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Biochemistry

PeptiQuick, एक एक कदम झिल्ली प्रोटीन का शामिल Biotinylated Peptidiscs के लिए सुव्यवस्थित प्रोटीन बंधन परख के लिए

Published: November 2, 2019 doi: 10.3791/60661
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biochemistry, University of British Columbia, 2School of Biochemistry, University of Bristol

Summary

हम एक विधि है कि एक ही क्रोमैटोग्राफी कदम में peptidiscs में झिल्ली प्रोटीन शुद्धि और पुनर्गठन को जोड़ती है प्रस्तुत करते हैं. Biotinylated पाड़ प्रत्यक्ष सतह लगाव और biolayer interfermetry के माध्यम से प्रोटीन-लिगंड बातचीत की माप के लिए उपयोग किया जाता है.

Abstract

झिल्ली प्रोटीन, ट्रांसपोर्टरों सहित, चैनल, और रिसेप्टर्स, सेलुलर proteome के लगभग एक चौथाई और वर्तमान दवा लक्ष्यों के आधे से अधिक का गठन. फिर भी, उनकी विशेषता और शैक्षिक या औद्योगिक सेटिंग्स में शोषण के लिए एक प्रमुख बाधा यह है कि सबसे जैव रासायनिक, जैव भौतिक, और दवा स्क्रीनिंग रणनीतियों इन प्रोटीन की आवश्यकता के लिए एक पानी में घुलनशील राज्य में हो. हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में पेप्टीडिस्क विकसित किया है, एक झिल्ली मिमेटिक की पेशकश एक "एक आकार फिट सभी" झिल्ली प्रोटीन घुलनशीलता की समस्या के लिए दृष्टिकोण. हम यहाँ एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल है कि एक एकल क्रोमैटोग्राफी कदम में प्रोटीन शुद्धि और peptidisc पुनर्गठन को जोड़ती है मौजूद है. इस कार्यप्रवाह, PeptiQuick कहा जाता है, polystyrene मोती के साथ डायलिसिस और ऊष्मायन को दरकिनार करने के लिए अनुमति देता है, जिससे बहुत डिटर्जेंट के लिए जोखिम को कम करने, प्रोटीन विकृतीकरण, और नमूना हानि. जब PeptiQuick biotinylated पाड़ के साथ किया जाता है, तैयारी सीधे streptavidin लेपित सतहों से जुड़ा जा सकता है. झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य biotinylate या संशोधित करने के लिए कोई ज़रूरत नहीं है. PeptiQuick झिल्ली रिसेप्टर FhuA और एंटीमाइक्रोबियल लिगंड पेटलिन एम के साथ यहाँ प्रदर्शित किया जाता है, biolayer interfermetry का उपयोग करने के लिए उनकी बातचीत की सटीक गतिज निर्धारित. यह निष्कर्ष निकाला है कि PeptiQuick तैयार करने और एक डिटर्जेंट मुक्त वातावरण में एक दिन के भीतर झिल्ली प्रोटीन-लिगंड बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है.

Introduction

झिल्ली प्रोटीन अक्सर दवा या एंटीबॉडी खोज अनुसंधान कार्यक्रमों से बाहर रखा गया है क्योंकि झिल्ली प्रोटीन की प्रवृत्ति के कारण लिपिड bilayer पर्यावरण के बाहर कुल, विशेष रूप से डिटर्जेंट की उपस्थिति में1. इसलिए, हाल के वर्षों में, कई झिल्ली mimetics (कहा हुआ पाड़) अलगाव और एक पूरी तरह से डिटर्जेंट मुक्त वातावरण में झिल्ली प्रोटीन की पूछताछ की सुविधा के लिए विकसित किया गया है (यानी, नैनोडिस्क, SMALPs, उभयपोल, आदि) 2,3,4,5,6. हालांकि, इन mimetics में झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन अक्सर व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता है, जो समय लेने वाली है और आम तौर पर प्रोटीन वसूलीकीहानि के साथ 7,8. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में एक "एक आकार फिट-सभी" peptidisc9के रूप में जाना फार्मूला विकसित किया है. Peptidisc का गठन किया है जब एक डिजाइनर 4.5 केडी एम्फीपैथिक द्विहेलपेक्टिव पेप्टाइड की कई प्रतियां एक लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन के हाइड्रोफोबिक सतह के लिए बाध्य. पेप्टीडिस्क में स्थिर पुनर्गठन डिटर्जेंट को हटाने पर होता है, दोनों अंतर्जात लिपिड और पानी में घुलनशील कणों में solubilized झिल्ली प्रोटीन entrapping. ये स्थिर कणों अब कई बहाव अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल हैं.

Peptidisc विधि कई फायदे प्रदान करता है; उदाहरण के लिए, पुनर्गठन सीधा है, क्योंकि लक्ष्य पर peptidisc पाड़ की बाध्यकारी प्रोटीन टेम्पलेट ही9,10द्वारा निर्देशित है. पेप्टाइड स्टोइकियोमेट्री भी स्वयं निर्धारित है, और exogenous लिपिड के अलावा आवश्यक नहीं है। Peptidisc गठन सरल डिटर्जेंट तनुता द्वारा होता है, polystyrene मोती पर डायलिसिस या अधिशोषण पर एक महत्वपूर्ण लाभ है, जो अक्सर गैर विशिष्ट सतह संघ और एकत्रीकरण11,12 के कारण कम प्रोटीन उपज में परिणाम ,13. अंतिम पेप्टिक एसेम्बली अत्यधिक थर्मोस्टेबल है और हमेशा विभिन्न बफरों में या द्विसंयोजक कोनेशन की उपस्थिति में घुलनशील होती है (उदा., नी2+)। पाड़ की शुद्धता और संरचनात्मक एकरूपता भी उच्च है (उदा., endotoxin मुक्त), और पेप्टाइड कार्यात्मक विभिन्न पदों पर रखा समूहों के साथ अनुकूलित किया जा सकता है.

