Summary
ここでは、ピペットエレクトロポレーション技術に結合した誘導発現系を用いて、一次肺胞上皮細胞における転写物の転写後変調を研究するために使用できるツールを提示する。
Abstract
転写後の調節を研究することは、与えられたメッセンジャーRNA(mRNA)の変調と細胞恒常性および代謝への影響を理解するための基本である。実際、トランスクリプト発現の変動は、翻訳効率と最終的にはトランスクリプトの細胞活動を変える可能性があります。mRNAの半減期を調べるいくつかの実験的アプローチが開発されているが、これらの方法のいくつかは、転写後変調の適切な研究を妨げる限界がある。プロモーター誘導系は、テトラサイクリン調節促進剤の制御下で目的の遺伝子を発現することができる。この方法は、細胞恒常性を乱すことなく、任意の実験条件下での与えられたmRNAの半減期推定を可能にする。この方法の大きな欠点の1つは、従来のトランスフェクション技術に対して非常に耐性のある単離プライマリ細胞でのこの技術の使用を制限するトランスフェクト細胞の必要性である。初等培養における肺胞上皮細胞は、肺胞上皮の細胞および分子生物学を研究するために広く使用されてきた。原発性肺胞細胞のユニークな特徴と表現型は、これらの細胞に関心のある遺伝子の転写後の調節を研究することを不可欠にします。そこで、我々の目的は、一次培養における肺胞上皮細胞に関心のあるmRNAの転写後変調を調査するための新しいツールを開発することであった。我々は、転写制御されたプラスミド発現系を原発性肺胞上皮細胞に挿入するための迅速かつ効率的な一時的なトランスフェクションプロトコルを設計した。このクローニング戦略は、ウイルスエピトープを使用して構築物にタグを付け、内因性mRNAの構造発現から容易に識別することを可能にする。改変ΔΔ定量サイクル(Cq)法を用いて、転写物の発現を異なる時間間隔で定量して半減期を測定することができる。我々のデータは、原発性肺胞上皮細胞における様々な病態生理学的状態における転写後調節を研究する上で、この新しいアプローチの効率を示している。
Introduction
mRNAの半減期を決定するためにいくつかの技術が開発された。標識された mRNA を利用するパルス追跡減衰技術は、最小限の細胞妨害で mRNA の大きいプールの同時評価を可能にする。しかし、このアプローチは、単一の遺伝子転写物の半減期の直接的な推定を可能にせず、成長因子、ROS、アリン、または炎症1を伴う刺激後のmRNAの転写後変調を研究するために実施することができない。
アクチノマイシンDやα-アマニチンなどの転写阻害剤の使用は、mRNA分解動態を時間の経過とともに測定するための比較的簡単な方法です。以前の技術(パルスチェイス)に対するこのアプローチの主な利点の1つは、所定のトランスクリプトの半減期を直接推定し、異なる治療法がその劣化キネティクスにどのような影響を与えるかを比較する能力に依存しています。しかしながら、転写阻害剤が細胞生理学に及ぼす重大な有害な影響は、アプローチ2の大きな欠点を表す。実際、これらの薬剤による全細胞転写物の阻害は、マイクロRNA(miRNA)などのmRNA安定性に関与する主要元素の合成を摂氏化する悪影響を及ぼし、また、mRNA分解および安定性にとって重要なRNA結合タンパク質の発現および合成を妨げる悪影響を及ぼす。したがって、これらの薬物による遺伝子転写の重度の摂動は、実際にトランスクリプトの分解曲線を変更する可能性がある。
プロモーター誘導系は、特定のmRNAの半減期を測定する第3のアプローチを表す。この方法は、転写阻害剤を使用する方法と同様の方法で特定のmRNAの分解を測定する。2種類の誘導系が頻繁に使用される:血清誘発c-fosプロモーター3およびTet-Off誘導システム4.c-fosシステムでは、細胞に有毒であり得る転写阻害剤の使用は必要ない。しかし、この方法では細胞周期同期が必要であり、これは、フェーズ間5の間に転写物の実際の安定性の評価を防ぐ。対照的に、Tet-Offシステムは、目的の遺伝子(GOI)の強力な発現を、テトラサイクリン調節促進剤の制御下で可能にする。このシステムは、機能するために細胞にコトランスフェクションする必要がある2つの要素の存在を必要とします。第1のプラスミド(pTet-Off)は、ウイルスタンパク質HSV VP16から3つの転写トランス活性化ドメインに融合した原核代圧抑制剤TetR(大腸菌由来)で構成されるハイブリッド合成転写因子である調節タンパク質tTA-Advを発現する。GOIは、合成プロモーター(PTight)の制御下でpTRE-Tightプラスミドにクローン化され、テトオオペレータ配列の7回の繰り返しに融合したサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの最小配列を含む。PTightの下流の遺伝子の転写は、テトオとテトアの相互作用に依存する。テトラサイクリンまたはその誘導体の存在下で、ドキシサイクリンは、TetRリプレッサーがテトオオペレータに対する親和性を失い、転写4の停止を招く。Tet-Offシステムの特性は、真核細胞6における原核生物調節配列の欠如に対する二次的な多球的効果を回避しながら、真核細胞における特異的mRNA発現の研究に理想的なモデルとなる。通常、二重に安定なテトオフ細胞株(HEK 293、HeLa、およびPC12)は、制御可能な遺伝子発現7、8、9に簡単にアクセスするためのレギュレータおよび応答プラスミドのコピーを統合するためにこのシステムと共に使用される。
