Summary
Qui, presentiamo uno strumento che può essere utilizzato per studiare la modulazione posttranscriptionale di una trascrizione nelle cellule epiteliali alveolare primarie utilizzando un sistema di espressione inducibile accoppiato a una tecnica di elettroporazione pipetta.
Abstract
Studiare la regolazione posttranscrittivale è fondamentale per comprendere la modulazione di un dato RNA messaggero (mRNA) e il suo impatto sull'omeostasi cellulare e sul metabolismo. Infatti, le fluttuazioni nell'espressione della trascrizione potrebbero modificare l'efficienza della traduzione e, in ultima analisi, l'attività cellulare di una trascrizione. Sono stati sviluppati diversi approcci sperimentali per studiare l'emivita dell'mRNA, anche se alcuni di questi metodi hanno limitazioni che impediscono il corretto studio della modulazione posttranziale. Un sistema di induzione promotore può esprimere un gene di interesse sotto il controllo di un promotore sintetico regolato dalla tetraciclina. Questo metodo consente la stima dell'emivita di un dato mRNA in qualsiasi condizione sperimentale senza disturbare l'omeostasi cellulare. Uno dei principali inconvenienti di questo metodo è la necessità di traffecare le cellule, che limita l'uso di questa tecnica in cellule primarie isolate che sono altamente resistenti alle tecniche di trasfezione convenzionali. Le cellule epiteliali alveolar nella coltura primaria sono state ampiamente utilizzate per studiare la biologia cellulare e molecolare dell'epitelio alveolare. Le caratteristiche uniche e il fenotipo delle cellule alveolare primarie rendono essenziale studiare le modulazioni posttrantalionali dei geni di interesse in queste cellule. Pertanto, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un nuovo strumento per studiare le modulazioni posttranscriptionali degli mRNA di interesse per le cellule epiteliali alveolar nella cultura primaria. Abbiamo progettato un protocollo di trasfezione transitoria veloce ed efficiente per inserire un sistema di espressione plasmid a controllo transciriptionally nelle cellule epiteliali alveolare primarie. Questa strategia di clonazione, usando un epito virale per etichettare il costrutto, consente la facile discriminazione dell'espressione costruttiva da quella degli mRNA endogeni. Utilizzando un metodo modificato del ciclo di quantificazione (Cq), l'espressione della trascrizione può quindi essere quantificata a intervalli di tempo diversi per misurarne l'emivita. I nostri dati dimostrano l'efficienza di questo nuovo approccio nello studio della regolazione posttrancriale in varie condizioni patologiche nelle cellule epiteliali alveolari primarie.
Introduction
Sono state sviluppate diverse tecniche per determinare l'emivita degli mRNA. La tecnica di decadimento dell'impulso-chase, che utilizza mRNA etichettati, consente la valutazione simultanea di un grande pool di mRNA con disturbo cellulare minimo. Tuttavia, questo approccio non consente una stima diretta dell'emivita di una singola trascrizione genica e non può essere implementato per studiare la modulazione post-trascrizione di un mRNA in seguito alla stimolazione con fattori di crescita, ROS, alarmins o infiammazione1.
L'uso di inibitori della trascrizione, come l'actinomycin D e la z-amanitina, è un metodo relativamente semplice per misurare la cinetica da degradazione dell'mRNA nel tempo. Uno dei principali vantaggi di questo approccio rispetto a quello delle tecniche precedenti (cioè l'inseguimento a impulsi) si basa sulla capacità di stimare direttamente l'emivita di una determinata trascrizione e di confrontare il modo in cui i diversi trattamenti potrebbero influenzare la sua cinetica degradante. Tuttavia, il significativo impatto deleterio degli inibitori della trascrizione sulla fisiologia cellulare rappresenta un grave inconveniente dell'approccio2. Infatti, l'inibizione dell'intero trascrittoma cellulare con questi farmaci ha l'effetto collaterale negativo di perturare la sintesi di elementi chiave coinvolti nella stabilità dell'mRNA, come i microRNA (miRNA), nonché l'espressione e la sintesi delle proteine che legano l'RNA, che sono importanti per la degradazione e la stabilità dell'RNA. La grave perturbazione della trascrizione genica da parte di questi farmaci potrebbe quindi modificare artefatto le curve di degradazione delle trascrizioni.
Il sistema di induzione del promotore rappresenta un terzo approccio per misurare l'emivita di un mRNA specifico. Questo metodo misura la degradazione di un mRNA specifico in modo simile ai metodi che utilizzano inibitori della trascrizione. Vengono spesso utilizzati due tipi di sistemi di induzione: ilpromotore c-fos 3 indotto dal siero e il sistema inducibile Tet-Off4. Con il sistema c-fos, l'uso di inibitori della trascrizione che possono essere tossici per la cellula non è necessario. Tuttavia, questo metodo richiede la sincronizzazione del ciclo cellulare, che impedisce la valutazione della stabilità effettiva di una trascrizione durante l'interfase5. Al contrario, il sistema Tet-Off consente la forte espressione del gene di interesse (GOI) sotto il controllo di un promotore sintetico regolato dalla tetraciclina. Questo sistema richiede la presenza di due elementi che devono essere cotrastati nella cellula per essere funzionale. Il primo plasmide (pTet-Off) esprime la proteina regolatrice tTA-Adv, un fattore di trascrizione sintetica ibrido composto dal repressore procatotico TetR (da Escherichia coli) fuso a tre domini di trasattivazione della trascrizione dalla proteina virale HSV VP16. Il GOI è clonato nel plasmidp pTRE-Tight sotto il controllo di un promotore sintetico (PTight), che comprende la sequenza minima del promotore di citomegalovirus (CMV) fuso a sette ripetizioni della sequenza dell'operatore tetO. La trascrizione del gene a valle di PTight dipende dall'interazione di TetR con il tetO. In presenza di tetraciclina o della sua derivata, doxycycline, il repressore TetR perde la sua affinità per l'operatore tetO, portando ad una cessazione della trascrizione4. Le caratteristiche del sistema Tet-Off lo rendono un modello ideale per lo studio dell'espressione specifica dell'mRNA nelle cellule eucariotiche, evitando potenziali effetti pleiotropici che sono secondari all'assenza di sequenze regolatorie procariotiche nella cellula eucastica6. Di solito, doppiamente stabile Tet-Off linee cellulari (HEK 293, HeLa, e PC12) sono utilizzati con questo sistema per integrare copie del regolatore e plasmidi di risposta per un comodo accesso all'espressione genica controllabile7,8,9.
