 μL من 10x DNase أنا العازلة رد فعل، 1 μL من DNAse I (1 U/μL)، والمياه الخالية من RNAse للحصول على حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر.
- احتضان رد الفعل في RT لمدة 20 دقيقة.
- قم بإلغاء تنشيط DNAse I بإضافة 1 ميكرولتر من 25 mM EDTA إلى مزيج التفاعل 10 ميكرولتر واحتضان التفاعل عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- عكس نسخ الحمض النووي الريبي مجموع المنضب في cDNA باستخدام مجموعة توليف cDNA المتاحة تجاريا مع مزيج من oligo (dT) والتمهيديات السداسي عشوائي ة لتحسين كفاءة النسخ العكسي.
- باختصار، أضف 4 ميكرولتر من مزيج التفاعل 5x، و1 ميكرولتر من الكركة العكسية، و4 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الرنازإلى 11 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الريبي الكلي المستنفد للحمض النووي للحصول على إجمالي حجم التفاعل من 20 ميكرولتر. اخلط التفاعل جيدًا عن طريق توجيه هُنا إلى أعلى وأسفل.
- احتضان رد الفعل لمدة 5 دقيقة عند 25 درجة مئوية ، تليها 20 دقيقة عند 46 درجة مئوية ، ثم قم بتعطيل التفاعل عن طريق احتضانه عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. كل رد فعل سوف تسفر عن 50 نانوغرام / ميكرولتر من المنتج cDNA.
- تمييع تفاعل cDNA إلى تركيز 5 نانوغرام/ميكرولتر بإضافة 180 ميكرولتر من المياه من الدرجة البيولوجية الجزيئية إلى مزيج التفاعل البالغ 20 ميكرولتر. تخزين منتجات cDNA عند -80 درجة مئوية أو المضي قدما على الفور لأداء PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qPCR).
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
- تصميم إلى الأمام وعكس أجهزة البرايم qPCR محددة لGOI.
- بسبب التعبير الذاتي ة من GOI في الخلايا، يجب أن تكون مصممة التمهيديات لتضخيم amplicon 100-150 bp من epitope V5 إلى جانب GOI(الجدول 1).
- كما يجب استخدام الكبيات الجينية المرجعية الداخلية كضوابط للتطبيع. عادة، تستخدم جينات التدبير المنزلي، مثل جينات بيتا أكتين وهوكزانتين فوسفوريبوسيسيل ترانسفيتاز 1، كجينات مرجعية. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام هذه مع هذا النظام التعريفي بسبب اختلاف كفاءة الإرسال. بدلا ً من ذلك ، يتم تقييم التعبير عن نسخة tTA-Ad لأغراض التطبيع ، لأن تعبيرها تأسيسي في الخلايا بسبب نشاط مروج الفيروس المضخم للخلايا. أي اختلاف في التعبير قياسqPCR سيكون ممثلا لكفاءة transfection (التمهيديات: إلى الأمام 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' وعكس 5'-AGT GGG TAT جات GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) وسوف تسمح لتطبيع التعبير عن الحيوانات المستنسخة عبر(الشكل 3).
- إعداد كل رد فعل qPCR في ثلاثية باستخدام SYBR الأخضر صبغ ة مزيج رئيسي.
- تمييع مزيج cDNA 5 نانوغرام/ميكرولتر إلى تركيز 1.25 نانوغرام/ميكرولتر باستخدام مياه من الدرجة البيولوجية الجزيئية.
- الجمع بين 5 ميكرولتر من SYBR الأخضر صبغة مزيج رئيسي (2x)، 0.1 ميكرولتر من البيولوجيا الجزيئية الصف المياه، 0.45 ميكرولتر من 7.5 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 0.45 ميكرولتر من 7.5 ميكرومتر التمهيدي العكسي، و 4 μL من 1.25 نانوغرام / μL cDNA للحصول على حجم رد فعل إجمالي من 10 μL. ميكس جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في 96 pc استخدام فيلم لاصق بصري لضمان أن غطاء لوحة مختومة ومنع التلوث والتبخر.