培養中の肺胞上皮細胞のいくつかのモデルは、肺胞上皮の細胞および分子生物学を研究するために使用されてきた。何年もの間、研究者は、ヒトまたはげっ歯類の一次細胞10、11だけでなく、ヒトA549またはラットRLE-6TN細胞12、13のような不死化細胞株を広範囲に利用してきた。それらは一般的に増殖が少なく、培養が困難であるが、一次培養における肺胞上皮細胞は、生理学的および病理学的状態における肺胞上皮の機能および機能不全の研究のためのゴールドスタンダードのままである。実際、A549細胞のような不死化細胞株は、初代細胞の複雑な特性および表現型を示さないが、一次培養における肺胞上皮細胞は肺胞上皮の主な特性を再現する一方、特に偏極性および狭いバリア14、15を形成する能力である。残念ながら、これらの細胞は、リポソームを利用するような従来のトランスフェクション技術に対して非常に耐性があり、Tet-Offなどのプロモーター誘導システムの使用は非常に困難です。
mRNAの転写後変調は、転写産物16の遺伝子発現を迅速に調節する最も有効な方法の1つである。mRNA 3'非翻訳領域(3'UTR)は、このメカニズムにおいて重要な役割を果たしている。5'UTRとは異なり、3'UTRの長さと生物の細胞および形態学的複雑性との間には指数関数的な相関関係があることが示されている。この相関は、3'UTRが、mRNA符号化領域と同様に、進化17を通してますます複雑な転写後変調を可能にする自然選択を受けていることを示唆している。3' UTRには、転写物の安定性と翻訳に影響を与えるタンパク質およびmiRNAに対する結合部位がいくつか含まれています。
本研究では、3'UTRのGOIにおける高度に保存されたドメインの役割を調べて、転写安定性を制御するツールを開発しました。我々は、肺胞上皮生理学18において重要な役割を果たす上皮ナトリウムチャネル、αサブユニット(αENaC)に焦点を当てた。一次培養中の肺胞上皮細胞は、Tet-Offシステムの2つの成分に一時的にトランスフェクトされ、他のプロトコルを有する転写阻害剤の使用と比較して細胞生理および代謝に最小限の影響を与えるシステムを用いてmRNA安定性における3'UTRの役割の研究を可能にした。非内因性エピトープ(V5)を用いて、内因性遺伝子の発現とGOIの発現を区別するクローニング戦略が開発された。応答および調節プラスミドは、ピペットエレクトロポレーション技術を用いて肺胞上皮細胞に移された。続いて、異なる時間間隔でドキシサイクリンを細胞にインキュベートすることにより、転写物の発現を測定した。転写物の半減期を、トランスフェクトされたtTA-Ad mRNA産物を正規化に用いて改変Cq法でRT-qPCRにより評価した。我々のプロトコルを通じて、我々は異なる条件下で転写後の変調を研究し、より詳細に未翻訳領域の関与を定義するための便利な方法を提供する。
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Protocol
すべての動物の手順は、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って行われ、モントリオール大学センター(CRCHUM)の研究センターの施設動物ケア委員会によって承認されました。
1. 目的遺伝子を発現する反応プラスミドの設計と生成(GOI)
- pTRE-Tightなどの誘導可能なテトラサイクリンオフベクターを使用します。
- ベクトルの GOI とマルチクローニングサイト (MCS) の順序を分析して、GOI 内に内部的に存在しない MCS 内の制限サイトを特定します。
- 先に説明したように、雄のスプレイグ・ドーレーラット肺から原発性肺胞上皮細胞を単離する。
- フェノール/クロロホルム抽出やシリカベースのRNAスピンカラムの使用などの標準的な方法を使用して、RNA抽出によって肺胞上皮細胞から全RNAを精製します。
- オリゴ(dT)と高忠実度の逆転写酵素を使用して、mRNAを相補DNA(cDNA)に逆転写します。
- 高忠実度のTaqポリメラーゼと標準オーバーラップPCR技術を使用して、設計されたプライマーを使用して2つの選択された制限酵素認識部位でGOIを横取りします。
- 前進プライマーは、mRNA安定性と並行してタンパク質発現を研究する発現レベルを改善するために、コザックコンセンサスリボソーム結合部位21を含有させる。トランスフェクトされたGOIの発現を内因性発現と区別するために、GOIの上流のV5エピトープをコードする配列を含めなければならない(表1)。
- 逆プライマーに、停止コドンの後にポリアデニル化シグナルを含まなければなりません。
- 変異体は、GOI 3'UTRの3'末端を徐々に削除するポリアデニル化部位をコードする逆プライマーを用いて、異なる3'UTR領域がGOIのmRNAの安定性に及ぼす影響を研究するために、順次欠失によって生成することができる(図6)。あるいは、PCR指向変異誘発を用いて、3' UTR22の特定の対象領域を標的にすることができる。
- 誘導性ベクターとインサートを適切なインキュベーション温度で1時間の適切なインキュベーション温度で消化し、その後、自己結紮を避けるために30分間のベクター反応中にホスファターゼで処理します。
- 1-1.5%アガロースゲル(インサートの大きさに応じて濃度)で電気泳動により、消化されたベクターと挿入セグメントを分離します。
- ブレードとUV光を用いて、連結する所望のインサートおよびベクターを含むDNA断片を収集する。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。 - シリカベースのPCR精製キットを用いてアガロースゲルから採取したセグメントを精製し、260nmの分光光度法で濃度を測定します。
- GOIとT4 DNAリガーゼを用いた誘導性ベクターをベクター:インサートモル比1:3を使用してリゲートし、ライゲーションの確率を高めます。反応を室温(RT)で3時間インキュベートする。