Diversi modelli di cellule epiteliali alveolare in coltura sono stati utilizzati per studiare la biologia cellulare e molecolare dell'epitelio alveolare. Per anni, i ricercatori hanno ampiamente utilizzato cellule primarie umane o roditori10,11 così come immortalato linee cellulari come a549 umano o ratto RLE-6TN cellule12,13. Anche se sono generalmente meno proliferale e più difficili da coltura e da transfettare, le cellule epiteliali alveolare nella coltura primaria rimangono il gold standard per lo studio della funzione e della disfunzione dell'epitelio alveolare in condizioni fisiologiche e patologiche. Infatti, le linee cellulari immortalate come le cellule A549 non presentano le caratteristiche complesse e i fenotipi delle cellule primarie, mentre le cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria riassumono le principali proprietà dell'epitelio alveolare, in particolare la capacità di formare una barriera polarizzata e stretta14,15. Sfortunatamente, queste cellule sono molto resistenti alle tecniche di trasfezione convenzionali, come quelle che utilizzano liposomi, rendendo molto difficile l'uso di un sistema indotto dal promotore come il Tet-Off.
La modulazione posttranziale dei mRNA è uno dei metodi più efficaci per modulare rapidamente l'espressione genica di una trascrizione16. La regione non tradotta di mRNA 3' (3' UTR) svolge un ruolo importante in questo meccanismo. È stato dimostrato che, a differenza dell'UTR 5', esiste una correlazione esponenziale tra la lunghezza dell'UTR 3' e le complessità cellulari e morfologiche di un organismo. Questa correlazione suggerisce che l'UTR 3', come le regioni di codifica dell'mRNA, è stato sottoposto a selezione naturale per consentire una modulazione posttranscrittivale sempre più complessa nel corso dell'evoluzione17. L'UTR 3' contiene diversi siti di legame per proteine e miRNA che influenzano la stabilità e la traduzione della trascrizione.
Nel lavoro attuale, abbiamo sviluppato uno strumento per studiare il ruolo dei domini altamente conservati nell'UTR 3' di un GOI per il controllo della stabilità della trascrizione. Ci siamo concentrati sul canale epiteliale di sodio, sottounità alfa ( , che svolge un ruolo chiave nella fisiologia epiteliale alveolare18. Le cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria sono state trascate con successo con i due componenti del sistema Tet-Off, il che consente di studiare il ruolo del 3' UTR nella stabilità dell'mRNA con un sistema che influisce minimamente sulla fisiologia cellulare e sul metabolismo rispetto all'uso di inibitori della trascrizione con altri protocolli. È stata sviluppata una strategia di clonazione per differenziare l'espressione del GOI da quella del gene endogeno utilizzando un epitopo non endogenamente espresso (V5). La risposta e i plasmidi normativi sono stati poi trasferiti nelle cellule epiteliali alveolare utilizzando una tecnica di elettroporazione pipetta. Successivamente, l'espressione della trascrizione è stata misurata incubando le cellule con doxycyclina a diversi intervalli di tempo. L'emivita della trascrizione è stata valutata da RT-qPCR con un metodo Cq modificato utilizzando il prodotto transfetto tTA-Ad mRNA per la normalizzazione. Attraverso il nostro protocollo, offriamo un modo conveniente per studiare la modulazione posttrancrionale di una trascrizione in diverse condizioni e definire il coinvolgimento delle regioni non tradotte in modo più dettagliato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali del Centro di ricerca del Centro di Ricerca del Centro Ospedaliero de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Progettazione e generazione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI)
- Utilizzare un vettore inducibile di tetraciclina, ad esempio pTRE-Tight.
- Analizzare la sequenza del GOI e del sito di clonazione multipla (MCS) del vettore per identificare i siti di restrizione nel servizio MCS che non sono presenti internamente nel GOI.
- Isolare le cellule epiteliali alveolare primarie dai polmoni di ratto Sprague-Dawley maschili come descritto in precedenza19,20.
- Purificare l'RNA totale dalle cellule epiteliali alveolare mediante l'estrazione dell'RNA utilizzando un metodo standard, come l'estrazione del fenolo/cloroformio o l'uso di colonne di spin dell'RNA a base di silice.
- Trascrivere in modo inverso l'mRNA in DNA complementare (cDNA) usando oligo(dT) e la trascrizione inversa ad alta fedeltà.
- Utilizzare la polimerasi Taq ad alta fedeltà e le tecniche PCR di sovrapposizione standard per affiancare il GOI con due siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione selezionati utilizzando primer progettati.
- Chiedi al primer in avanti di contenere un sito di legame di consensoKozak 21 per migliorare i livelli di espressione per studiare l'espressione proteica in parallelo con la stabilità dell'mRNA. Una sequenza che codifica l'epitopo V5 a monte del GOI deve essere inclusa per distinguere l'espressione del GOI trasinfezione dall'espressione endogena (Tabella 1).
- Chiedi al primer inverso di contenere un segnale di poliadenilazione dopo lo stop codon.
- I mutanti possono essere generati mediante delezione sequenziale per studiare gli effetti di diverse regioni UTR 3' sulla stabilità dell'mRNA del GOI utilizzando primer invertiti che codificano un sito di poliadenazione che elimina gradualmente la fine 3' dell'UTR(Figura 6). In alternativa, la mutagenesi diretta da PCR può essere utilizzata per indirizzare una specifica regione di interesse nell'UTR223' .
- Digerire il vettore inducibile e l'inserto con gli enzimi di restrizione scelti in precedenza alla temperatura di incubazione appropriata per 1 h, seguiti dal trattamento con fosfana durante la reazione vettoriale per 30 min per evitare l'auto-legamento.