- تدور أسفل مزيج رد الفعل لفترة وجيزة عن طريق الطرد المركزي ووضع لوحة في دراجة حرارية qPCR.
- تضخيم V5 الموسومة GOI وtTA-Ad amplicons باستخدام الشروط qPCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة كخطوة التهيئة، تليها 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 10 ث، 58 درجة مئوية لمدة 15 ث، و 72 درجة مئوية لمدة 20 ث. يجب إنشاء منحنى ذوبان عالي الدقة بعد إجراء دورات التضخيم لتقييم درجات حرارة الذوبان المحددة للأممليكونز المطلوب وضمان عدم وجود قمم amplicon الضوضاء.
- تضمين الضوابط السلبية لـ qRT-PCR من خلال تنفيذ qPCR مع الحمض النووي الريبي كقالب بدون نسخ عكسي ليكون بمثابة تحكم في تلوث الحمض النووي البلازميد المحتمل وqPCR مع عدم إضافة cDNA إلى مزيج qPCR لضمان عدم وجود أجهزة الخافتات التمهيدية أو الملوثات.
- يجب تحسين تركيز cDNA الأمثل ، وكفاءة التمهيدي ، والتركيز وفقًا لـ GOI من خلال فحص منحنى قياسي. للقيام بذلك، إجراء تخفيف المسلسل باستخدام cDNA من الخلايا غير المعالجة (المستزرعة دون دوكسيسيكلين). يتم إنشاء المنحنى القياسي عن طريق رسم قيم Cq مقابل سجل عامل تخفيف cDNA ، ويتم حساب كفاءة التضخيم (E) وفقًا لميل المنحنى القياسي باستخدام الصيغة التالية:
E =10-1/المنحدر
ملاحظة: يجب أن تكون كفاءة التضخيم حوالي 0.9 إلى 1.05. وإلا، يجب إعادة تصميم الالتمهيديات.
- تحليل بيانات qPCR باستخدام أسلوب Cq المقارن عن طريق تطبيع قيم التعبير لـ GOI إلى تعبير tTA-Ad للحصول على مستويات التعبير النسبي ة لـ GOI والإبلاغ عن تعبيرها كنسبة مئوية من تعبير mRNA لـ GOI في الخلايا من نفس الحيوان عند نقطة البداية (t = 0)(الشكل 4).
- يتم تحديد نصف العمر من ثابت المعدل (K) لمنحنى تدهور GOI mRNA باستخدام المعادلة التالية:
t1/2 = ln 2/K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لتوليد نظام التعبير بلازميد Tt-Off التي تسيطر عليها لتقييم أهمية أجزاء مختلفة من utR αENaC 3 'في تعديل استقرار النص في الخلايا الظهارية السنخية الأولية.
كانت الخطوة الأولى في تنفيذ هذا النظام هي إنشاء تقنية نقل سريعة وسهلة وفعالة للخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية ، والتي يصعب تحويلها. كما هو موضح في الشكل 1، سمحت تقنية الكهربية ماصة لمعدل كفاءة الترانج 25-30٪، كما هو موضح في نسب خلايا eGFP التي تم اكتشافها بواسطة المجهر الفلوري وقياس التدفق الخلوي.
قبل تطبيق هذا النظام التعريفي، الذي يتم التحكم فيه من قبل التتراسيكلين ومشتقاته، تم التحقق من تأثير هذا الدواء على التعبير عن GOI لدينا. عولجت الخلايا الظهارية السنخية بـ 1.0 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين لتقييم تأثيرها على التعبير الذاتي αENaC مرنا. لم يكن للعلاجات التي أجريت على مدى فترة 1-24 ساعة أي تأثير كبير على التعبير عن النص الذاتي ، كما هو موضح في الشكل 2.