हम यहाँ एक प्रयोगशाला कार्यप्रवाह प्रस्तुत PeptiQuick कहा जाता है, यह भी पर मोती पुनर्गठन 9 के रूप में जाना जाताहै. इस प्रोटोकॉल एक ही कदम में और एक ही क्रोमैटोग्राफी समर्थन पर झिल्ली प्रोटीन शुद्धि और peptidisc पुनर्गठन को जोड़ती है. जैसा कि नाम इंगित करता है, PeptiQuick अन्य पुनर्गठन विधियों की तुलना में तेजी से है, और यह भी गंभीरता से डिटर्जेंट के लिए जोखिम समय कम कर देता है. नकारात्मक डिटर्जेंट प्रभाव जैसे प्रोटीन खुलासा और एकत्रीकरण अक्सर एक समय पर निर्भर तरीके से होते हैं; इसलिए, डिटर्जेंट जोखिम को कम करने के लिए देशी प्रोटीन अनुरूपता14,15बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. यह प्रोटीन बातचीत और ligand बाध्यकारी सजातीयता पर रिपोर्ट है कि तरीकों की सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है.

इस प्रोटोकॉल को विकसित करते समय, हम पेप्टीडिस्क पाड़ के उपन्यास बायोटिनीलेट संस्करण पेश करते हैं, जिसे बायो-पेप्टीडिस्क कहा जाता है। बायोटिन कार्यात्मक समूह ों को स्ट्रेप्टाविडिन लेपित सतहों पर लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन के लगाव की अनुमति देते हैं। चूंकि बायोटिन लेबलिंग पाड़ तक सीमित है, लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन पर बाध्यकारी साइटों unaltered रहते हैं. जैव-पेप्टीडिस्क का उपयोग करना, जीवाणु झिल्ली रिसेप्टर फुआ और एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड पेटिका एम (कोल) की बाध्यकारी गतिजता16निर्धारित की जाती है। इस आत्मीयता biolayer interfermetry (BLI) के माध्यम से मापा जाता है, जो एक सेंसर टिप से परिलक्षित सफेद प्रकाश हस्तक्षेप पैटर्न के आधार पर वास्तविक समय में बातचीत का विश्लेषण करती है.

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, BLI विश्लेषण के दौरान डिटर्जेंट की आवश्यकता समाप्त हो जाती है, जो एक महत्वपूर्ण विकास है, क्योंकि डिटर्जेंट बातचीत को बाधित कर सकता है। बंधन सजातीयता इस विधि के साथ तेजी से मापा जा सकता है, और परिणाम पहले नैनोडिस्क और आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमिति (आईटीसी)16का उपयोग कर रिपोर्ट उन लोगों के लिए तुलनीय हैं। PeptiQuick कार्यप्रवाह में महत्वपूर्ण कदम दिखाए जाते हैं और चर्चा की, जैसे प्रोटीन तैयारी, डिटर्जेंट कमजोर पड़ने, पेप्टाइड इसके अलावा, और पुनर्गठन, के साथ-साथ BLI परख में लिगन्ड और एनालाइट बाइंडिंग का निवारण करने के लिए युक्तियों के साथ। PeptiQuick कार्यप्रवाह का उपयोग करना, यह पाया गया है कि झिल्ली प्रोटीन peptidiscs में कब्जा कर लिया जा सकता है और उनकी बातचीत एक दिन के भीतर मापा.

Protocol

1. झिल्ली रिसेप्टर FhuA की तैयारी और विलेयीकरण

  1. एक्सप्रेस अपने6-taggedFhuA में Escherichia कोलाई तनाव AW740. M9 मीडिया में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 h के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएँ (तालिका 1)। एक विस्तृत अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल के लिए मिल्स एट अल16 देखें।
  2. अपकेंद्रण द्वारा फसल कोशिकाओं (5,000 x g, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और उन्हें Tris-salt-glycerol (TSG) बफर (तालिका 1) के 50 एमएल में resuspend. पुनर्निलंबित कोशिकाओं को बंद करें और lysis से पहले 1 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए फ़ेनिलमेथेनसल्फोनिलफ्लोराइड (पीएमएसएफ) जोड़ें।
    चेतावनी: पीएमएसएफ विषाक्त और संक्षारक है।
  3. 8,000 साई पर 15,000 साई या एक फ्रेंच प्रेस (तीन मार्ग) पर एक microfluidizer (तीन मार्ग) का उपयोग कर कोशिकाओं Lyse. कम गति सेंट्रीफ्यूगेशन (5,000 x g, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा अअपलनेक् त कोशिकाओं और अन्य अघुलनशील पदार्थ को गोली मारें।
  4. कच्चे झिल्ली के अंश को अलग करने के लिए सुपरनेटेंट (200,000 x g, 40 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) ultracentrifuge। सुपरनेटेंट को छोड़ दें, टीएसजी बफर की एक न्यूनतम राशि में झिल्ली गोली को फिर से खोल दें, और एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए एक ग्लास या धातु डोन्सर उपकरण का उपयोग करके डांटें।
  5. पुन: निलंबित कच्चे झिल्ली के प्रोटीन एकाग्रता की जांच करने के लिए एक ब्रैडफोर्ड परख प्रदर्शन करते हैं। सोलुबिलाइजेशन से पहले टीएसजी बफर का उपयोग करके कच्चे झिल्ली को 3 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता में पतला करें।
  6. कोमल रॉकिंग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए जीवाणु भीतरी झिल्ली को चुनिंदा रूप से solubilize करने के लिए 1% (v/v) की अंतिम एकाग्रता के लिए डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स-100 जोड़ें। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन (200,000 x g, 40 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा अघुलनशील पदार्थ (बाहरी झिल्ली अंश) को गोली मारें।
  7. अधिनांत को त्याग ें जिनमें सोलुबिलीकृत झिल्ली होती है और टीएसजी में गोली को 3 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता में पुन: स्फूर्त करें। resuspended बाहरी झिल्ली अंश करने के लिए 1% (v/v) की एकाग्रता के लिए lauryldimethylamine ऑक्साइड (LDAO) जोड़ें और कोमल रॉकिंग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए solubilize।
  8. सभी अघुलनशील सामग्री (200,000 x g, 40 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) गोली के लिए एक अंतिम centrifugation कदम प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: परिणामी supernatant लक्ष्य अपने टैग FhuA सहित solubilized बाहरी झिल्ली प्रोटीन, शामिल हैं.