- Separare il vettore digerito e i segmenti di inserto per elettroforesi in un gel di agarose 1-1,5% (concentrazione a seconda delle dimensioni dell'inserto).
- Utilizzando una lama e una luce UV, raccogliere i frammenti di DNA contenenti l'inserto e il vettore desiderato da ligated.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. - Purificare i segmenti raccolti dal gel di agarose utilizzando un kit di purificazione PCR a base di silice e misurare la concentrazione per spettrofotometria a 260 nm.
- Ligate il GOI e il vettore inducibile con legamento del DNA T4 utilizzando un rapporto molare vector:insert di 1:3 per aumentare la probabilità di legatura. Incubare la reazione a temperatura ambiente (RT) per 3 h.
- Trasformare la reazione di legatura in competente E. coli (DH5).
- Aggiungere 1-10 ng di vettore e gene a un tubo contenente 100 -L di cellule competenti. Incubare le cellule sul ghiaccio per 30 min e poi le cellule di shock termico a 42 s. per 45 s. Mettere il tubo sul ghiaccio per 2 min e aggiungere 900 L di mezzo RT LB. Incubare le cellule per 1 h a 37 s con agitazione a 225 giri/min.
- Stendere 100 l della reazione su una piastra di agar LB con un antibiotico adatto (ad esempio, 100 ampicillina g/mL per il vettore pTRE-Tight) per selezionare i batteri trasformati. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi centigradi.
- Selezionare le singole colonie utilizzando un ciclo di inoculazione o una punta di 20 -L e incubare durante la notte in mezzo 5 mL LB contenente l'antibiotico adatto a 37 gradi centigradi con agitazione. I batteri trasformati possono essere immagazzinati in scorte di glicerolo a -80 gradi centigradi ad un rapporto di 400:600 di LB medio a glicerolo.
- Estrarre il DNA plasmide utilizzando colonne di plasmico a base di silice e misurare la concentrazione per spettrofotometria a 260 nm. Confermare l'inserimento del GOI mediante l'analisi delle restrizioni e il suo orientamento e l'assenza di mutazioni potenzialmente introdotte durante RT-PCR mediante sequenziamento.
2. Trasfezione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI) in cellule epiteliali alveolar primarie
- Isolare le cellule epiteliali alveolare di tipo II dai polmoni del ratto.
- Semina le cellule ad una densità di 1 x 106 celle/cm2 in 100 mm piatti Petri con mezzo essenziale minimo completo (MEM completo). MEM completo è MEM integrato con 10% FBS, 0.08 mg/L tobramycin, Septra (3 g/mL trimethoprim e 17 zollo-mL sofamethoxazole), 0.2% NaHCO3, 0.01 M HEPES (pH - 7.3), e 2 mM L-glutamine. Colture le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi in 5% CO2 in un'incubatrice umidificata.
- Il giorno successivo, mettere 500 l una di MEM completa senza antibiotico in ogni pozzo di una nuova piastra da 12 pozze e preriscaldare la piastra a 37 gradi centigradi per 30 minuti. Durante questo passaggio, è importante utilizzare siero bovino fetale privo di tetracicline contaminanti o con un livello troppo basso per interferire con l'inducibilità.
- Preparare tubi da 1,5 mL contenenti il plasmide con il GOI inducibile (plasmide GOI) e il vettore regolatore (ad esempio, pTet-Off) aggiungendo 1 g di plasmide GOI e 1 g di vettore regolatore per pozzo a RT. Per gli esperimenti di coespressione con le proteine leganti l'RNA (RBP), al mix di DNA(Figura 7)viene aggiunto uno g di un vettore costitutivo (ad esempio, pcDNA3) che esprime l'RPB di interesse al mix di DNA ( Figura 7 ).
- Aspirare il mezzo e sciacquare delicatamente le cellule con PBS (senza calcio e magnesio) preriscaldato a 37 gradi centigradi.
- Aggiungere 5 mL di 0,05% di metapsina preriscaldata a 37 gradi centigradi e incubare le cellule fino a quando le cellule non vengono staccate (2-4 min). Neutralizzare la prova aggiungendo 10 mL di MEM completo senza antibiotici.
- Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL, lavare la piastra Petri con 4 mL di mezzo per raccogliere il maggior numero possibile di cellule rimanenti, quindi centrificare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min.
- Aspirare delicatamente e scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS. Contare e calcolare il numero di celle utilizzando un emocitometro.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min. Aspirare delicatamente il supernatante e riutilizzare il buffer di sospensione del pellet ad una concentrazione di 4 x 107 celle / mL. Aggiungere le cellule del tubo da 1,5 mL preparate al punto 2,4 con una concentrazione di 400.000 cellule per pozzo e mescolarle delicatamente pipetting su e giù.
- Posizionare il tubo nel dispositivo di elettroporazione e riempirlo con 3,5 mL di tampone elettrolitico.
- Inserire una punta di elettrodo placcato oro in una pipetta premendo completamente il pistone. Mescolare delicatamente il contenuto del tubo da 1,5 mL e aspirare con cura le cellule con la pipetta. Fare attenzione a evitare che le bolle d'aria entrino nella punta, in quanto ciò causerà l'arco elettrico durante l'elettroporazione e porterà a una diminuzione dell'efficienza della trasfusione.
- Inserire la pipetta nella stazione di elettroporazione fino a quando non c'è un suono di clic.
- Selezionare il protocollo di elettroporazione appropriato per le celle epiteliali alveolare, corrispondente a una tensione a impulsi di 1.450 V e 2 impulsi con una larghezza di 20 ms, quindi premere Start sul touchscreen.
- Subito dopo la trasfezione, rimuovere la pipetta e trasferire le cellule in un MEM completo precedentemente riempito senza antibiotico che è stato preriscaldato a 37 gradi centigradi.
- Ripetere i passaggi da 2,11 a 2,14 per i campioni rimanenti.
- Scuotere delicatamente la piastra per stendere le cellule in modo uniforme sulla superficie del pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata. Dopo 2 giorni, sostituire il mezzo con MEM completo con antibiotici.