يستخدم نظام التعبير البلازمي الذي يتم التحكم فيه بشكل نصي تقنية تطبيع qPCR تختلف عن التقنية القياسية التي تستخدم جينات التدبير المنزلي. في حالة التعبير عن V5-αENaC ، تم تطبيع الإشارة وفقًا لإشارة tTA-Adv لتحديد كفاءة الترانزفيشن باستخدام طريقة Cq. ويبين الشكل 3 استخدام نسخة tTA-Adv لتطبيع التعبير عن مرنا.
النتائج المنشورة سابقا تشير إلى أن استخدام actinomycin D غير مناسب لتقدير استقرار النص αENaC، كما أشار إلى ارتفاع غير طبيعي مرنا نصف العمر (حوالي 12 ح)24. كان نصف عمر αENaC مرنا في وجود نظام Tet-Off (99 دقيقة) أقصر من 7أضعاف من ذلك الموجود في وجود actinomycin D ، كما هو موضح في الشكل 4. وهذا يؤكد أن actinomycin D يؤدي إلى استقرار مرنا αENaC artifactual.
كما تم استخدام هذا النظام Tet-Off بنجاح لاختبار ما إذا كانت الضغوطات المختلفة للخلايا المعروفة بالتأثير على التعبير الجيني αENaC يمكن أن تعدل استقرار αENaC مرنا. كما هو مبين في الشكل 5، انخفض علاج cycloheximide بشكل كبير من الاستقرار (36 دقيقة) من النص ، في حين أن السكريات الدهنية (LPS ، المستخدمة لتقليد المحفزات المعدية) لم تفعل ذلك. وأخيراً، تسبب السيتوكين TNF-α المؤيد للالتهابات في انخفاض حاد في ثبات V5-αENaC مرنا (مع نصف عمر 16 دقيقة).
وفي هذا العمل، كان الغرض من استراتيجية الاستنساخ هو توضيح مساهمة UTR 3'في تعديل نسخة αENaC. تم إنشاء العديد من المسوخ الحذف التسلسلي واختبارها لرسم خريطة مساهمة المجالات المختلفة من αENaC 3 'UTR إلى استقرار النص. ويبين الشكل 6 التغيرات الهامة في تعديل استقرار مرنا V5-αENaC اعتمادا ً على المناطق المحذوفة والمضمنة من UTR 3'.
وأخيراً، تمت دراسة تعديل استقرار الحمض النووي الريبي αENaC بواسطة البروتينات الملزمة للحمض النووي الريبي (RBP) مع هذا النموذج. نسخ αENaC مرنا مع epitope V5 من ناقلات pTRE-ضيق تحت السيطرة الحصرية من tTA-Adv. Dhx36، Tial1، وhnRNPK هي ثلاثة RBPs التي ترتبط 3 ' UTR من αENaC24. ولذلك، فإن أي تعديل للتعبير من V5-αENaC بعد cotransfection مع Dhx36، Tial1، أو hnRNPK، سيكون نتيجة لتعديل استقرار مرنا وليس من التشكيل النسخ. ويبين الشكل 7 أن التعبير المفرط لـ Dhx36 أو Tial1، على عكس ذلك من hnRNPK، قلل من استقرار V5-αENaC مرنا بالمقارنة مع transfection مع البلازميد pcDNA3 فارغة، مما يدل على تعديل محددة من بعض RBPs.
بشكل جماعي، أكدت هذه النتائج أن نظام التعبير بلازميد الذي تم التحكم فيه من قبل Tet-Off الذي قمنا بتطويره يمثل أداة مناسبة لتقييم العمر النصفي الفعلي للنص والآليات المشاركة في تعديله. هذه الأداة سوف تكون مفيدة في الحصول على رؤى جديدة في التنظيم بعد النسخ من GOIs الرئيسية المشاركة في وظيفة ظهارة السنخية في الظروف الفسيولوجية والمرضية.