2. PeptiQuick कार्यप्रवाह का उपयोग कर FhuA के शुद्धि और पुनर्गठन

  1. पूर्व-विक्षिप्त नी-एनटीए कॉलम (5 एमएल राल मात्रा) के साथ दो कॉलम वॉल्यूम के साथ स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) धोने बफर(तालिका 1)।
  2. टीएसजी का उपयोग करके 1% एलडीएओ से 0.04% एलडीएओ तक सोलुबिलाइज्ड बाहरी झिल्ली को दूर करें। फिर, 5 m की एक अंतिम एकाग्रता के लिए imidazole जोड़ें.
    चेतावनी: Imidazole विषाक्त और संक्षारक है.
  3. नी-एनटीए राल पर solubilized बाहरी झिल्ली प्रोटीन लोड और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा. FhuA के राल बाइंडिंग को बढ़ाने और द्वितीयक प्रवाह के माध्यम से एकत्रित करने के लिए राल पर प्रवाह के माध्यम से पुनः लोड करें।
    नोट: बाद में सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) विश्लेषण के लिए एक संदर्भ के रूप में solubilized सामग्री के एक 20 डिग्री एल alicot रखें।
  4. IMAC धोने बफर के 250 एमएल के साथ राल धो लें और eluate के पहले 50 एमएल इकट्ठा. राल बिस्तर की मात्रा की ऊंचाई के लिए धोने बफर नाली और स्तंभ पर stopcock बंद करो.
  5. कॉलम में 1 एमएल संकेंद्रित 10 मिलीग्राम/एमएल बायो-पेप्टीडिस्क पेप्टाइड विलयन (सारणी 1) जोड़ें। टीएसजी में 1 मिलीग्राम/एमएल बायो-पेप्टीडिस्क पेप्टाइड समाधान के 50 एमएल जोड़ें और टीएसजी में मोती को पुन: निलंबित करने के लिए एक ग्लास रॉड के साथ राल को हिलाएं।
  6. Peptidisc फँसाने के बाद, राल व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं और राल के माध्यम से अतिरिक्त 1 mg/mL जैव-Peptidisc समाधान नाली.
  7. टीएसजी के 50 एमएल के साथ नी-एनटीए संलग्न पेप्टीडिस्क कणों को धो लें। टीएसजी में 600 एमएल इमिडाज़ोल युक्त 15 एमएल आईएमसी एल्यूशन बफर (सारणी 1) के साथ पेप्टीडिस्क कणों को एल्यूट करें। 1 एमएल अंश ोंलीजिए और तुरंत 0.5 एम EDTA के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के लिए chelate leached निकल आयनों.
    चेतावनी: EDTA एक परेशानी है.

3. PeptiQuick पुनर्गठन का मूल्यांकन

  1. एसडीएस-पेज विश्लेषण
    1. लोड 10 [L alicots के प्रारंभ सामग्री, flowthrough, wash(es), और एक 12% एसडीएस-डेनिंग जेल और इलेक्ट्रोफोरीज़ पर PeptiQuick पुनर्गठन से eluted भिन्न 60 मा की एक निरंतर वर्तमान में 30 मिनट के लिए.
    2. Coomasie नीले रंग के साथ जेल दाग, जेल destain, और एक स्कैनर पर कल्पना.
  2. आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)
    1. PeptiQuick पुनर्गठन के 12% एसडीएस-पेज विश्लेषण के आधार पर, अलग और प्रासंगिक भिन्न पूल, और उन्हें एक 30 kDa कट-ऑफ केन्द्रापसारक का उपयोग कर ध्यान केंद्रित।
      नोट: साथ वीडियो में, भिन्न F3-F7 एक साथ जमा कर रहे हैं और नीचे केंद्रित 1 एमएल (एसईसी साधन पर इंजेक्शन पाश मात्रा).
    2. टीएसजी बफर में 0.25 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर एक जेल निस्पंदन S200 (300/10) कॉलम पर पूल किए गए IMAC एल्यूशन अंशों का $1 एमएल इंजेक्शन। 1 एमएल अंश ले लीजिए और उन्हें एक 12% एसडीएस जेल पर चलाने के लिए निर्धारित करने के लिए जो एसईसी अंश पूल और ध्यान केंद्रित करने के लिए.
      नोट: eluted PeptiQuick अंश एकाग्रता के बिना जमा किया जा सकता है, और एक alicot एसईसी पर इंजेक्शन के लिए पुनर्गठन की गुणवत्ता की जांच हो सकती है. यह झिल्ली प्रोटीन है कि केन्द्रापसारक एकाग्रता के दौरान एकत्रीकरण के लिए संभावित रूप से संवेदनशील हैं के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है.

4. बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री

  1. BLI प्रयोगात्मक सेटअप
    1. हाथ से 96 अच्छी तरह से थाली सेट करें.
      नोट: सभी कुओं 200 डिग्री सेल्सियस के एक अंतिम मात्रा में भर रहे हैं.
    2. कॉलम 1 में, पंक्तियों A$E, गतिकी बफ़र के 200 डिग्री सेल्सियस लोड करने के लिए युक्तियाँ संतुलन और एक आधार रेखा संकेत फार्म की अनुमति देने के लिए.
    3. गतिज बफर(तालिका 1) में 2.5 ग्राम/एमएल की सांद्रता के लिए लिगन्ड (फियूए में फ्यूए) को दूर करें। इस कमजोर पड़ने के 200 डिग्री सेल्सियस को स्तंभ 2 में एजेडडी पंक्तियों में लोड करें।
    4. केवल E2 (संदर्भ सेंसर) के लिए गतिकीबियों बफर के 200 $L जोड़ें।
    5. कॉलम 3 में गतिकी बफ़र के 200 $L जोड़ें, टिप से अतिरिक्त FhuA को धोने के लिए पंक्तियों A$E.
    6. कॉलम 4 में, ए 4 से D4 के लिए प्लेट नीचे एनेलाइट (ColM) के दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने का संचालन। D4 में A4 से 3.5 nM (1*Kd) में 28 nM (8*Kd) के साथ प्रारंभ करें।
    7. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग (उच्चतम कॉलम सांद्रता का उपयोग किया) के लिए मापने के लिए E4 करने के लिए 28 एनएम ColM जोड़ें।
    8. कॉलम 5 में गतिकी बफ़र का 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, पंक्तियों एजेडई।
      नोट: यहाँ, ColM टिप से अलग हो जाएगा, और वियोजन मापा जाता है.
    9. बीआई उपकरण में सेटअप प्लेट रखें।
    10. BLI साधन में सेंसर टिप ट्रे प्लेस.
    11. BLI डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और सॉफ्टवेयर विज़ार्ड पर नई कीनेटिक्स प्रयोग का चयन करें।
    12. सॉफ्टवेयर में 96 अच्छी तरह से प्लेट के लेआउट इनपुट करने के लिए प्लेट परिभाषा टैब का उपयोग करें.
      नोट: लिगन्ड, फुआ युक्त कुओं को "लोड" के रूप में इनपुट किया जाता है। बफर युक्त कुओं केवल "बफर" के रूप में inputted हैं. analyte युक्त कुओं, ColM, के रूप में inputted हैं "नमूना".
    13. प्रयोग में प्रत्येक चरण के लिए समय और प्लेट रोटेशन गति निर्धारित करने के लिए परख परिभाषा टैब का उपयोग करें.
      नोट: प्रयोगात्मक कदम के रूप में सेट कर रहे हैं: 1) आधार रेखा: 60 s; 2) लोड हो रहा है: 250 s; 3) आधार रेखा2: 300 s; 4) संघ: 450 s; और 5) वियोजन: 900 s. डिफ़ॉल्ट (1,000 आरपीएम) के रूप में हिला गति छोड़ दें। उपरोक्त चरण व्यक्तिगत रूप से 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक स्तंभ के लिए वांछित कदम का चयन करके और राइट-क्लिक प्रत्येक स्तंभ पर परख कदम जोड़ें असाइन कर रहे हैं.
    14. पहले स्तंभ पर राइट-क्लिक करके पहला चरण असाइन करें और नई परख प्रारंभ करेंका चयन करें. सुनिश्चित करें कि आधार रेखा चरण सही रूप से नीचे दायें हाथ विंडो का उपयोग कर असाइन किया गया है और ड्रॉप-डाउन मेनू के साथ आवश्यक के रूप में परिवर्तित करें।
    15. प्लेट के साथ दाईं ओर क्लिक करके और परख चरण जोड़ेंका चयन करके प्रत्येक स्तंभ के बाद के चरण असाइन करें. चरण 4.1.13 में सेट के रूप में, उपयुक्त स्तंभ के लिए इन्हें असाइन करें।
    16. octet साधन सेंसर ट्रे में सही स्थान से BLI पिन ले जा रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सेंसर असाइनमेंट टैब का उपयोग करें.
      नोट: सेंसर असाइनमेंट टैब में, केवल A1-E1 नीले हाइलाइट किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सेंसर ट्रे में इन स्थानों में एक सेंसर टिप मौजूद है और यह सुनिश्चित करें कि F1 -H1 खाली हैं।
    17. स्क्रीन पर F1-H1 हाइलाइट करें, फिर राइट-क्लिक करें और इन्हें रिक्त के रूप में चिह्नित करने के लिए निकालें का चयन करें। उपयोग के बाद ट्रे में सेंसर बदलें सेंसर का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया सेंसर बनाए रखने के लिए.
    18. समीक्षा प्रयोग टैब में, जो निष्पादन से पहले प्रयोग का अंतिम अवलोकन प्रदान करता है, यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगात्मक चरणों पर जाएं कि संपूर्ण सेटअप सही है.
    19. चलाएँ प्रयोग टैब में, विधि फ़ाइलों को सहेजने के लिए किसी फ़ाइल स्थान का चयन करें.
    20. प्लेट तापमान को कमरे के तापमान में बदलें।
    21. प्रयोग चलाने के लिए GO का चयन करें.
  2. BLI डेटा विश्लेषण
    1. Octet BLI डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें।
    2. प्रयोग का पता लगाने और प्रयोगात्मक सारांश की जांच करने के लिए डेटा चयन टैब का उपयोग करें. प्रोजेक्ट फ़ाइल चरण 4.1.19 के दौरान निर्धारित अपने सहेजें स्थान से आयात करें।
    3. प्रत्येक प्रयोग के लिए सेंसर जानकारी का चयन करके analyte (यहाँ, ColM) की सांद्रता इनपुट.
    4. संदर्भ टिप के रूप में E1 में टिप असाइन करें।
    5. संदर्भ संकेत (E1) को प्रयोगात्मक डेटा से घटाने के लिए संसाधन टैब का उपयोग करें. गैर-विशिष्ट analyte बाइंडिंग के लिए संदर्भ टिप से अपुष्ट डेटा की जाँच करें। यदि कोई नहीं देखा जाता है, तो आगे बढ़ें।
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण है. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग मनाया जाता है, तो यह चरण 4.2.7 में के लिए accounted किया जाएगा।
    6. y-अक्ष को दूसरे आधार रेखा चरण पर संरेखित करें. इंटरस्टेप कनेक्शन को सही न करें। Savitzky-गोले फ़िल्टरिंग का चयन करें। प्रक्रिया डेटा का चयन करें!|
    7. विश्लेषण टैब में, संदर्भ सेंसर घटाया से संकेत के साथ संघ और वियोजन घटता देखने के लिए प्लॉट के नीचे तालिका में प्रयोगात्मक डेटा का चयन करें।
    8. 1:1 बाइंडिंग मॉडल का चयन करें और आंशिक वक्र फ़िट का चयन करें. फिट घटताका चयन करें! |
    9. वक्र फिटिंग की जांच करने के लिए अवशिष्ट दृश्य साजिश का विश्लेषण करें।
    10. परिकलित Kdदेखने के लिए तालिका में स्क्रॉल करें.
    11. सेटअप, कच्चे और विश्लेषण किए गए डेटा के प्लॉट्स, और परिकलित वियोजन स्थिरांकों का विवरण देने वाले स्प्रेडशीट दस्तावेज़ को सहेजने के लिए रिपोर्ट सहेजें का चयन करें.