- Confermare il successo della trasfezione osservando l'espressione di eGFP al microscopio a fluorescenza o per citometria di flusso utilizzando un vettore di controllo (Figura 1).
NOTA: questo passaggio è facoltativo e richiede una fase di trasfezione aggiuntiva utilizzando un diverso plasmide che esprime eGFP, ad esempio pcDNA3-EGFP.
3. Induzione dell'inibizione della trascrizione del GOI
NOTA: Le cellule possono essere pretrattate con i trattamenti desiderati prima dell'induzione della doxyciclina per valutarne l'impatto sulla stabilità dell'mRNA (Figura 5).
- Preparare una soluzione di stock doxycycline di 1 mg/mL in acqua deionizzata. Conservare la soluzione di riserva a -20 gradi centigradi, protetta dalla luce. La doxyciclina, derivata da tetraciclina, viene utilizzata al posto della tetraciclina perché ha un'emivita più lunga (2x) della tetraciclina. Inoltre, è necessaria una minore concentrazione di doxycycline per la completa inattivazione del tet operon23.
NOTA: La doxycyclina potrebbe influenzare l'espressione mRNA del GOI endogeno. Per verificare questo, l'effetto di un trattamento di 24 ore con doxycyclina sulle cellule alveolar deve essere testato per confermare l'assenza di eventuali cambiamenti nell'espressione GOI (Figura 2). - Preparare una soluzione doxycycline fresca di 1 g/mL in completa meM 72 h post-trasfezione e scaldarla a 37 gradi centigradi.
- Sostituire il mezzo con 1 mL di MEM completo contenente 1 g/mL di doxycyclina per bene per inibire la trascrizione del GOI.
- Incubare più pozzi a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 per diverse quantità di tempo da 15 min-6 h per valutare l'emivita dell'mRNA del GOI.
- Alla fine del trattamento, lavare le cellule con PBS ghiacciato e visualizzarle con un kit di estrazione dell'RNA fenolo-cloroformio disponibile in commercio aggiungendo 500 L di tampone per pozzo e agitando la piastra per omogeneizzare le cellule.
- Isolare l'RNA in base al protocollo del produttore. Determinare la resa e la purezza dell'RNA mediante spettrofotometria a 230, 260 e 280 nm. I campioni di RNA con rapporti 260:230 e 260:280 di 1,8 e 2,0, rispettivamente, sono considerati puri.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. Determinazione della stabilità dell'mRNA del GOI
- Trattare 1 g di RNA totale con DNAse I (grado amplificazione) privo di RNAse per rimuovere qualsiasi traccia di DNA plasmide che potrebbe interferire con la successiva amplificazione del DNA.
- In un tubo PCR da 0,2 mL, unire 1 g di RNA totale, 1 -L di 10 volte buffer di reazione DNase I, 1 -L di DNAse I (1 U/L) e acqua senza RNAse per ottenere un volume totale di 10 L.
- Incubare la reazione a RT per 20 min.
- Disattivare il DNeAe I aggiungendo 1 OL di 25 mM di EDTA al mix di reazione da 10 litri e incubando la reazione a 70 gradi centigradi per 10 min.
- Transizza l'RNA totale impoverito dal DNA in cDNA utilizzando un kit di sintesi cDNA disponibile in commercio con una miscela di oligo(dT) e primer esalofi casuali per migliorare l'efficienza della trascrizione inversa.
- Aggiungete in breve 4 l di mix di reazione da 5 x, 1 luna di trascrizione inversa e 4 luna di acqua priva di RNAse a 11 l del mix di RNA totale impoverito di DNA per ottenere un volume di reazione totale di 20 L. Mescolare bene la reazione perpiperla su e giù.
- Incubare la reazione per 5 minuti a 25 gradi centigradi, seguita da 20 minuti a 46 gradi centigradi, quindi inattivare la reazione incubandola a 95 gradi centigradi per 1 min. Ogni reazione produrrà 50 ng/L di prodotto cDNA.
- Diluire la reazione cDNA a una concentrazione di 5 ng/L aggiungendo 180 l'acqua di biologia molecolare al mix di reazione 20 . Conservare i prodotti cDNA a -80 gradi centigradi o procedere immediatamente all'esecuzione di PCR quantitativo in tempo reale (qPCR).
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
- Progettare i primer qPCR in avanti e indietro specifici per il GOI.
- A causa dell'espressione endogena del GOI nelle celle, i primer devono essere progettati per amplificare un amplificatore da 100-150 bp dell'epitopo V5 accoppiato al GOI (Tabella 1).
- I primer genici di riferimento interno devono essere utilizzati anche come controlli di normalizzazione. Di solito, i geni delle pulidi, come i geni beta-actina e ipoxanthine fosfororaltransferyase 1, vengono utilizzati come geni di riferimento. Tuttavia, questi non possono essere utilizzati con questo sistema di induzione a causa della variazione dell'efficienza di trasfezione. Invece, l'espressione della trascrizione tTA-Ad viene valutata ai fini della normalizzazione, perché la sua espressione è costituitiva nelle cellule a causa dell'attività del promotore del citomegalovirus. Qualsiasi variazione nella sua espressione misurata da qPCR sarà rappresentativa dell'efficienza della trasfezione (primer: forward 5'-GCC TGA CGA CAGA CAA GGA AAC TC-3' e reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) e consentirà la normalizzazione dell'espressione dei cloni transfettati (Figura 3).
- Preparare ogni reazione qPCR in triplice copia utilizzando un mix di master colorante verde SYBR.
- Diluire il mix di cDNA 5 ng/L l a una concentrazione di 1,25 ng/L utilizzando acqua di biologia molecolare.
- Unire 5 gradi di Miscela Master di Coloranti Verde (2x), 0,1 l di acqua di biologia molecolare, 0,45 l di 7,5 M di primer in avanti, 0,45 L di 7,5 M di primer inverso e 4 gradi di 1,25 ng/L cDNA per ottenere un volume di reazione totale di 10,5 M ben da pipettaggio e giù in un piatto di 96 PC. Utilizzare pellicola adesiva ottica per garantire che il coperchio della piastra sia sigillato e per evitare la contaminazione e l'evaporazione.