الشكل 1: كفاءة نقل الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية عن طريق الكهربية ماصة. تم نقل الخلايا الظهارية السنخية الأولية بشكل عابر مع 2 ميكروغرام من البلازميد pcDNA3 (فارغة، واستنساخ #1 #2) التي أعربت عن أو لم تعبر عن بروتين GFP. تم تقييم كفاءة الترانفسيفشن 48 ح بعد الترانجس من قبل(أ)المجهر الفلوري أو(B)تدفق القياس الخلوي. في اتجاه واحد ANOVA وبونفيروني اختبار ما بعد مخصص; *p < 0.001 مقابل فارغ. واستخدمت خلايا من أربعة فئران مختلفة على الأقل (ن ≥ 4) لكل حالة تجريبية. مقياس شريط = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تعديل الحمض النووي الريبي الذاتي αENaC بواسطة الدوكسيسيكلين في الخلايا الظهارية الألخية. عولجت الخلايا الظهارية الألفية مع 1.0 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين لفترة من 1-24 ساعة. تم قياس تعبير αENaC mRNA بواسطة الـ RT-PCR الكمي وتقديمه كتعبير عن αENaC mRNA ± SEM مقارنة بالتعبير في الخلايا غير المعالجة (Ctrl؛ t = 0) بعد التطبيع وفقًا للتعبير α-actin (ANOVA أحادي الاتجاه ، n = 4). لم الدوكسيسيكلين لم تعدل الذاتية αENaC مرنا مع مرور الوقت. نُشرت سابقاً كشخصية S4 في Migneault et al.24. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تطبيع تعبير GOI مرنا مع طريقة Cq معدلة وفقا للتعبير عن مرنا التنظيمية tTA-Ad. كانت الخلايا الظهارية الالفيولار عابرة cotransiمع بلازميد pTet-Off وبطاريد pTRE-Tight ترميز αENaC cDNA تحمل V5 epitope المنبع من إطار القراءة المفتوحة وتسلسل UTR 3'كاملة. تم قياس التعبير عن V5-αENaC وtTA-Ad mRNAs بواسطة RT-PCR الكمي في الخلايا غير المعالجة. (أ)يتم تصوير إشارات الفلورسنت الخضراء SYBR ذات الحالة الطبيعية من V5-αENaC و tTA-Ad من جهازي نقل منفصلين (R1 و R2). (ب)الرسم البياني الأيسر: يتم التعبير عن mRNA من V5-αENaC و tTA-Ad في كل تجربة (R1 و R2) كقيمة كمية الدورة (Cq). يتم تقديم الفرق بين V5-αENaC وtTA-Ad mRNA التعبير (ΟCq). الرسم البياني الأيمن: استخدام tTA-Ad مرنا بدلا من الجين التدبير المنزلي يسمح تطبيع كفاءة للتعبير من GOI، والتي أظهرت تعبيرا نسبيا من 0.98 في R1 بالمقارنة مع ذلك في R2. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: حركية تدهور V5-αENaC مرنا عند استخدام نظام التعبير البلازميد الذي يتم التحكم فيه بشكل النسخي في وجود وعدم وجود actinomycin D. كانت الخلايا الظهارية السنخية الأولية مصابة بشكل عابر بالبلازميد pTet-Off وترميز البلازميد pTRE-tight αENaC cDNA الذي يحمل V5 epitope المنبع من إطار القراءة المفتوح وتسلسل UTR الكامل 3'. تم احتضان الخلايا المعالجة مسبقًا أو غير المعالجة بالأكتينوميكسين D (5.0 ميكروغرام/مل) لمدة 30 دقيقة بعد ذلك بالدوكسيسيكلين (1.0 ميكروغرام/مل) لمدة 15 دقيقة-6 ساعة. تم قياس التعبير عن V5-αENaC مرنا بواسطة الـ RT-PCR الكمية وقدم كنسبة مئوية ± SEM من التعبير V5-αENaC mRNA في الخلايا غير المعالجة (t = 0) بعد التطبيع وفقا للتعبير عن tTA-Ad. تم تقدير نصف عمر V5-αENaC mRNA من خلال الانحدار غير الخطي للتحلل من مرحلة واحدة لكل إعداد للخلية. كشف تحليل الانحدار المتعدد عن اختلاف مهم إحصائياً في ثبات الحمض النووي الريبي V5-αENaC في الخلايا المعالجة بالأكتينوموسين D مقارنة بخلايا الخلايا غير المعالجة (p < 0.0001). واستخدمت خلايا من أربعة فئران مختلفة على الأقل (ن ≥ 4) لكل حالة تجريبية. نُشرت سابقاً كالشكل 1 في Migneault et al.24. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تعديل ثبات V5-αENaC مرنا من خلال الضغوط الخلوية والالتهابية المختلفة. كانت الخلايا الظهارية السنخية الأولية مصابة بشكل عابر بالبلازميد pTet-Off وترميز البلازميد pTRE-tight αENaC cDNA الذي يحمل V5 epitope المنبع من إطار القراءة المفتوح وتسلسل UTR الكامل 3'. تم علاج الخلايا مسبقًا لمدة 30 دقيقة مع 1.0 ميكرومتر سيكلوهيكسيدي(CHX) (A)أو 15 ميكروغرام/مل LPS(B)أو لمدة 5 ساعة مع 100 نانوغرام/مل TNF-α(C)،يليها العلاج بـ 1.0 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين لمدة 15-120 دقيقة. تم قياس التعبير عن V5-αENaC مرنا بواسطة الـ RT-PCR الكمية وقدم كنسبة مئوية ± SEM من التعبير V5-αENaC mRNA في الخلايا غير المعالجة (t = 0) بعد التطبيع وفقا للتعبير عن tTA-Ad. واستخدمت خلايا من ثلاثة فئران مختلفة على الأقل (ن ≥ 3) لكل حالة تجريبية. (د)تمت مقارنة نصف العمر (t1/2)من V5-αENaC مرنا في الخلايا المعالجة إلى نصف عمر مرنا في الخلايا (Ctrl). تم قياس نصف العمر وفقًا لمعدل ثابت (K) لمنحنى تدهور V5-αENaC مرنا باستخدام المعادلة t1/2 = ln 2/K ثم تم التعبير عنه كدقيقة ± SEM (اختبار ANOVA أحادي الاتجاه واختبار Bonferroni post hoc؛ *p < 0.01 vs. control؛ n ≥ 3). مقتبس من الشكل 36 الذي سبق نشره في Migneault، F.25. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: استخدام استراتيجية الاستنساخ للحذف التتابعي للكشف عن دور مناطق مختلفة من utR αENaC 3'في تعديل استقرار مرنا. (أ)خريطة تخطيطية لنسخة V5-αENaC مع 3 'UTR الكامل إدراجها في ناقلات التعبير pTRE-ضيق. يتم تصوير إطار القراءة المفتوح كمربع رمادي، بينما يظهر UTR 3 'كمربع أبيض. يصور الجزء UTR 3 ' من αENaC مرنا للاستنساخ تحمل UTR 3 'كاملة وللطفرات حذف مختلفة (ديل 1 إلى ديل 4). (ب)تم cotransial خلايا الظهارة السنخية الأولية بشكل عابر مع البلازميدات pTRE-ضيق ترميز مختلف αENaC 3' UTR حذف المسوخ جنبا إلى جنب مع باسيتيد pTet-Off, الذي يعبر عن tTA-Ad, للسماح التعبير محددة من بناء وتثبيط من قبل الدوكسيسيكلين. 72 ح بعد الترانزفيشن، عولجت الخلايا بالدوكسيسيكلين (1.0 ميكروغرام/مل) لمدة 15 دقيقة إلى 6 ح. تم قياس تعبير V5-αENaC مرنا بواسطة الـ RT-PCR الكمي وتقديمه كنسبة مئوية ± SEM من التعبير V5-αENaC mRNA في الخلايا غير المعالجة (t = 0) بعد التطبيع وفقا للتعبير عن tTA-AD. تم تقدير نصف عمر V5-αENaC mRNA لكل بناء من ثابت المعدل (K) لمنحنى تدهور V5-αENaC mRNA باستخدام المعادلة التالية: t1/2 = ln 2/K. يظهر الاضمحلال V5-αENaC مرنا للاستنساخ مع كامل 3 ' UTR (شركات) وديل 1 إلى ديل 