Summary
Vi præsenterer en metode, der kombinerer membran protein rensning og rekonstitution i peptidiscs i et enkelt kromatografisk trin. Biotinylerede stilladser anvendes til direkte overflade fastgørelse og måling af protein-ligand interaktioner via biolayer interferometri.
Abstract
Membran proteiner, herunder transportører, kanaler og receptorer, udgør næsten en fjerdedel af cellulær proteom og over halvdelen af de nuværende narkotika-mål. Men en væsentlig barriere for deres karakterisering og udnyttelse i akademiske eller industrielle miljøer er, at de fleste biokemiske, biofysiske, og Drug screening strategier kræver disse proteiner til at være i en vandopløselig tilstand. Vores laboratorium for nylig udviklet peptidisc, en membran mimetiske tilbyder en "one-size-passer-all" tilgang til problemet med membran protein opløselighed. Vi præsenterer her en strømlinet protokol, der kombinerer protein rensning og peptidisc rekonstitution i et enkelt kromatografisk trin. Denne arbejdsgang, kaldet PeptiQuick, gør det muligt at omgå dialyse og inkubation med polystyren perler, hvilket i høj grad reducere eksponeringen for vaskemiddel, proteindenaturering, og prøve tab. Når PeptiQuick udføres med biotinylerede stilladser, kan præparatet fastgøres direkte til streptavidin-belagte overflader. Det er ikke nødvendigt at biotinylere eller ændre membran protein målet. PeptiQuick er fremvist her med membranen receptor FhuA og antimikrobiel ligand colicin M, ved hjælp af biolayer interferometri til at bestemme den præcise kinetik af deres interaktion. Det konk øres, at PeptiQuick er en bekvem måde at forberede og analysere membran protein-ligand interaktioner inden for en dag i et vaskemiddel frit miljø.
Introduction
Membran proteiner er ofte udelukket fra Drug eller antistof opdagelse forskningsprogrammer på grund af tilbøjeligheden af membran proteiner til at aggregere uden for lipidbilayer miljø, især i nærværelse af vaskemidler1. Derfor er der i de seneste år blevet udviklet flere membran mimetika (såkaldte stilladser) for at lette isolation og forhør af membran proteiner i et helt rengørings frit miljø (dvs. nanodiske, SMALPs, amphipols osv.) 2,3,4,5,6. Imidlertid kræver rekonstitution af membran proteiner i disse mimetika ofte omfattende optimering, hvilket er tidskrævende og generelt ledsaget af tab af protein opsving7,8. For at overvinde disse begrænsninger, har vores laboratorium for nylig udviklet en "one-size-passer-all" formulering kendt som peptidisc9. Peptidiscen dannes, når flere eksemplarer af en designer 4,5 kDa mole bihelical peptid binder sig til den hydrofobiske overflade af et målmembran protein. Stabil rekonstitution i peptidisc opstår ved fjernelse af vaskemiddel, idet både endogene lipider og solubilized membran proteiner kommer i vandopløselige partikler. Disse stabiliserede partikler er nu modtagelig for talrige downstream applikationer.
Peptidisc-metoden giver flere fordele; for eksempel er rekonstitution ligetil, da binding af peptidisc-stilladset på målet styres af selve protein skabelonen9,10. Peptidstøkiometri er også selv bestemt, og tilsætning af eksogene lipider er ikke nødvendig. Peptidisc dannelse sker ved simpel opløsning af vaskemiddel, en vigtig fordel i forhold til dialyse eller adsorptions på polystyren perler, som ofte resulterer i lavt proteinudbytte på grund af ikke-specifik overflade forening og sammenlægning11,12 ,13. Det endelige peptidisc-modul er meget termo stabilt og uvægerligt opløseligt i forskellige buffere eller i tilstedeværelse af Divalente kationer (f. eks. ni2 +). Den renhed og strukturelle homogenitet af stilladset er også høj (f. eks, endotoxin-fri), og peptid kan tilpasses med funktionelle grupper placeret på forskellige positioner.
Vi præsenterer her et laboratorium workflow kaldet PeptiQuick, også kendt som on-perler rekonstitution9. Denne protokol kombinerer membran protein rensning og peptidisc rekonstitution i et enkelt trin og på samme kromatografiske støtte. Som navnet antyder, PeptiQuick er hurtig sammenlignet med andre rekonstitutionsmetoder, og det også alvorligt reducerer eksponering tid til vaskemiddel. Negative vaskemiddel effekter såsom protein udfoldning og aggregering forekommer ofte på en tidsafhængig måde; Derfor er det afgørende at minimere eksponeringen for rengøringsmidler for at opretholde den oprindelige protein konstellation14,15. Dette er afgørende for nøjagtigheden af metoder, der rapporterer om protein interaktioner og ligand bindende tilhørsforhold.