- Abbassare brevemente il mix di reazione mediante centrifugazione e posizionare la piastra in un termociclista qPCR.
- Amplificare gli amplificatori GOI e tTA-Ad con tag V utilizzando le seguenti condizioni qPCR: 95 s per 10 min come fase di denaturazione, seguiti da 40 cicli di 95 gradi centigradi per 10 s, 58 gradi centigradi per 15 s e 72 gradi centigradi per 20 s. Una curva di fusione ad alta risoluzione deve essere generata dopo l'esecuzione dei cicli di amplificazione per valutare le temperature di fusione specifiche degli amplificatori desiderati e per garantire l'assenza di picchi di amplificatori rumore.
- Includere controlli negativi per il qRT-PCR eseguendo qPCR con RNA come modello senza trascrizione inversa per fungere da controllo per la potenziale contaminazione del DNA plasmide e qPCR senza cDNA aggiunto al mix qPCR per garantire la mancanza di dimeri primer o Contaminanti.
- La concentrazione ottimale di cDNA, l'efficienza del primer e la concentrazione devono essere ottimizzate secondo il GOI da un analisi della curva standard. A tale scopo, eseguire una diluizione seriale utilizzando cDNA da cellule non trattate (coltivate senza doxyciclina). La curva standard viene generata tracciando i valori Cq rispetto al registro del fattore di diluizione cDNA e l'efficienza di amplificazione (E) viene calcolata in base alla pendenza della curva standard utilizzando la seguente formula:
E - 10-1/pendenza
NOTA: l'efficienza di amplificazione dovrebbe essere di circa 0,9 a 1,05. In caso contrario, i primer devono essere riprogettati.
- Analizzare i dati qPCR utilizzando il metodo Cq comparativo normalizzando i valori di espressione del GOI in base all'espressione di tTA-Ad per ottenere i livelli di espressione relativi del GOI e per segnalare la sua espressione come percentuale dell'espressione mRNA del GOI nelle celle dello stesso animale al punto di partenza (t ) (Figura 4).
- L'emivita è determinata dalla costante di frequenza (K) della curva di degradazione dell'mRNA GOI utilizzando la seguente equazione:
t1/2 - ln 2/K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo protocollo è stato utilizzato con successo per generare un sistema di espressione plasmid etransriptionally controllata Tet-Off per valutare l'importanza di diverse porzioni dell'UTR di ENaC 3' nella modulazione della stabilità della trascrizione nelle cellule epiteliali alveolar primarie.
Il primo passo nell'implementazione di questo sistema è stato quello di stabilire una tecnica di trasfezione rapida, facile ed efficiente per le cellule epiteliali alveolar nella coltura primaria, che sono difficili da trasfecare. Come mostrato nella Figura 1, la tecnica di elettroporazione delle pipette ha consentito un tasso di efficienza della trasfezione del 25-30%, come dimostrato dai rapporti delle cellule eGFP rilevate dalla microscopia a fluorescenza e dalla citometria di flusso.
Prima di applicare questo sistema di induzione, che è controllato dalla tetraciclina e dai suoi derivati, è stato verificato l'impatto di questo farmaco sull'espressione del nostro GOI. Le cellule epiteliali alveolar sono state trattate con doxycyclina 1,0 g/mL per valutarne l'impatto sull'espressione endogena dell'mRNA di zENaC. I trattamenti effettuati in un periodo di 1-24 h non hanno avuto alcun impatto significativo sull'espressione della trascrizione endogena, come illustrato nella Figura 2.
Il nostro sistema di espressione plasmid a controllo transcriptionally utilizza una tecnica di normalizzazione qPCR che differisce dalla tecnica standard che utilizza geni delle pulizie. Nel caso dell'espressione di V5-ENaC, il segnale è stato normalizzato secondo il segnale tTA-Adv per determinare l'efficienza della trasfezione utilizzando il metodo Cq. La figura 3 mostra l'uso della trascrizione tTA-Adv per normalizzare l'espressione mRNA.
I risultati pubblicati in precedenza suggeriscono che l'uso di actinomicina D è inappropriato per la stima della stabilità della trascrizione di zNaC, in quanto ha indicato un'emivita di mRNA anormalmente elevata (circa 12 h)24. L'emivita dell'mRNA di zNaC in presenza del sistema Tet-Off (99 min) era fino a 7 volte più breve di quello trovato in presenza di actinomycin D, come mostrato nella Figura 4. Ciò conferma che l'actinomycin D porta ad una stabilizzazione dell'mRNA artifattuale.
Questo sistema Tet-Off è stato utilizzato anche con successo per verificare se diversi fattori di stress cellulare noti per influenzare l'espressione genica di ENaC potrebbero modulare la stabilità dell'mRNA di zNaC. Come mostrato nella Figura 5, il trattamento con ciclossimide ha ridotto significativamente la stabilità (36 min) della trascrizione, mentre i lipopolioaccaridi (LPS, usati per imitare uno stimolo infettivo) non hanno fatto. Infine, la citochina pro-infiammatoria TNF-z ha causato un drastico calo della stabilità dell'mRNA V5-ENaC (con un'emivita di 16 min).
Nel presente lavoro, la strategia di clonazione aveva lo scopo di chiarire il contributo dell'UTR 3' alla modulazione della trascrizione di . Diversi mutanti di delezione sequenziale sono stati generati e testati per mappare il contributo di diversi domini dell'UTR di zNaC 3 alla stabilità della trascrizione. La figura 6 mostra i cambiamenti significativi nella modulazione della stabilità dell'mRNA V5-ENaC a seconda delle regioni eliminate e incluse dell'UTR 3'.
Infine, con questo modello è stata studiata la modulazione dell'mRNA di eNaC da parte delle proteine che legano l'RNA (RBP). La trascrizione dell'mRNA di zNaC con l'epitopo V5 dal vettore pTRE-Tight è sotto il controllo esclusivo di tTA-Adv. Dhx36, Tial1 e hnRNPK sono tre RBP che sono collegati all'UTR 3' di . Pertanto, qualsiasi modulazione dell'espressione di V5-ENaC dopo la cotrafezione con Dhx36, Tial1, o hnRNPK, sarebbe la conseguenza della modulazione della stabilità del mRNA e non della modulazione della trascrizione. La figura 7 mostra che la sovraespressione di Dhx36 o Tial1, a differenza di quella di hnRNPK, ha diminuito la stabilità dell'mRNA V5-ENaC rispetto alla trasfezione con il plasmide pcDNA3 vuoto, che mostra la modulazione specifica di alcuni RBP.