4 'UTR المسوخ حذف. يتم إعطاء نصف العمر (t1/2)من تسوس مرنا لكل استنساخ. في الربع الأيمن السفلي، يُظهر الرسم البياني مقارنة بين قيم t1/2 ± SEM المختلفة المقدرة لكل نسخة. ف < 0.05 بين المجموعات المختلفة وفقا لاختبار Kruskal-Wallis. * p < 0.05 وفقا لاختبار دان بعد مخصص بالمقارنة مع 3 'UTR كاملة. Οp < 0.05 وفقا لاختبار دان بعد مخصص مقارنة ديل 3. واستخدمت خلايا من خمسة أنواع مختلفة على الأقل (ن ≥ 5) لكل حالة تجريبية. مقتبس من الشكلين 2 و 3 التي نشرت سابقا في Migneault وآخرون24. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: التشكيل اللاحق للنسخ من V5-αENaC مرنا من قبل البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة hnRNPK، Dhx36، وTial1. (أ)تم cotranstransal الخلايا الظهارية السنخية الأولية مع pTRE-ضيق plasmid ترميز V5-αENaC مرنا جنبا إلى جنب مع ناقل التعبير لDhx36، hnRNPK، أو Tial1 RBPs وبلازميد pTet-Off. تم قياس تعبير V5-αENaC mRNA من قبل RT-qPCR 72 h posttransfection وأعرب عن النسبة المئوية ± SEM من V5-αENaC mRNA التعبير بالمقارنة مع ذلك في الخلايا المنقولة مع ناقل فارغ (pcDNA3) بعد التطبيع وفقا للتعبير tTA-Ad. overexpression Dhx36 وTial1 تثبيط بشكل كبير V5-αENaC mRNA التعبير، في حين أن الإفراط في التعبير من hnRNPK لم يكن له أي تأثير. * p < 0.05 وفقا لاختبار Kruskal-Wallis واختبار دان بعد مخصص بالمقارنة مع ناقلات فارغة؛ ن ≥ 3 عينات من الحيوانات المختلفة تم اختبارها في نسخة مكررة لكل حالة تجريبية. (ب)تم حذف الجزء القريب من αENaC 3 ' UTR عن طريق استنساخ المنطقة البعيدة من UTR 3 ' بجوار وقف αENaC codon في البلازميد pTRE-ضيق (V5-αENaC-Del5). (C)تم إصابة الخلايا الظهارية السنخية الأولية بـ V5-αENaC أو V5-αENaC-Del5 في متجه pTRE-tight جنباً إلى جنب مع البلازميد pTet-Off ومتجه التعبير لـ Dhx36 أو Tial1 RBP overexpression. تم قياس تعبير V5-αENaC mRNA من قبل RT-qPCR 72 h posttransfection وأعرب عن النسبة المئوية ± SEM من V5-αENaC mRNA التعبير بالمقارنة مع ذلك في الخلايا المنقولة مع ناقلات فارغة (pcDNA3) بعد التطبيع وفقا للتعبير عن tTA-Ad. لم يكن للتعبير المفرط لـ Dhx36 و Tial1 أي تأثير على التعبير V5-αENaC-Del5 mRNA. *p < 0.05 وفقا لاختبار Kruskal-Wallis واختبارات دان بعد مخصص عند مقارنة ناقلات التجريبية إلى ناقلات فارغة؛ #p < 0.05 وفقا لاختبار مان ويتني U عند مقارنة ناقلات التجريبية إلى 3 'UTR متحولة كاملة; ن ≥ 6 لكل حالة تجريبية. مقتبس من الشكلين 5 و 7 المنشورين سابقا في Migneault et al.24. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أ | |||
| قالب | 3' UTR | معني | تسلسل |
| αENaC cDNA | كامله | و | 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGTG GTAAGCCTATCCCAACCCT CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATGATTTAtTATTAجتاك CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| ديل 1 | R | 5'- GCACTAATGATTTTTTGTTCT GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| ديل 2 | R | 5'- GCACTAATATTTAACTAA CAAGGGGGCTTTGGG-3' |