Representative Results

झिल्ली रिसेप्टर FhuA एक प्रयोगशाला ई. कोलाई तनाव में व्यक्त किया जाता है. बाहरी झिल्ली अंश centrifugation द्वारा काटा जाता है, और प्रोटीन एक दो कदम डिटर्जेंट निष्कर्षण का उपयोग कर solubilized हैं. solubilized झिल्ली प्रोटीन Ni-NTA agarose मोती एक प्लास्टिक स्तंभ में पैक पर लोड कर रहे हैं, प्रोटोकॉल में प्रस्तुत के रूप में PeptiQuick कार्यप्रवाह द्वारा पीछा किया. आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर एक गुणवत्ता नियंत्रण के बाद, जैव-Peptidisc कणों streptavidin लेपित पिन पर स्थिर कर रहे हैं। BLI विश्लेषण FhuA और ColM के बीच बातचीत की गतिज को मापने के लिए आयोजित किया जाता है. इस प्रयोग का योजनाबद्ध अवलोकन चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है।

एक एसडीएस जेल IMAC कॉलम से FhuA जैव-Peptidisc कणों के elution के बाद पुनर्गठन की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए चलाया जाता है (चित्र 2) . शुरू करने के लिए इसी भिन्नों के Aliquots, flowthrough, washes, और elution भिन्नS पर लोड कर रहे हैं SDS-जेल PeptiQuick विधि की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए. प्रवाह के माध्यम से भिन्न में FhuA की कमी ऊतक भिन्न में एक संवर्धन के साथ सहसंबद्ध है, जो इंगित करता है कि प्रोटीन की शुद्धि प्रभावी रहा है. लघु संदूषक प्रोटीन बैंड एलिटित भिन्नों में पाए जाते हैं। एसडीएस जेल विश्लेषण का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि एसईसी विश्लेषण से पहले कौन से अंश जमा किए जाने चाहिए। फुआ जैव-पप्टिडिस कणों का एक देशी जेल भी फुआ विलेयता की पुष्टि करने के लिए चलाया जाता है (अनुपूरक चित्र 1)। मूल जेल में पुनर्गठित प्रोटीन का प्रवास एक डिटर्जेंट मुक्त वातावरण में प्रोटीन घुलनशीलता को इंगित करता है।

एसईसी विश्लेषण पेप्टीडिस्क कणों की विलेयता का आकलन करने के लिए किया जाता है। चित्रा 3क में प्रस्तुत क्रोमैटोग्राम लगभग 14 एमएल (6 एमएल जेल निस्पंदन S200 10/300 स्तंभ पर 8.0 एमएल की शून्य मात्रा) पर एक एकल, सममित शिखर eluting से पता चलता है। इस चोटी की स्थिति, शून्य मात्रा पिछले, FhuA जैव-Peptidisc कणों की विलेयता की पुष्टि करता है. संदर्भ के लिए, चित्र 3B एक सैद्धांतिक suboptimal peptidisc तैयारी दिखाता है. इस मामले में, क्रोमैटोग्राम शून्य मात्रा में एक बड़ा प्रोटीन शिखर eluting से पता चलता है, प्रोटीन समुच्चय की उपस्थिति का संकेत. छोटे चोटी eluting सिर्फ मुख्य peptidisc चोटी पिछले अतिरिक्त peptidisc पेप्टाइड्स से मेल खाती है.

एनालाइट कोलम के साथ फुआ की बातचीत को स्ट्रेप्टिविडिन लेपित सेंसर के लिए पेप्टीडिस्क्स के लगाव के बाद निर्धारित किया जाता है। सेंसर युक्तियाँ पहले गतिज बफर में समतुल्य हैं, फिर FhuA जैव-Peptidiscs युक्त बफर में स्थानांतरित. फुआ जैव-पेपटिडिस्क की सांद्रता और उस समय की लंबाई जिसके लिए उन्हें टिप के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, इस प्रयोग से पहले अनुकूलित किया जाता है (अनुपूरक चित्र 1)। लोडिंग और धोने के चरणों के बाद, संघ कदम भरी हुई युक्तियाँ और पेट का दर्द एम के चार अलग अलग सांद्रता के बीच बातचीत के उपाय. सुझावों के बाद के आंदोलन वापस बफर परिणाम में वियोजन, जो सफेद प्रकाश की तरंगदैर्ध्य बदलाव से मापा जाता है टिप से दर्शाती है.