Collettivamente, questi risultati hanno confermato che il sistema di espressione plasmid tet-Off controllato opzionalmente che abbiamo sviluppato rappresenta uno strumento appropriato per valutare l'emivita effettiva di una trascrizione e i meccanismi coinvolti nella sua modulazione. Questo strumento sarà utile per acquisire nuove intuizioni sulla regolazione posttrancriale dei GOI chiave coinvolti nella funzione dell'epitelio alveolare in condizioni fisiologiche e patologiche.
Figura 1: Efficienza della trasfezione delle cellule epiteliali alveolare nella coltura primaria mediante elettrofuro pipetta. Le cellule epiteliali alveolare primarie sono state trascate transitoriamente con due g di un plasmide di pcDNA3 (vuoto, cloni #1 e #2) che esprimevano o non esprimevano la proteina GFP. L'efficienza della trasfezione è stata valutata 48 h dopo la trasfezione dalla microscopia a fluorescenza (A) o dalla citometria a flusso(B). Test post hoc ANOVA e Bonferroni unidirezionali;
Figura 2: Modulazione dell'mRNA endogeno di endogeno zNaC da doxycycline nelle cellule epiteliali alveolar. Le cellule epiteliali alveolar sono state trattate con doxycycline 1,0 g/mL per un periodo di 1-24 h. L'espressione dell'mRNA di zNaC è stata quantificata dal quantitativo RT-PCR e presentata come l'espressione di mRNA di zNaC - SEM rispetto a quella nelle cellule non trattate (Ctrl; t - 0) dopo la normalizzazione secondo l'espressione di anova (anova a senso unico, n - 4). La doxycyclina non ha modulato l'mRNA endogeno di ENaC nel tempo. Precedentemente pubblicato come Figura S4 in Migneault et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Normalizzazione dell'espressione mRNA GOI con un metodo Cq modificato in base all'espressione dell'mRNA regolatore tTA-Ad. Le cellule epiteliali alveolar sono state transinfettate transitoriamente con il pLasmid e il pLAsmide pTRE-Tight con codifica pTRE-Tight, cDNA, recanti un epiteV 5 a monte del suo frame di lettura aperto e una sequenza UTR completa da 3' . L'espressione degli mRNA V5-ENaC e tTA-Ad è stata misurata da RT-PCR quantitativi in celle non trattate. (A) Sono raffigurati i segnali fluorescenti SYBR verdi normalizzati dal delta (Inz, V5-ENaC e tTA-Ad da due trafetti separati (R1 e R2). (B) Grafico a sinistra: l'espressione mRNA di V5-EENaC e tTA-Ad in ogni esperimento (R1 e R2) sono espressi come valore di quantificazione del ciclo (Cq). Viene presentata la differenza tra V5-ENaC e l'espressione di mRNA di tTA-Ad (Sezione Cq). Grafico a destra: l'utilizzo dell'mRNA tTA-Ad al posto del gene delle pulidi consente l'efficiente normalizzazione dell'espressione del GOI, che ha mostrato un'espressione relativa di 0,98 in R1 rispetto a quella di R2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cinetica di degradazione dell'mRNA V5-ENaC quando si utilizza il sistema di espressione plasmid a controllo transcrile in presenza e assenza di actinomicina D. Le cellule epiteliali alveolare primarie sono state cotransigiate transitoriamente con il plasmide pTet-Off e la codifica pTRE-tight plasmid encoding , con un epiteto V5 a monte del suo frame di lettura aperto e completano sequenze UTR 3'. Le cellule pretrattate o non trattate con actinomicina D (5,0 g/mL) per 30 min sono state incubate successivamente con doxycycline (1,0 g/mL) per 15 min-6 h. L'espressione dell'mRNA V5-ENaC è stata misurata dal quantitativo RT-PCR e presentata come percentuale dell'espressione mRNA V5-zNaC in celle non trattate (t - 0) dopo la normalizzazione secondo l'espressione di tTA-Ad. L'emivita dell'mRNA di V5-eNaC è stata stimata da una regressione non lineare di decadimento di una fase per ogni preparazione cellulare. L'analisi di regressione multipla ha rivelato una differenza statisticamente significativa nella stabilità dell'mRNA V5-ENaC nelle cellule trattate con actinomicina D rispetto a quella nelle cellule non trattate (p < 0.0001). Per ogni condizione sperimentale sono state utilizzate cellule di almeno quattro ratti diversi (n . 4). Precedentemente pubblicato come Figura 1 in Migneault et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Modulazione della stabilità dell'mRNA V5-ENaC da diversi stress cellulari e infiammatori. Le cellule epiteliali alveolare primarie sono state cotransigiate transitoriamente con il plasmide pTet-Off e la codifica pTRE-tight plasmid encoding , con un epiteto V5 a monte del suo frame di lettura aperto e completano sequenze UTR 3'. Le cellule sono state pretrattate per 30 min con 1,0 m cicloxeximide (CHX) (A) o 15 g/mL LPS (B) o per 5 h con 100 ng/mL TNF- s (C), seguite da un trattamento con 1,0 g/mL doxycycline per un periodo di 15-120 min. L'espressione dell'mRNA V5-ENaC è stata misurata dal quantitativo RT-PCR e presentata come percentuale dell'espressione mRNA V5-zNaC in celle non trattate (t - 0) dopo la normalizzazione secondo l'espressione di tTA-Ad. Per ogni condizione sperimentale sono state utilizzate cellule di almeno tre ratti diversi (n . 