|
| ديل 3 | R | 5'-GCACTAATGATTTATTGTGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3' |
|
| ديل 4 | R | 5'-GCACTAATGATTTATTTTCAGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| ديل 5 | R | 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| و | 5'-ATCGCAGAATCTGTGTCTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| ب | |||
| الهدف | معني | تسلسل | |
| V5-αENaC | و | 5'-CCTAACCCTCTCGGTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATGGTGCCCTCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | و | 5'-GCCTGACGACAAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGTGTATGATGCCGTCC-3' | ||
الجدول 1: الالتمهيديات المستخدمة في هذه الدراسة. (أ)البراليرات المستخدمة في الاستنساخ وتوليد المسوخ V5-αENaC في ناقلات pTRE-ضيق inducible. (ب)المبادئ التمهيدية المستخدمة لقياس التعبير مرنا بواسطة الـ RT-PCR الكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان انخفاض معدل الترانسفيكال للخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية قيدًا خطيرًا على استخدام نظام Tet-Off لتقييم استقرار مرنا في هذه الخلايا. ومع ذلك ، تم التغلب على هذا القيد عن طريق الكهربية ماصة ، مما يسمح بكفاءة نقل 25-30 ٪(الشكل 1 والشكل 3)26.
قياس استقرار النص أمر أساسي لفهم تعديل مرنا معين وتأثيره على التوازن الخلوي والتمثيل الغذائي. قد يؤدي الاختلاف في التوافر البيولوجي لـ GOI إلى تغيير كفاءة الترجمة والتأثير المباشر على التعبير عن GOI في الخلية. ولهذه الأسباب، تم تطوير عدة تقنيات لتحديد نصف عمر هذه الـ mRNAs. وكما نوقش أعلاه، فإن لكل من هذه التقنيات قيوداً وقيوداً تحول دون إجراء دراسة سليمة لنص الفائدة. بالمقارنة مع تقنيات أخرى، فإن نموذج TET-off الذي تم تطويره هنا لديه ميزة السماح بتقدير نصف العمر لـ مرنا معين تحت أي حالة تجريبية. ومع ذلك ، فإنه لا يسمح لنا بدراسة مباشرة استقرار نسخة محلية. للتغلب على هذا القيد قدر الإمكان ، يقترح تضمين تسلسل اتو 2و و 3 ' UTR للنسخة في البلازميد بحيث يكون البناء مشابهًا قدر الإمكان للنصوص الذاتية. إضافة epitope V5 يسمح تضخيم محددة من مرنا الهدف من قبل RT-qPCR مقابل أن من النص الذاتية. وفيما يتعلق باستراتيجية الاستنساخ، فإن اختيار التسلسل المدرج في المنبع للجين المعني أمر بالغ الأهمية لمنع تضخيم الإشارات غير المحددة. إضافة تسلسل V5 epitope 5 ' من ORF ضروري لتضخيم qPCR محددة من البناء بسبب طوله القصير وعدم التعبير عنه في الخلايا الظهارية السنخية. كما توفر هذه الاستراتيجية الفرصة لدراسة تعديل ترجمة البروتين باستخدام نفس النظام غير القابل للاختزال. على الرغم من صغر حجم النسخة V5 (42 nt) ، فإنه لا يزال من الممكن أن هذا قد يؤثر على استقرار النسخ. لهذا السبب، يقترح أيضا لاختبار epitopes أخرى، مثل hemagglutinin الأنفلونزا البشرية (HA) أو أي تسلسل آخر لم يتم العثور عليها في نسخة من الخلايا الظهارية السنخية.