चित्र 4क इस प्रयोग से अपरिष्कृत डेटा सेंसरग्राम आउटपुट प्रदर्शित करता है। सभी अंश लोडिंग और आधाररेखा चरणों में एक समान दिखाई देते हैं, पीले रंग में संदर्भ ट्रेस के अलावा। संदर्भ टिप कोई ligand भरी हुई है, लेकिन nonspecific करने के लिए nonalyte nonalyte के लिए गैर विशिष्ट बाइंडिंग, जो एक महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण है के लिए उजागर किया है. परिणामों के अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, संदर्भ टिप से संकेत nonspecific बाइंडिंग के लिए खाते में प्रयोगात्मक युक्तियों के लिए अंश से घटाया है। डेटा संघ चरण के प्रारंभ के साथ संरेखित होते हैं ताकि प्रत्यक्ष विज़ुअल तुलना की जा सके, जैसा कि चित्र 4Bमें दर्शाया गया है। यह तुलना पेट िकात्म्य एम की सांद्रता बढ़ाने के लिए तरंगदैर्घ्य में वृद्धि दर्शाती है। वक्र डेटा के लिए उपयुक्त है और एक शास्त्रीय 1:1 बाइंडिंग मॉडल को प्रदर्शित करता है।

अवशिष्ट दृश्य आलेख(चित्र 4B, तल), जो फिटिंग और प्रयोगात्मक डेटा के बीच अंतरों का वर्णन करता है, कोलम (28 नृम) की उच्चतम सांद्रता के लिए उपयुक्तता को दर्शाता है, तीन निम्न सांद्रताओं की तुलना में खराब है। वक्र की परिच्छेदिका में ही बंधन वक्र पठार का अभाव होता है, जो एक विशिष्ट बाइंडिंग प्रयोग में बाइंडिंग साइट संतृप्ति की विशेषता है। पठार की कमी विषमांगी बंधन का सुझाव देती है, जो संभवतः उच्च कोलम सांद्रता की एक कलाकृति है। इस उच्चतम ColM एकाग्रता इसलिए विश्लेषण से छूट दी है, और अन्य तीन सांद्रता वियोजन स्थिरांक निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है (चित्र 4C,D). एक दो पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण, 95% विश्वास स्तर पर, ने पाया कि इस प्रयोग से मनाया गया वियोजन स्थिरांक विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त मूल्यों से काफी भिन्न नहीं है (चित्र 4E)16.

Figure 1
चित्र 1: Bio-Peptidiscs और BLI विश्लेषण का उपयोग कर के PeptiQuick कार्यप्रवाह के लिए अवलोकन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एसडीएस जेल विश्लेषण (12%) शुरू की, flowthrough, धोने, और elution भिन्न PeptiQuick कार्यप्रवाह के माध्यम से एकत्र की. नमूने के बारे में 10 $L प्रत्येक लेन में लोड किया गया था और 60 लेकिन की एक निरंतर धारा पर 30 मिनट के लिए चला रहे हैं. जेल Coomasie नीले रंग के साथ दाग था, destained, और एक जेल स्कैनर पर कल्पना की. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रायोगिक और सैद्धांतिक एसईसी प्रोफाइल क्रमशः इष्टतम और उपऑप्टिमल पुनर्गठन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (क)बायो-पेप्टीडिस्क्स में पेप्टीक्विक पुनर्गठित फुआ ($82 केडीए) की प्रायोगिक एसईसी प्रोफाइल। IMAC elution भिन्नF3 -F7 जमा और एक 30 kDa कट-ऑफ केन्द्रापसारक का उपयोग कर $ 1 एमएल के लिए ध्यान केंद्रित किया गया. यह संकेंद्रित नमूना TSG बफर में एक जेल निस्पंदन S200 (10/300) स्तंभ पर 0.25 एमएल/मिनट पर इंजेक्ट किया गया था। (B)एक suboptimal PeptiQuick पुनर्गठन के सैद्धांतिक एसईसी प्रोफ़ाइल. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: FihuA के साथ कॉलम बातचीत की जांच जैव-Peptidiscs में पुनर्गठित. (ए) कच्चे डेटा सेंसरग्राम के साथ संदर्भ सेंसर ट्रेस पीले रंग में. (बी, सी) शीर्ष: आंशिक 1:1 बाध्यकारी वक्र फिटिंग के साथ संघ और वियोजन कदम। नीचे: अवशिष्ट दृश्य प्रयोगात्मक डेटा और कम्प्यूटेशनल फिटिंग के बीच अंतर को दर्शाते हैं। (C) कोलम की उच्चतम सांद्रता के अपवर्जन के साथ (ख) का पुनर्लेखन। (घ) संघ और वियोजन दर (केपर और के)क्रमशः और वियोजन स्थिरांक (Kd) का निरीक्षण किया गया . (ई) फुआ-कोलम वियोजन स्थिरांकों की तुलना पेप्टीडिस्क और बीआई (इस प्रयोग में), पेप्टीडिस्क और माइक्रोस्केल थर्मोफोरोसिस (सविल, अप्रकाशित डेटा), और नैनोडिस्क और समतापीय अनुमापन कैलोरीमिति16. त्रुटि सलाखों अनिश्चितता के एक एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि एन.एस. 95% विश्वास स्तर पर कोई महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

M9 मीडिया (प्रति लीटर)
200 एमएल M9 नमक
800 एमएल डीएच2हे
10 एमएल 40% ग्लूकोज
80 $L 1 एम CaCl2
2.5 एमएल 1 एमजीएसओ4
300 डिग्री एल 15 मिलीग्राम/एमएल थायमीन
टीएसजी बफर
50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.8
50 एमएम नैक्ल
10% ग्लिसरोल
IMAC धो बफर
50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.8
50 एमएम नैक्ल
10% ग्लिसरोल
0.04% एलडीएओ
5 एमएम इमिडाज़ोल
जैव-पेप्टीडिस्क समाधान
बाँझ dH2हे में तैयार करने के लिए उपयोग जैव-Peptidisc भंग (gt; 95% शुद्धता)। पेप्टाइड समाधान की एकाग्रता और मात्रा पुनर्गठन प्रक्रिया में कदम पर निर्भर करता है।
50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.8
50 एमएम नैक्ल
नोट: यह जैव-Peptidisc पेप्टाइड स्टॉक एक महीने से अधिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है.
IMAC Elution बफर
50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.8
50 एमएम नैक्ल
10% ग्लिसरोल
600 एमएम इमिडाज़ोल
काइनेटिक्स बफर
50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.8
50 एमएम नैक्ल
0.002% ट्वेन-20
0.1% बीएसए

तालिका 1: मीडिया और समाधान की तैयारी के लिए व्यंजनों.