- ライゲーション反応を有能な大腸菌(DH5α)に変換します。
- 100 μLの有能な細胞を含むチューブに、1~10 ngのベクターと遺伝子を加えます。細胞を氷上で30分間インキュベートし、42°Cで45秒熱ショックセルを熱ショックし、チューブを氷の上に2分間置き、900 μLのRT LB培地を加えます。225rpmで振盪して37°Cで1時間培養します。
- LB寒天プレートに100μLの反応を適切な抗生物質(例えば、pTRE-Tightベクター用の100μg/mLアンピシリン)で広げ、形質転換した細菌を選択します。プレートを一晩37°Cでインキュベートする。
- 接種ループまたは20μLチップを使用して個々のコロニーを選択し、振盪で37°Cで適切な抗生物質を含む5mL LB培地で一晩インキュベートする。形質転換菌は、-80°Cのグリセロールに対するLB培地の400:600の割合でグリセロールストックに貯蔵することができる。
- シリカ系プラスミドカラムを用いてプラスミドDNAを抽出し、260nmの分光光度法により濃度を測定する。制限分析によるGOIの挿入とその向き、およびシーケンシングによるRT-PCR中に潜在的に導入される突然変異の欠如を確認します。
2. 目的遺伝子(GOI)を原発性肺胞上皮細胞に発現する反応プラスミドのトランスフェクション
- ラット肺からII型肺胞上皮細胞を単離する。
- 完全な最小必須培地(完全なMEM)を備えた100 mmペトリ皿の1 x 106細胞/cm2の密度で細胞をシードします。完全なMEMは10%FBS、0.08 mg/Lトブラマイシン、セプトラ(3 μg/mLトリメトプリムおよび17 μg/mLスルファメトキサゾール)、0.2%NaHCO 3、0.01 M HEPES(pH = 7.3)、および2 mM L-グルタミンを補充するMEMである。加湿インキュベーターで5%CO2で37°Cで24時間培養した。
- 翌日、新しい12ウェルプレートの各ウェルに抗生物質を含まない完全なMEMの500 μLを置き、37°Cでプレートを30分間前温めます。このステップの間に、汚染テトラサイクリンの無い胎児ウシ血清を使用するか、または不用さを妨げるために低すぎるレベルで使用することが重要です。
- 誘導性GOI(GOIプラスミド)と制御ベクトル(例えばpTet-Off)を用いてプラスミドを含む1.5mLチューブを、RTで1μgのGOIプラスミドと1μgの調節ベクトルを添加して調製します。RNA結合タンパク質(RBP)を用いた共発現実験では、1μgの構成ベクター(例えば、pcDNA3)を発現するRPBをDNAミックスに添加する(図7)。
- 培地を吸引し、37°Cで予熱したPBS(カルシウムおよびマグネシウムを含まない)で細胞を穏やかにすすいだ。
- 37°Cでプリウォームした0.05%トリプシンの5 mLを加え、細胞が剥離するまで細胞をインキュベートします(2〜4分)。抗生物質なしで完全なMEMの10 mLを加えることによってトリプシンを中和する。
- 50 mLチューブに細胞懸濁液を回収し、ペトリ皿を4 mLの培地で洗浄してできるだけ多くの残りの細胞を採取し、300 x gで細胞懸濁液を遠心分離して5分間送ります。
- 優しく吸引し、上清を捨て、PBSの1mLでペレットを再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用してセル数をカウントし、計算します。
- 300 x gの細胞を 5 分間遠心分離し、上清を軽く吸引し、再懸濁液バッファー内のペレットを 4 x 107 細胞/mL の濃度で再懸濁します。ステップ2.4で作製した1.5mLチューブから、ウェルあたり40万個の細胞の濃度で細胞を加え、上下にピペットを入れて穏やかに混合します。
- チューブをエレクトロポレーション装置に入れ、3.5 mLの電解バッファーで満たします。
- ピストンを完全に押し込んで、金めっきの電極チップをピペットに挿入します。1.5 mLチューブの内容物を軽く混ぜ、ピペットで細胞を慎重に吸引します。これは、エレクトロポレーション中に電気アークを引き起こし、トランスフェクション効率の低下につながるので、気泡が先端に入るのを防ぐために注意してください。
- クリック音が出るまで、エレクトロポレーションステーションにピペットを挿入します。
- 肺胞上皮細胞の適切なエレクトロポレーションプロトコルを選択し、幅20msのパルス電圧1,450Vと2パルスに対応し、タッチスクリーン上でStartを押します。
- トランスフェクションの直後にピペットを取り除き、37°Cに予熱した抗生物質を使わずに完全なMEMで満たされたウェルに細胞を移します。
- 残りのサンプルについて、手順 2.11 ~ 2.14 を繰り返します。
- プレートを軽く振って、ウェルサーフェス上に均等に細胞を広げます。加湿インキュベーターで5%CO2で37°Cの細胞をインキュベートします。2日後、培地を完全なMEMと抗生物質で交換してください。
- eGFPの発現を蛍光顕微鏡で観察するか、または制御ベクターを用いたフローサイトメトリーによりトランスフェクションの成功を確認する(図1)。
注: このステップはオプションで、pcDNA3-EGFP のような eGFP を発現する別のプラスミドを使用して追加のトランスフェクションステップを必要とします。
3. GOIの転写抑制の誘導
注:細胞は、mRNAの安定性への影響を評価するために、ドキシサイクリン誘導前に所望の処置で前処理することができる(図5)。
- 脱イオン水に1mg/mLのドキシサイクリンストック溶液を調製します。ストック溶液は、光から保護された-20°Cで保管してください。テトラサイクリン誘導体であるドキシサイクリンは、テトラサイクリンよりも長い半減期(2x)を有するため、テトラサイクリンの代わりに使用される。さらに、テトオペロン23の完全な不活性化には、より低濃度のドキシサイクリンが必要である。