أحد قيود النظام هو استخدام الدوكسيسيكلين لمنع النسخ من GOI. تظهر العديد من التقارير أن الدوكسيسيكلين يمكن أن يكون له تأثير كبير على استقلاب الخلايا. استخدام هذا المضادات الحيوية في 16HBE14 خلايا الشعب الهوائية يقلل من الانتشار ويزيد من الوفيات بسبب موت الخلايا المبرمج27. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت بالفعل الدوكسيسيكلين أن تشارك في تعديل الاستجابة التهابات LPS28. لذلك ، يمكن أن يكون لهذا المضادات الحيوية آثار خارج الهدف قد تؤثر على استقرار مرنا لـ GOI معين. لهذه الأسباب، قمنا بتقييم تأثير 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين على مدى فترة 24 ساعة على الخلايا غير المصابة بالعدوى ووجدنا أنه لم يحدث أي تغيير في التعبير الذاتي αENaC مرنا(الشكل 2). وقد تم اختيار هذا التركيز لأنه يستخدم على نطاق واسع لمنع تماما النسخ من نظام تيت حالا ويوصى للحد من الآثار السامة للخلايا29. نقترح استخدام هذا التركيز في الخلايا الظهارية السنخية ونوصي بالتحقق من صحة التركيز الأمثل لدراسة الجينات الأخرى أو استخدام أنواع الخلايا الأخرى مع نظام Tet-Off.
يستخدم نظامنا التعبير التأسيسي لـ GOI حتى يتم تثبيط النسخ بواسطة الدوكسيسيكلين. وقد اقترح أن تركيزات مرنا المفرطة قد تكون سامة للخلية وتؤثر على عملية التمثيل الغذائي. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغيير في استقرار نص GOI ، مما تسبب في تدهوره السريع بسبب فرط التعبير غير الفسيولوجي30. في حالة نموذج Tet-Off ، لم يتم ملاحظة مثل هذه السمية ، لأن الخلايا المنقولة أظهرت مورفولوجيا مماثلة لتلك الموجودة في الخلايا غير المصابة السليمة (البيانات غير موضحة). وفقا لتاني وآخرون31، الذين أثبتوا صحة نظام Tet-Off في تحديد نصف عمر مرنا ، أظهرت نتائجنا أن نظام Tet-Off ليس سامًا في الخلايا الظهارية السنخية وينتج نصف عمر لـ αENaC mRNA لا يعكس الإفراط في الاستقرار الذي تم الإبلاغ عنه في وجود مثبطات النسخ مثل actinomycin D(الشكل 4).
إن تطوير هذا النظام لقياس نصف عمر مرنا يتحدى النتائج التي لوحظت عندما تم قياس ثبات النصوص في وجود مثبطات النسخ مثل actinomycin D. توضح هذه الطريقة أن نصف عمر النص قد يكون أقصر بكثير مما تم قياسه مسبقًا.
نموذجنا مناسب للغاية لدراسة التشكيل بعد النسخ لنسخة محددة في ظل ظروف مختلفة ، بما في ذلك الظروف المؤيدة للالتهابات أو التعبير المفرط RBP ، وكذلك بعد العلاج مع إسكات الحمض النووي الريبي. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح توصيف المناطق غير المترجمة الضرورية لتعديل ما بعد النسخ من الحمض النووي الريبي في الظروف الفسيولوجية المرضية التي تؤثر على الخلايا الظهارية السنخية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تلقى فرانسيس Migneault الدعم من زمالة قدمتها شبكة الصحة التنفسية في كيبيك والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) برنامج تدريب الرئة ، ومنحة طلابية من FRSQ ومنحة طلابية من كلية الدراسات العليا وغيرها ما بعد الدكتوراه، جامعة مونتريال. وقد دعم هذا العمل كرسي جوسلين لاماري في البحوث السريرية والمعاهد الكندية للبحوث الصحية [YBMOP-79544].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M.
- Ross, J.
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A.
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