अनुपूरक चित्र 1: 4%-16% PeptiQuick कार्यप्रवाह से एकत्र की गई इलुशन अंशों का स्पष्ट देशी जेल विश्लेषण. नमूने के बारे में 10 $L प्रत्येक लेन में लोड किया गया था और 30 लेकिन की एक निरंतर धारा पर 40 मिनट के लिए चला रहे हैं. जेल Coomasie नीले रंग के साथ दाग था, destained, और एक स्कैनर पर कल्पना की. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

अनुपूरक चित्र 2: एक पिन का उपयोग कर के लिगंड एकाग्रता अनुकूलन. (ए) बायो-पेप्टीडिस्क में फुआ की छः अलग-अलग सांद्रताओं का परीक्षण एकल स्ट्रेप्टाविडिन लेपित पिन के लिए बाध्यकारी करने के लिए किया गया था। यह लिगन्ड सांद्रता के बीच कुओं में बफर के साथ एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में स्थापित किया गया था (सेटअप प्रोटोकॉल के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। (बी)लिगन्ड अनुकूलन प्रयोग के लिए कच्चे डेटा सेंसरग्राम. पिन सबसे बड़ी प्रतिक्रिया देता है और इसके अतिरिक्त एकाग्रता संख्या 4 पर संतृप्ति तक पहुँचता है (या 2.5 g/ कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

पूरक फ़ाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).

Discussion

जबकि डिटर्जेंट झिल्ली प्रोटीन निकालने और शुद्ध करने के लिए सबसे सरल तरीका बना हुआ है, इन सर्फेक्टेंट प्रोटीन स्थिरता, समारोह पर कई अवांछित प्रभाव हो सकते हैं, और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण1,2,3, 4,5,6,7,8,9. इन कठिनाइयों ने झिल्ली के विकास को प्रेरित किया है, जो डिटर्जेंट की उपस्थिति को कम करने और देशी झिल्ली पर्यावरण को यथासंभव2,3,4 को दोहराने का प्रयास करते हैं ,5,6. तथापि, अधिकांश पुनर्गठन विधियों के लिए पुनर्गठन की शर्तों के महत्वपूर्ण अनुकूलन की आवश्यकता होती है और प्रायः अतिरिक्त शोधन चरणों की आवश्यकता होती है, जो अंतिम उपज7,8को कम करते हैं । पेप्टीडिस्क स्वतः लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन के अनुकूल हो जाता है और तुलनात्मक रूप से , कम अनुकूलन और डाउनस्ट्रीमशुद्धि9,10की आवश्यकता होती है . इस प्रोटोकॉल में, PeptiQuick बहाव प्रोटीन प्रोटीन बातचीत विश्लेषण के लिए पुनर्गठन प्रोटोकॉल को कारगर बनाने के लिए एक सरल साधन के रूप में प्रस्तुत किया है.

हालांकि सीधा, वहाँ कई प्रयोगात्मक चेतावनी है कि असफल पुनर्गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इनमें से सबसे आम प्रोटीन एकत्रीकरण के कारण है। इसलिए पुनर्गठन प्रक्रिया की निगरानी के लिए आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, शून्य आयतन पर आकार अपवर्जन शिखर प्रोटीन समुच्चय का सूचक है (चित्र 3ख)17,18. झिल्ली प्रोटीन समुच्चय आम तौर पर पुनर्गठन से पहले उप इष्टतम डिटर्जेंट शर्तों के लिए लंबे समय तक जोखिम पर फार्म. विशेष रूप से, यह पाया गया है कि डिटर्जेंट में झिल्ली प्रोटीन समुच्चय बनाने के लिए जब केन्द्रापसारक उपकरणों पर ultrafiltration द्वारा ध्यान केंद्रित करते हैं. इस मामले में, संवेदनशील झिल्ली प्रोटीन वैक्यूम अल्ट्रा निस्पंदन, एकाग्रता की एक gentler और अधिक सजातीय विधि का उपयोग कर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है के बाद से फिल्टर करने के लिए प्रोटीन के अधिशोषण कम है.

सामान्य में, प्रोटीन एकाग्रता से बचने के लिए, eluted IMAC अंशों जमा किया जाना चाहिए, और एक aliquot एक आकार बहिष्करण स्तंभ पर इंजेक्शन इसके पुनर्गठन की गुणवत्ता की जांच करने के लिए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अनिगमित मुक्त पेप्टाइड एल्यूट्स मुख्य पेप्टिक शिखर के ठीक बाद (चित्र 3ख) । मुक्त पाड़ जरूरी downstream प्रयोगों में बाधा नहीं है. हालांकि, यदि आवश्यक हो, तो इस अतिरिक्त को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा हटाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पुनर्गठन के दौरान धोने की मात्रा में वृद्धि, और IMAC राल से elution से पहले, प्रभावी ढंग से मुक्त पेप्टीडिस्क पेप्टाइड के अधिकांश को दूर करने के लिए पर्याप्त है. इसलिए, पुनर्गठन की गुणवत्ता की जांच करने के लिए आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी की सिफारिश की जाती है।

BLI प्रयोग दोनों ligand और analyte सांद्रता के सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है. Ligand बाइंडिंग एक स्पष्ट संकेत प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन ओवरलोडिंग संकेत संतृप्ति का कारण होगा, जो टिप सतह पर भीड़ और steric बाधा से डेटा कलाकृतियों में परिणाम. अतः लिगन्ड की सांद्रता तथा समय की लंबाई दोनों को टिगंड विलयन में युक्ति व्यय करने के लिए प्रत्येक प्रोटीन नमूने(पूरक चित्र 2)के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। एनालाइट एकाग्रता भी अनुकूलित किया जाना चाहिए। यदि वियोजन स्थिरांक ज्ञात है, तो यह चरण आसान हो जाता है, क्योंकि सांद्रता श्रेणी का अनुमान लगाया जा सकता है. इस विश्लेषण के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु 0.1 और 20 गुना के बीच प्रोटीन सांद्रता का उपयोग कर रहा है उम्मीद Kd19.