注: ドキシサイクリンは内因性 GOI の mRNA 発現に影響を与える可能性があります。これを確かめるために、肺胞細胞に対するドキシサイクリンによる24時間処理の効果を試験して、GOI発現に変化がないことを確認する必要がある(図2)。 - トランスフェクション後のMEM 72時間で新鮮な1μg/mLドキシサイクリン溶液を調製し、37°Cに温めます。
- 1 μg/mL ドキシサイクリンを含む完全なMEMの培地を1 mLに交換して、GOIの転写を阻害します。
- GOIのmRNA半減期を評価するために、5%CO2の37°Cで複数のウェルを15分から6時間の異なる時間にインキュベートし、mRNAの半減期を評価します。
- 処理の最後に、細胞を氷冷PBSで洗浄し、市販のフェノールクロロホルムRNA抽出キットで、ウェルあたり500μLのバッファーを追加し、プレートを振って細胞を均質化します。
- メーカーのプロトコルに従ってRNAを分離します。230、260、および280 nmの分光光度法によりRNAの収率と純度を測定します。260:230および260:280の比率がそれぞれ1.8および2.0のRNAサンプルは純粋であると考えられる。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
4. GOIのmRNA安定性の決定
- RNAAseフリーDNAAse I(増幅グレード)で1μgのRNAを処理し、その後のDNA増幅を妨げる可能性のあるプラスミドDNAの痕跡を除去します。
- 0.2 mL PCRチューブで、1μgの総RNA、10倍のDNase I反応バッファーの1 μL、1 μLのDNAse I(1 U/μL)、およびRNAseフリー水を組み合わせて、合計体積10μLを得ます。
- RTで20分間インキュベートします。
- 15 mM EDTAの1 μLを10 μLの反応ミックスに加え、70°Cで10分間インキュベートして、DNAse Iを非活性化します。
- オリゴ(dT)とランダム六方体プライマーをブレンドした市販のcDNA合成キットを使用して、DNAを枯渇させた全RNAをcDNAに逆転写し、逆転写効率を向上させます。
- 簡単に言えば、DNAを使い果たした全RNAミックスの11μLに、4μLの5倍反応ミックス、1μLの逆転写酵素、および4μLのRNAを含まない水を加えて、20μLの総反応量を得る。
- 25°Cで5分間反応をインキュベートし、続いて46°Cで20分間インキュベートし、95°Cで1分間インキュベートして反応を不活性化する。各反応は、cDNA生成物の50 ng/μLを生成します。
- 20 μLの反応ミックスに180 μLの分子生物学グレードの水を加えて、cDNA反応を5 ng/μLの濃度に希釈します。cDNA製品を-80°Cに保存するか、リアルタイム定量PCR(qPCR)をすぐに実行します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
- GOIに固有の前方および逆のqPCRプライマーを設計します。
- 細胞中のGOIの内因性発現のために、プライマーは、GOIに結合されたV5エピトープの100-150 bpアンプリコンを増幅するように設計されなければならない(表1)。
- 内部参照遺伝子プライマーも正規化制御として使用する必要があります。通常、β-アクチンや低酸素リン酸化酵素リン酸化転移酵素1遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が、参照遺伝子として使用される。しかし、トランスフェクション効率のばらつきにより、この誘導系では使用できません。代わりに、tTA-Ad転写物の発現は、サイトメガロウイルスプロモーターの活性に起因する細胞内での発現が構成されるため、正規化を目的として評価される。qPCRで測定された発現の変動は、トランスフェクション効率の代表となる(プライマー:フォワード5'-GCC TGA CGA GGA AAC TC-3'および逆5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3;129 bpアンプリコン)、トランスフェクションクローンの発現の正常化を可能にする(図3)。
- SYBRグリーン染料マスターミックスを使用して、各qPCR反応を三重に調製します。
- 分子生物学等の水を用いて、5 ng/μL cDNAミックスを1.25 ng/μLの濃度に希釈します。
- SYBRグリーン色素マスターミックス(2x)の5μL、分子生物学グレードの水の0.1μL、7.5 μMフォワードプライマーの0.45 μL、7.5 μMリバースプライマーの0.45 μL、1.25 ng/μL cDNAの4 μLを組み合わせて、10 μLの総反応量を得る。光学粘着フィルムを使用して、プレートカバーが密閉され、汚染や蒸発を防ぎます。
- 遠心分離によって反応ミックスを短時間スピンダウンし、プレートをqPCRサーモサイクラーに入れます。
- 次のqPCR条件を使用してV5タグ付きGOIとtTA-Adアンプリコンを増幅:変性ステップとして10分間95°C、10sの場合は95°Cの40サイクル、15 sの場合は58°C、20sの場合は72°C。増幅サイクルが実行された後に高分解能の融解曲線を生成して、目的のアンプリコンの特定の溶融温度を評価し、ノイズアンプリコンのピークがないことを確認する必要があります。
- 逆転写酵素のないテンプレートとしてRNAを用いてqPCRを実行し、cDNAをqPCRミックスに加えない場合の制御として機能し、プライマーダイマーの不足を確実にするためにqRT-PCRの陰性制御を含める汚染 物質。