3). (D) L'emivita (t1/2) dell'mRNA V5-ENaC nelle cellule trattate è stato confrontato con l'emivita dell'mRNA nelle cellule (Ctrl). Le emivite sono state misurate in base alla costante di frequenza (K) della curva di degradazione dell'mRNA V5-ENaC utilizzando l'equazione t1/2 - ln 2/K e poi espresse come min - SEM (test aNOVA di sola andata e Test post hoc di Bonferroni; s < 0,01 vs controllo; n - 3). Adattato dalla Figura 36 precedentemente pubblicato in Migneault, F.25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Uso della strategia di clonazione dell'eliminazione sequenziale per rivelare il ruolo delle diverse regioni dell'UTR di ENaC 3' nella modulazione della stabilità dell'mRNA. (A) Mappa schematica della trascrizione V5-ENaC con l'UTR completo 3' inserito nel vettore di espressione stretto di pTRE. La cornice di lettura aperta è raffigurata come una casella grigia, mentre l'UTR 3' viene visualizzato come una scatola bianca. La porzione UTR di 3' di mRNA di zNaC è raffigurata per il clone recante un completo 3' UTR e per i diversi mutanti di delezione (da Dal 1 a Del 4). (B) Le cellule epiteliali alveolare primarie sono state transinfetate transitoriamente con plasmidi a tenuta di pTRE che codificano diversi mutanti di delezione di zNaC 3' UTR insieme al plasmide pTet-Off, che esprime tTA-Ad, per consentire l'espressione specifica del costrutto e la sua inibizione mediante doxycycline. Settantadue h dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con doxycycline (1,0 g/mL) per 15 min a 6 h. L'espressione dell'mRNA di V5-ENaC è stata misurata dal quantitativo RT-PCR e presentata come percentuale di V5-eNaC mexpressionRNA in celle non trattate (t ) 0) dopo la normalizzazione secondo l'espressione di tT-Ad. L'emivita dell'mRNA V5-eNaC per ogni costrutto è stata stimata dalla costante di frequenza (K) della curva di degradazione dell'mRNA V5-ENaC utilizzando la seguente equazione: t1/2 - ln 2/K. Per il clone con l'UTR (Comp) completo da 3' e per i mutanti di delezione da DelR a 4 3' utR. L'emivita (t1/2) del decadimento dell'mRNA è dato per ogni clone. Nel quadrante inferiore destro, il grafico mostra un confronto tra i diversi valori t1/2 : SEM stimati per ogni clone. p < 0,05 tra i diversi gruppi secondo il test Di Kruskal-Wallis. Secondo il test post hoc di Dunn rispetto all'UTR completo da 3'. Secondo il test post hoc di Dunn rispetto a Del 3, secondo il test post hoc di Dunn. Per ogni condizione sperimentale sono state utilizzate cellule provenienti da almeno cinque animali diversi (n . 5). Adattato dalle figure 2 e 3 precedentemente pubblicate in Migneault et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Modulazione posttranscrittivale dell'mRNA V5-ENaC da parte delle proteine leganti l'RNA hnRNPK, Dhx36 e Tial1. (A) Le cellule epiteliali alveolare primarie sono state cotrafettate con la codifica pTRE-stretto plasmide V5-ENaC mRNA insieme a un vettore di espressione per gli RBP Dhx36, hnRNPK o Tial1 e il pLasmidp. L'espressione dell'mRNA di Rt-qPCR 72 h è stata espressa come percentuale: SEM dell'espressione mRNA V5-ENaC rispetto a quella delle cellule trafitte con un vettore vuoto (pcDNA3) dopo la normalizzazione secondo l'espressione tTA-Ad. La sovraespressione di Dhx36 e Tial1 ha inibito significativamente l'espressione mRNA V5-ENaC, mentre la sovraespressione di hnRNPK non ha avuto alcun effetto. Secondo il test Kruskal-Wallis e il test post hoc di Dunn rispetto al vettore vuoto, 0,05 ; n 3 campioni di animali diversi sono stati testati in duplicato per ogni condizione sperimentale. (B) La parte prossimale dell'UTR di zNaC 3' è stata cancellata clonando la regione distale del 3' UTR accanto al codon di sbarramento del pTRE (V5-ENaC-Del5). (C) Le cellule epiteliali alveolar primarie sono state cotransigiate con la sovraespressione V5-ENaC o V5-ENaC-Del5, insieme al pLAsmide pTet-Off e al vettore di espressione per la sovraespressione di Dhx36 o Tial1 RBP. L'espressione dell'mRNA di Rt-qPCR 72 h è stata espressa come percentuale: SEM dell'espressione mRNA v5-ENaC rispetto a quella delle cellule trafitte con un vettore vuoto (pcDNA3) dopo la normalizzazione secondo l'espressione di tTA-Ad. La sovraespressione di Dhx36 e Tial1 non ha avuto alcun effetto sull'espressione mRNA V5-ENaC-Del5. Secondo il test Kruskal-Wallis e i test post hoc di Dunn al confronto dei vettori sperimentali con il vettore vuoto; #p < 0,05 secondo il Mann-Whitney U-test al confronto dei vettori sperimentali con il mutante UTR completo da 3'; n 6 per ogni condizione sperimentale. Adattato dalle figure 5 e 7 precedentemente pubblicate in Migneault et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Un | |||
| Modello | UTR da 3' | Senso | Sequenza |
| CDNA di ENaC | Completo | F | 5'-ATCGCAGCTAGTAGTAGGGG GTAAGCCTATCCCTAACCCT CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTTATGATAC CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| Del 1 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTTCT GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| Del 2 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTAACTAA CAAGGGGGCTTTGGGGGG-3' |
|
| Del 3 | R | 5'-GCACTAATCGATTTGTCC CTGAAGGCAGTGAGC-3' |
|
| Del 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTTCAGA CGCCGCGCGCAGCACAG-3' |
|
| Del 5 | R | 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| F | 5'-ATCGCAGAATTCTCTCTCTCTCTCTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| bersaglio | Senso | Sequenza | |
| V5-ENaC | F | 5'-CCTAACCCTCTCTCCTCGGTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTTGCCC-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGAGAGAGACAAGGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGGGTATGATGATCTCCCC-3' | ||
Tabella 1: Primer utilizzati in questo studio. (A) Primer utilizzati per la clonazione e la generazione dei mutanti V5-ENaC nel vettore inducibile a pTRE. (B) Primer utilizzati per la misurazione dell'espressione mRNA mediante il quantitativo RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il basso tasso di trasfezione delle cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria è stata una grave limitazione per l'uso del sistema Tet-Off per valutare la stabilità dell'mRNA in queste cellule. Tuttavia, questa limitazione è stata superata dall'elettroporazione delle pipette, consentendo un'efficienza di trasfezione del 25-30%(Figura 1 e Figura 3)26.