BLI डेटा प्राप्ति के बाद, गलत अर्थ से बचने के लिए सावधान डेटा विश्लेषण किया जाना चाहिए। वियोजन स्थिरांक की परिकलन बाइंडिंग वक्र के उपयुक्त पर निर्भर करता है। जब तक बाध्यकारी stoichimetry पहले से ही जाना जाता है, एक शास्त्रीय 1:1 द्वि-अणुक बातचीत मॉडल प्रारंभिक फिटिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक विषम बंधन वक्र अक्सर कलाकृतियों और उच्च एनालिटिक एकाग्रता, जो एक जटिल बाध्यकारी मॉडल के रूप में गलत अर्थ लगाया जा सकता है की वजह से गैर-आदर्श व्यवहार का परिणाम है। इसलिए, analyte एकाग्रता को कम जब तक सेंसरग्राम प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करता है 1:1 बाध्यकारी stoichimetry अधिक जटिल बातचीत से विषम बाइंडिंग अंतर में मदद कर सकते हैं. इसके बाद किसी भी अवशिष्ट विषमांगी बाइंडिंग डेटा को उस प्रकार बजादिया जाता है जैसा कि चित्र 420में दर्शाया गया है।

इस रिपोर्ट में, फुआ-कोलम अन्योन्यक्रिया के लिए 2ण्28 - 0ण्74 एनएम का वियोजन स्थिरांक मापा जाता है। यह मान क्रमशः ITC या MST का उपयोग करके नैनोडिस्क या पेप्टीडिस्क के साथ हमारे समूह में निर्धारित वियोजन स्थिरांक के अनुरूप है (चित्र 4E)16. इस स्थिरता बातचीत गतिज निर्धारित करने के लिए एक साधन के रूप में peptidisc पुनर्गठन और BLI विश्लेषण के बारे में विश्वास प्रदान करता है. महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रोटीन आमतौर पर या तो बायोटिन रासायनिक पार से जोड़ने या साइट विशेष इसके माध्यम से ई. कोलाई बायोटिन लिगासे BirA21का उपयोग कर streptavidin biosensors पर स्थिर कर रहे हैं ध्यान दिया जाना चाहिए. जाहिर है, peptidisc पाड़ biotinylating, लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन के बजाय, कई फायदे हैं. Scaffold biotinylation समय बचाता है और महत्वपूर्ण प्रोटीन बाध्यकारी साइटों को बाधित करने की क्षमता को कम करता है. हमने यह भी पाया है कि PeptiQuick प्रोटीन लक्ष्य वर्गों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होता है, जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs), आयन चैनलों सहित, और जेड बैरल झिल्ली प्रोटीन. सामान्य तौर पर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक कुल मुक्त राज्य में झिल्ली प्रोटीन का प्रारंभिक डिटर्जेंट निकालने महत्वपूर्ण है, और पेप्टिक में तत्काल पुनर्गठन डाउनस्ट्रीम एकत्रीकरण समस्याओं को कम करता है। सादगी को देखते हुए, यह कल्पना की है कि PeptiQuick अन्य streptavidin आधारित बाध्यकारी परख के लिए बढ़ाया जाएगा, इस तरह की सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर), एलिसा परख के रूप में, और आत्मीयता पुल-डाउन streptavidin मोती का उपयोग कर.

Disclosures

एफडी पेप्टीडिस्क बायोटेक के संस्थापक हैं जो अकादमिक समुदाय को पेप्टिक पेप्टाइड्स वितरित करते हैं। Peptidisc बायोटेक भी औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी और फार्मा कंपनियों के साथ भागीदारी कर रहा है उनके खोज कार्यप्रवाह में peptidisc लागू करने के लिए. इस लेख के खुले प्रवेश प्रकाशन Fort$Bio द्वारा प्रायोजित किया गया था.

Acknowledgments

हम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद धन्यवाद. जे एस एक सीजीएस-एम CIHR छात्रवृत्ति रखती है. एलटी जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था वित्त पोषित दक्षिण पश्चिम जैव विज्ञान डॉक्टरेट प्रशिक्षण भागीदारी [प्रशिक्षण अनुदान संदर्भ BB/ एफडी एक टीयर द्वितीय कनाडा अनुसंधान अध्यक्ष है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 kDa cut-off centrifugal concentrator Millipore Sigma C7715 -
Ampicillin BioShop 69-52-3 Sodium Salt
Bio-Peptidisc Peptide Peptidisc Biotech https://peptidisc.com -
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 9048-46-8 Lyophilized powder
CaCl2 Fisher Chemical 10035-04-8 Certified ACS
EDTA BioShop 6381-92-6 Biotechnology Grade
Ettan LC (AKTA) Amersham Pharmacia Biotech 18-1145-58 -
Glucose BioShop 50-99-7 Anhydrous, Reagent Grade
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5 Certified ACS
Imidazole BioShop 288-32-4 Biotechnology Grade
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) Sigma 101822204 ~30% in H2O
MgSO4 Fisher Chemical 10034-99-8 Certified ACS
Microfluidizer Microfluidics M-110L Fit with F20Y 75µ diruption chamber
Ni-NTA Resin Gold Biotechnology H-320-50 -
Non-binding 96well BLI Plate Greiner Bio-one 655076 Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding
Octet Red96 FortéBio OCTET RED96E-GxP Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma P-7626 -
Protein Assay Dye - Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration
Sodium Chloride (NaCl) BioShop 7647-14-5 Biotechnology Grade
Streptavidin (SA) Biosensors ForteBio 18-5019 One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications.
Superdex S200 (300/10) Amersham Pharmacia Biotech 175175-01 -
Thiamine Merck 69271 -
Tris-HCl BioShop 77-86-1 Reagent Grade
Triton X-100 BioShop 900998-1 Biotechnology Grade
Tween-20 BioShop 56-40-6 Reagent Grade
Ultra centrifuge Beckman Coulter 365668 -

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References

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Saville, J. W., Troman, L. A., Duong … More

Saville, J. W., Troman, L. A., Duong Van Hoa, F. PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays. J. Vis. Exp. (153), e60661, doi:10.3791/60661 (2019).

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