- 最適なcDNA濃度、プライマー効率、および濃度は、標準曲線アッセイによりGOIに従って最適化する必要があります。これを行うには、未処理の細胞からcDNAを用いて連続希釈を行う(ドキシサイクリンを含まない培養)。Cq 値を cDNA 希釈係数の対数に対してプロットすることにより標準曲線が生成され、次の式を使用して標準曲線の傾きに従って増幅効率 (E) が計算されます。
E = 10-1/スロープ
注: 増幅効率は約 0.9 ~ 1.05 です。それ以外の場合は、プライマーを再設計する必要があります。
- 比較Cq法を用いて、GOIの発現値をtTA-Adの発現に正規化してGOIの相対発現レベルを取得し、その発現を開始点(t=0)の同じ動物由来の細胞中のGOIのmRNA発現の割合として報告することにより、qPCRデータを分析する(図4)。
- 半減期は、以下の式を用いて、GOI mRNA分解曲線の速度定数(K)から決定されます。
t1/2 = ln 2/K.
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Representative Results
このプロトコルは、テトオフ転写制御プラスミド発現系を生成し、一次肺胞上皮細胞における転写安定性の変調におけるαENaC 3'UTRの異なる部分の重要性を評価するために成功した。
このシステムの導入の第一歩は、一次培養において肺胞上皮細胞に対する迅速かつ容易で効率的なトランスフェクション技術を確立することであった。図1に示すように、ピペットエレクトロポレーション技術は、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって検出されたeGFP細胞の比率によって示されるように、25〜30%のトランスフェクション効率率を可能にした。
テトラサイクリンとその誘導体によって制御されるこの誘導系を適用する前に、この薬剤がGOIの発現に及ぼす影響が確認されました。肺胞上皮細胞を1.0 μg/mLドキシサイクリンで処理し、内因性αENaC mRNA発現への影響を評価した。1〜24時間にわたって行われた治療は、図2に示すように、内因性転写物の発現に有意な影響を及ぼさなかった。
転写制御プラスミド発現系は、ハウスキーピング遺伝子を用いた標準的な技術とは異なるqPCR正規化技術を用いた。V5-αENaCの発現の場合、シグナルをtTA-Adv信号に従って正規化し、Cq法を用いてトランスフェクションの効率を決定した。図3は、mRNA発現を正常化するためのtTA-Adv転写物の使用を示す。
以前に公表された結果は、アクチノマイシンDの使用がαENaC転写安定性の推定には不適切であることを示唆し、異常に高いmRNA半減期(約12時間)24を示した。Tet-Offシステムの存在下でのαENaC mRNAの半減期(99分)は、図4に示すように、アクチノマイシンDの存在下に見られるものよりも最大7倍短かった。これは、放線菌体Dが、実際のαENaC mRNA安定化をもたらすことを確認する。
このTet-Offシステムは、αENaC遺伝子発現に影響を与える異なる細胞ストレッサーがαENaC mRNA安定性を調節できるかどうかをテストするためにもうまく使用されました。図5に示すように、シクロヘキシミド処理は転写物の安定性(36分)を有意に低下させ、一方、リポ多糖類(LPS、感染性刺激を模倣するために使用)は認めなかった。最後に、炎症性サイトカインTNF-αは、V5-αENaC mRNA安定性の急激な低下を引き起こした(半減期は16分)。
本研究では、クローニング戦略は、αENaC転写物の変調に対する3'UTRの寄与を解明することを目的としていた。いくつかの逐次欠失変異体を生成し、転写安定性に対するαENaC 3'UTRの異なるドメインの寄与をマッピングするために試験した。図6は、3'UTRの削除および含まれる領域に応じてV5-αENaC mRNAの安定性の大きな変化を示す。
最後に、RNA結合タンパク質(RBP)によるαENaC mRNAの安定性の変調をこのモデルで検討した。pTRE-タイトベクターからのV5エピトープを用いたαENaC mRNAの転写は、tTA-Adv. Dhx36, Tial1, および hnRNPKの排他的制御下にあるαENaC24の3'UTRにリンクされている3つのRPSである。したがって、Dhx36、Tial1、またはhnRNPKを用いたコトランスフェクション後のV5-αENaCの発現の任意の変調は、転写変調ではなくmRNA安定性の変調の結果であろう。図7は、Dhx36またはTial1の過剰発現が、hnRNPKとは異なり、空のpcDNA3プラスミドによるトランスフェクションと比較してV5-αENaC mRNAの安定性を低下させたことを示し、これはいくつかのRMPの特異的変調を示す。
これらの結果から、我々が開発したTet-Off転写制御プラスミド発現システムは、転写物の実際の半減期とその変調に関与するメカニズムを評価するための適切なツールを表すことを確認した。このツールは、生理学的および病理学的状態における肺胞上皮の機能に関与する主要なGOIの転写後調節に関する新たな洞察を得る上で有用である。