La misurazione della stabilità della trascrizione è fondamentale per comprendere la modulazione di un dato mRNA e il suo impatto sull'omeostasi cellulare e sul metabolismo. La variazione nella biodisponibilità di un GOI può modificare l'efficienza della traduzione e avere un impatto diretto sull'espressione del GOI nella cellula. Per questi motivi, sono state sviluppate diverse tecniche per determinare l'emivita degli mRNA. Come discusso in precedenza, ognuna di queste tecniche ha limitazioni e vincoli che impediscono il corretto studio di una trascrizione di interesse. Rispetto ad altre tecniche, il modello TET-off qui sviluppato ha il vantaggio di consentire la stima dell'emivita di un dato mRNA in qualsiasi condizione sperimentale. Tuttavia, non ci permette di studiare direttamente la stabilità di una trascrizione endogena. Per superare questa limitazione il più possibile, si consiglia di includere le sequenze UTR 5' e 3' della trascrizione nel plasmide in modo che il costrutto sia il più simile possibile alle trascrizioni endogene. L'aggiunta dell'epitopo V5 consente l'amplificazione specifica dell'mRNA bersaglio da parte di RT-qPCR rispetto a quella della trascrizione endogena. Per quanto riguarda la strategia di clonazione, la scelta della sequenza inserita a monte del gene di interesse è fondamentale per prevenire l'amplificazione di segnali non specifici. L'aggiunta della sequenza dell'epitopo V5 5' dell'ORF è necessaria per l'amplificazione qPCR specifica del costrutto a causa della sua breve lunghezza e della mancanza della sua espressione nelle cellule epiteliali alveolare. Questa strategia offre anche l'opportunità di studiare la modulazione della traduzione delle proteine utilizzando lo stesso sistema inducibile. Nonostante le piccole dimensioni dell'epitopo V5 (42 nt), è ancora possibile che ciò possa influenzare la stabilità della trascrizione. Per questo motivo, si consiglia di testare anche altri epitopi, come l'emagglutinina dell'influenza umana (HA) o qualsiasi altra sequenza non trovata nel trascrittoma delle cellule epiteliali alveolar.
Una limitazione del sistema è l'uso di doxycycline per inibire la trascrizione di un GOI. Diversi rapporti mostrano che la doxycyclina potrebbe avere un impatto significativo sul metabolismo cellulare. L'uso di questo antibiotico nelle cellule bronchiali 16HBE14 riduce la proliferazione e aumenta la mortalità a causa dell'apoptosi27. Inoltre, la doxycyclina ha già dimostrato di essere coinvolta nella modulazione della risposta infiammatoria LPS28. Pertanto, questo antibiotico potrebbe avere effetti fuori bersaglio che possono influenzare la stabilità dell'mRNA di un dato GOI. Per questi motivi, abbiamo valutato l'impatto di 1 doxycyclina g/mL su un periodo di 24 ore su cellule non transinfettate e abbiamo scoperto che non ha indotto alcun cambiamento nell'espressione endogena dell'mRNA di ENaC (Figura 2). Questa concentrazione è stata scelta perché è ampiamente utilizzata per inibire completamente la trascrizione del sistema Tet-Off e si raccomanda di ridurre al minimo gli effetti citotossici29. Suggeriamo di utilizzare questa concentrazione nelle cellule epiteliali alveolare e consigliamo di convalidare la concentrazione ottimale per lo studio di altri geni o l'uso di altri tipi di cellule con il sistema Tet-Off.
Il nostro sistema utilizza l'espressione coniugale del GOI fino a quando la sua trascrizione è inibita dalla doxycycline. È stato suggerito che concentrazioni eccessive di mRNA possono essere tossiche per la cellula e influenzare il suo metabolismo. Questo potrebbe portare a un cambiamento nella stabilità della trascrizione GOI, causandola rapida degradazione a causa della sovraespressione non fisiologica30. Nel caso del nostro modello Tet-Off, tale tossicità non è stata osservata, perché le cellule trasfette hanno mostrato una morfologia simile a quella delle cellule sane non trasfette (dati non mostrati). In conformità con Tani et al.31, che ha dimostrato la validità del sistema Tet-Off nel determinare l'emivita di un mRNA, i nostri risultati hanno mostrato che il sistema Tet-Off non è tossico nelle cellule alveolare e produce un'emivita per l'mRNA di zENaC che non riflette l'eccessiva stabilizzazione che è stata segnalata in presenza di inibitori trascrizionali come lafiguraactinomycin .
Lo sviluppo di questo sistema per misurare l'emivita dell'mRNA sfida i risultati osservati quando la stabilità delle trascrizioni è stata misurata in presenza di inibitori della trascrizione come l'actinomicina D. Questo metodo mostra che un'emivita di trascrizione può essere molto più breve di quanto misurato in precedenza.
Il nostro modello è altamente appropriato per studiare la modulazione posttrandiale di una trascrizione specifica in diverse condizioni, tra cui condizioni pro-infiammatorie o sovraespressione RBP, così come dopo il trattamento con RNA silenziamento. Inoltre, permette la caratterizzazione di regioni non tradotte essenziali per la modulazione posttranscriptionale degli mRNA in condizioni patologiche che colpiscono le cellule epiteliali alveolare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Francis Migneault è stato sostenuto da una borsa di studio fornita dal Quebec Respiratory Health Network e dal programma di formazione polmonare del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), da uno studente del FRSQ e da una borsa di studio della Faculté des'tudes Supérieures et Post-dottorato, Université de Montréal. Questo lavoro è stato sostenuto dalla cattedra Gosselin-Lamarre nella ricerca clinica e dai Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