図1:ピペットエレクトロポレーションによる一次培養における肺胞上皮細胞のトランスフェクションの効率。原発性肺胞上皮細胞は、GFPタンパク質を発現または発現しなかったpcDNA3プラスミド(空、クローン#1および#2)の2μgで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション効率は、(A)蛍光顕微鏡検査または(B)フローサイトメトリーによるトランスフェクション後48時間評価した。一方向のANOVAとボンフェローニポストホックテスト;*p < 0.001 対空。少なくとも4つの異なるラット(n≥4)からの細胞を各実験条件に使用した。スケールバー= 200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:肺胞上皮細胞におけるドキシサイクリンによる内因性αENaC mRNAの変調肺胞上皮細胞を1.0 μg/mLドキシサイクリンで1〜24時間処理した。αENaC mRNAの発現を定量的なRT-PCRで定量し、βアクチン発現(片道ANOVA、n=4)に従って正常化した後の未処理細胞(Ctrl;t=0)と比較してαENaC mRNA±SEMの発現として提示した。ドキシサイクリンは、経時内因性αENaC mRNAを調節しなかった。以前は、ミニョーら24で図S4として公開されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:調節性mRNA tTA-Adの発現に従った修飾Cq法によるGOI mRNA発現の正規化。歯槽上皮細胞は、pTet-OffプラスミドとpTRE-Tightプラスミドと一時的にコトランスフェクトされ、開いた読み取りフレームのV5エピトープを上流に持つαENaC cDNAをコードし、完全な3'UTR配列を有する。V5-αENaCおよびtTA-Ad mRNAの発現を、未処理細胞における定量的RT-PCRにより測定した。(A)2つの別々のトランスフェクション(R1およびR2)からのV5-αENaCおよびtTA-Adのデルタ正規化されたSYBR緑色蛍光シグナル(ΔRn)が描かれている。(B)左グラフ:各実験におけるV5-αENaCおよびtTA-AdのmRNA発現(R1およびR2)はサイクル定量値(Cq)として表される。V5-αENaCとtTA-アドmRNA発現(ΔCq)の差を示す。右グラフ: ハウスキーピング遺伝子の代わりにtTA-Ad mRNAを使用すると、GoIの発現の効率的な正規化が可能となり、R2と比較してR1で0.98の相対的な発現を示しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:放写マイシンDの存在下および不在下で転写制御プラスミド発現系を用いた場合のV5-αENaC mRNAの分解動態。原発性肺胞上皮細胞は、pTet-OffプラスミドとpTREタイトプラスミドと一時的にコトランスフェクトされ、開いた読み取りフレームのV5エピトープを持つαENaC cDNAをコードし、3'UTR配列を完全に含んでいた。アクチノマイシンD(5.0 μg/mL)で30分間前処理または未処理の細胞を、その後ドキシサイクリン(1.0 μg/mL)を15分間、15分間インキュベートした。 V5-αENaC mRNAの発現を定量的RT-PCRにより測定し、tTA-Adの発現に従って正常化した後の未処理細胞におけるV5-αENaC mRNA発現のパーセンテージ±SEMとして提示した。V5-αENaC mRNA半減期は、各細胞調製物に対する一相崩壊非線形回帰によって推定された。重回帰分析は、アクチノマイシンDで処理された細胞におけるV5-αENaC mRNA安定性の統計的有意差を未治療細胞と比較して明らかにした(p<0.0001)。少なくとも4つの異なるラット(n≥4)からの細胞を各実験条件に使用した。以前は、Migneaultら24で図 1として公開されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:異なる細胞および炎症ストレスによるV5-αENaC mRNA安定性の変調。原発性肺胞上皮細胞は、pTet-OffプラスミドとpTREタイトプラスミドと一時的にコトランスフェクトされ、開いた読み取りフレームのV5エピトープを持つαENaC cDNAをコードし、3'UTR配列を完全に含んでいた。細胞を1.0 μMシクロヘキシミド(CHX)(A)または15μg/mL LPS(B)で30分間、または100ng/mL TNF-α(C)で5時間前処理し、続いて1.0 μg/mLドキシサイクリンを15〜120分間処理した。 V5-αENaC mRNAの発現を定量的RT-PCRにより測定し、tTA-Adの発現に従って正常化した後の未処理細胞におけるV5-αENaC mRNA発現のパーセンテージ±SEMとして提示した。少なくとも3つの異なるラット(n≥3)からの細胞を各実験条件に使用した。(D)処理細胞におけるV5-αENaC mRNAの半減期(t1/2)を、細胞内のmRNAの半減期と比較した(Ctrl)。半減期は、式t/2 = ln2/Kを使用してV5-αENaC mRNA分解曲線の速度定数(K)に従って測定し、その後、min± SEM(一方向ANOVA試験およびボンフェローニ後ホックテスト;*p<0.01対対照;n3≥ )として表した。以前にミニョー、F.25で公開された図36から適応。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:逐次欠失クローニング戦略を用い、mRNA安定性の変調におけるαENaC 3'UTRの異なる領域の役割を明らかにする。(A)pTREタイト発現ベクターに挿入された完全な3'UTRを持つV5-αENaC転写物の模式図。オープンリーディングフレームはグレーのボックスとして表示され、3' UTRは白いボックスとして表示されます。αENaC mRNAの3'UTR部分は、完全な3'UTRを有するクローンと異なる欠失変異体(Del 1〜Del4)について描かれています。(B)原発性肺胞上皮細胞は、tTA-Adを発現するpTet-Offプラスミドと共に異なるαENaC 3'UTR欠失変異体をコードするpTREタイトプラスミドを一時的にコトランスフェクトし、ドキシサイクリンによる構築物およびその阻害の特異的発現を可能とした。トランスフェクション後72時間、細胞を15分間にドキシサイクリン(1.0 μg/mL)で15分間処理した。各構成体のV5-αENaC mRNA半減期は、次の式を用いてV5-αENaC mRNA分解曲線の速度定数(K)から推定した:t1/2= ln2/K。V5-αENaC mRNA崩壊は完全な3'UTR(Comp)を有するクローンおよびデル1からデル4 3'UTRの欠失変異体のために示される。mRNA崩壊の半減期(t1/2)はクローンごとに与えられる。右下象限では、グラフは各クローンについて推定された異なるt1/2±SEM値の比較を示す。kruskal-Wallis検定に従って、異なるグループ間のp< 0.05。*p < 0.05 完全な3'UTRと比較してダンのポストホックテストに従って。デル3と比較したダンのポストホックテストに従ったΦ<0.05。少なくとも5つの異なる動物(n≥5)からの細胞を各実験条件に使用した。以前にミニョーら24に掲載された図 2および図 3から適応 .この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:RNA結合タンパク質hnRNPK、Dhx36、およびTial1によるV5-αENaC mRNAの転写後変調。(A)一次肺胞上皮細胞は、V5-αENaC mRNAをコードするpTREタイトプラスミドと、Dhx36、hnRNPK、またはTial1 RRPおよびpTet-Offプラスミドに対する発現ベクターと共にコトランスフェクトした。V5-αENaC mRNA発現は、トランスフェクション後のRT-qPCR72hで定量化し、tTA-Adの式に従って正常化した後の空の細胞(pcDNA3)と比較してV5-αENaC mRNA発現のパーセンテージ±SEMとして表した。Dhx36およびTial1の過剰発現はV5-αENaC mRNA発現を有意に阻害したが、hnRNPKの過剰発現は効果がなかった。*p < 0.05 クルースカル・ウォリス検定とダンのポストホックテストに従って空のベクトルと比較した;n≥ 異なる動物からの3つのサンプルを、実験条件ごとに重複して試験した。(B) αENaC 3' UTRの近位部分は、pTREタイトプラスミド(V5-αENaC-Del5)のαENaCストップコドンの隣にある3'UTRの遠位領域をクローニングすることによって削除された。(C)一次肺胞上皮細胞は、pTREタイトベクター中のV5-αENaCまたはV5-αENaC-Del5と共に、pTet-OffプラスミドおよびDhx36またはTial1 RBP過剰発現に対する発現ベクターと共にコトランスフェクトした。V5-αENaC mRNA発現は、トランスフェクション後のRT-qPCR 72hで定量化し、tTA-Adの発現に従って正常化後の空の細胞(pcDNA3)と比較してV5-αENaC mRNA発現のパーセンテージ±SEMとして表した。Dhx36およびTial1の過剰発現は、V5-αENaC-Del5 mRNA発現に影響を及ぼさなかった。*p < 0.05 クルスカル・ウォリス検定とダンの後ホック検定に従って、実験ベクトルを空のベクトルと比較した場合。実験ベクターを完全な3'UTR変異体と比較した場合のマン・ホイットニーU検定による#p< 0.05;n ≥ 6 各実験条件。図5と7から適応以前にミニョーら24.に掲載.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| A | |||
| テンプレート | 3' UTR | 意味 | シーケンス |
| クナク | 完了 | F | 5'-ATCGCAGCタグカッカッググGTG グアアクテクトタークタクト CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTGAGTAC CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| デル 1 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTGTTCT ガッガカクトガアグ-3' |
|
| デル2 | R | 5'- GCACTAATCGATッタッタアカターター カアッググヘットTTGGG-3' |
|
| デル 3 | R | 5'-GCACTAATCGATTTGTGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3' |
|
| デル 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTCAGAG CGCCGCCAGGCAG-3' |
|
| デル 5 | R | 5'-アッカガトクトカガグクク グカッグカサグ-3' |
|
| F | 5'-アッカガトクトクトクトクトクトクトクトクト CCTCTCCTG-3' |
||
| B | |||
| ターゲット | 意味 | シーケンス | |
| V5-αENaC | F | 5'-CCTAACCCTCCTCGCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTGCCCTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGACGACAAGGAACTC-3' | |
| R | 5'-アクトグタットガッガクトクトクトクトクCC-3' | ||
表1:本研究で使用したプライマー(A)誘導性pTREタイトベクターにおけるV5-αENaC変異体のクローニングおよび生成に用いられるプライマー。(B)定量RT-PCRによるmRNA発現の測定に用いられるプライマー。
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Discussion
一次培養における肺胞上皮細胞のトランスフェクション率が低いのは、これらの細胞におけるmRNA安定性を評価するTet-Offシステムの使用に対する重大な制限であった。しかし、この制限はピペットエレクトロポレーションによって克服され、25〜30%のトランスフェクション効率を可能にした(図1および図3)26。
トランスクリプト安定性の測定は、特定のmRNAの変調と細胞恒常性および代謝への影響を理解するための基本です。GOIのバイオアベイラビリティの変動は、翻訳効率を変化させ、細胞内のGOIの発現に直接影響を与える可能性があります。これらの理由から、mRNAの半減期を決定するためにいくつかの技術が開発された。上記で説明したように、これらの各手法には、関心のあるトランスクリプトの適切な研究を妨げる制限と制約があります。他の技術と比較して、ここで開発されたTET-offモデルは、任意の実験条件下で与えられたmRNAの半減期推定を可能にする利点を有する。しかし、それは私たちが直接内因性転写産物の安定性を研究することを可能にしません。この制限を可能な限り克服するために、5'UTRおよび3'UTR配列をプラスミドに含め、その構築物が内因性転写物と可能な限り類似するようにすることが示唆される。V5エピトープの添加は、内因性転写産物のRT-qPCRによる標的mRNAの特異的増幅を可能にする。クローニング戦略に関しては、対象となる遺伝子の上流に挿入された配列の選択は、非特異的シグナルの増幅を防ぐために重要である。ORFのV5エピトープ配列5'の追加は、その短い長さと肺胞上皮細胞におけるその発現の欠如のために、構築物の特異的なqPCR増幅のために必要である。この戦略はまた、同じ誘導システムを使用してタンパク質翻訳の変調を研究する機会を提供します。V5エピトープの小さなサイズ(42 nt)にもかかわらず、これは転写の安定性に影響を与える可能性があります。このため、ヒトインフルエンザヘマグルチニン(HA)や肺胞上皮細胞の転写体に見つからない他の配列などの他のエピトープも試験することが示唆されている。
システムの1つの制限は、GOIの転写を阻害するドキシサイクリンの使用である。いくつかの報告は、ドキシサイクリンが細胞代謝に大きな影響を与える可能性があることを示しています。16HBE14気管支細胞におけるこの抗生物質の使用は、増殖を減少させ、アポトーシス27による死亡率を増加させる。また、ドキシサイクリンはLPS炎症反応28の変調に関与することが既に示されている。したがって、この抗生物質は、与えられたGOIのmRNA安定性に影響を与える可能性のあるオフターゲット効果を有する可能性がある。これらの理由から、非トランスフェクトされた細胞に対する1μg/mLドキシサイクリンの影響を24時間にわたって評価し、内因性αENaC mRNA発現に何の変化も起こさないことを発見した(図2)。この濃度は、Tet-Offシステムの転写を完全に阻害するために広く使用されており、細胞傷害効果29を最小限に抑えることが推奨されているために選択された。この濃度を肺胞上皮細胞に使用することを提案し、他の遺伝子の研究やTet-Offシステムを用いた他の細胞型の使用に最適な濃度を検証することを推奨する。
我々のシステムは、その転写がドキシサイクリンによって阻害されるまで、GOIの構成的な表現を利用する。過剰なmRNA濃度が細胞に有毒であり、その代謝に影響を与える可能性が示唆されている。これは、GOI転写物の安定性の変化を招き、非生理学的過剰発現30のためにその急速な劣化を引き起こす可能性がある。我々のTet-Offモデルの場合、このような毒性は観察されなかった、トランスフェクトされた細胞は健康な非トランスフェクト細胞のものと同様の形態を示したので(データは示されていない)。mRNAの半減期を決定する際にTet-Offシステムの有効性を実証したTani et al.31に従って、我々の結果は、テトオフ系が肺胞上皮細胞に毒性ではなく、アクト・アクチンのような転写阻害剤の存在下で報告された過大不安定化を反映しないαENaC mRNAの半減期を生じることを示した。
mRNAの半減期を測定するこのシステムの開発は、アクチノマイシンDなどの転写阻害剤の存在下で転写物の安定性を測定した場合に観察された結果に挑戦する。この方法は、トランスクリプト半減期が以前に測定されたよりもはるかに短い可能性があることを示しています。
我々のモデルは、炎症促進症状やRBP過剰発現を含む異なる条件下での特定の転写後の転写後の調節を研究するとともに、RNAをサイレンシングして治療した後に非常に適切である。さらに、肺胞上皮細胞に影響を与える病態生理学的状態におけるmRNAの転写後調節に不可欠な未翻訳領域の特徴付けが可能になる。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
フランシス・ミニョーは、ケベック呼吸器保健ネットワークとカナダ保健研究所(CIHR)肺トレーニングプログラム、FRSQの学生シップ、およびエチュード・シュペリエール研究所の学生シップによって提供されたフェローシップによって支えられ、他のポスドクダレス、モントリオール大学。この研究は、臨床研究におけるゴセリン・ラマール議長とカナダ保健研究所[YBMOP-79544]によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
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