Under udviklingen af denne protokol præsenterer vi den nye biotinylerede version af peptidisc-stilladset, kaldet bio-Peptidisc. Biotin funktionelle grupper tillader fastgørelse af målet membran protein på streptavidin-belagte overflader. Da biotin mærkning er begrænset til stilladset, forbliver bindingssteder på målet membran protein uændret. Ved hjælp af bio-Peptidisc bestemmes den bakterielle membran receptor FhuA ' og antimikrobielle peptidcolicin M (ColM) bindings kinetik16. Denne affinitet måles via biolayer interferometri (bli), som analyserer interaktioner i realtid baseret på hvide lys interferens mønstre reflekteres fra en sensor spids.
Ved at bruge denne protokol elimineres behovet for vaskemiddel under BLI-analyse, hvilket er en vigtig udvikling, da rengøringsmidler kan forstyrre interaktioner. Bindende tilhørsforhold kan måles hurtigt med denne metode, og resultaterne er sammenlignelige med dem, der er rapporteret tidligere ved hjælp af nanoskiver og isotermisk titrering hele kroppen vha (ITC)16. De kritiske trin i PeptiQuick-arbejdsprocessen vises og diskuteres, såsom protein præparat, fortynding af vaskemiddel, peptid addition og rekonstitution sammen med tip til fejlfinding af ligand og analysand binding i BLI-analysen. Ved hjælp af PeptiQuick arbejdsgang, det er konstateret, at membran proteiner kan fanges i peptidiscs og deres interaktioner måles inden for en dag.
Protocol
1. klargøring og solubilisering af membran receptor FhuA
- Udtryk hans6-mærkede fhua i Escherichia coli Strain AW740. Vokse celler for 18 h ved 37 °C i M9 medier (tabel 1). Se Mills et al.16 for en detaljeret udtryks protokol.
- Høst cellerne ved centrifugering (5.000 x g, 10 min, 4 °c) og resuspension af dem i 50 ml af Tris-salt-GLYCEROL (TSG) buffer (tabel 1). Dounce de resuspenderede celler og tilsæt phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) til en endelig koncentration på 1 mM lige før lysis.
Forsigtig: PMSF er giftigt og ætsende. - Lysere cellerne ved hjælp af en microfluidizer (tre passager) på 15.000 PSI eller en fransk presse (tre passager) på 8.000 PSI. Pellet de ulyserede celler og andet uopløseligt materiale ved lav-hastighed centrifugering (5.000 x g, 10 min, 4 °c).
- Ultracentrifuge supernatanten (200.000 x g, 40 min, 4 °c) for at isolere den rå membran fraktion. Supernatanten kasseres, opslæmmes membran pellet i et minimum af TSG-buffer og dounce med et glas-eller metal-douncer-apparat for at sikre ensartethed.
- Udfør en Bradford-analyse for at kontrollere proteinkoncentrationen af den opslæmmede rå membran. Den rå membran fortyndes til en endelig koncentration på 3 mg/mL ved brug af TSG buffer før solubilisering.
- Tilsæt vaskemiddel Triton X-100 til en endelig koncentration på 1% (v/v) for selektivt at opløse den bakterielle indre membran i 1 time ved 4 °C med blid Rocking. Pellet det uopløselige materiale (ydre membran fraktion) ved ultracentrifugering (200.000 x g, 40 min, 4 °c).
- Supernatanten, som indeholder den opløseligede membran, skal kasseres, og pellet i GTS bør resuspenderes til en endelig koncentration på 3 mg/mL. Der tilsættes lauryldimethylaminoxid (LDAO) til en koncentration på 1% (v/v) til den opslæmmede ydre membran fraktion og solubilize i 1 time ved 4 °C med blid Rocking.
- Udfør et afsluttende Centrifugerings trin for at pille alt uopløseligt materiale (200.000 x g, 40 min, 4 °c).
Bemærk: den resulterende supernatanten indeholder de solubilized ydre membran proteiner, herunder målet hans-mærkede FhuA.
2. rensning og rekonstitution af FhuA ved hjælp af PeptiQuick workflow
- Præ-ækvibrere en færdigpakket ni-NTA kolonne (5 mL harpiks volumen) med to kolonne volumener af immobiliseret metalaffinitets kromatografi (IMAC) vaskebuffer (tabel 1).
- Den solubiliserede ydre membran fortyndes fra 1% LDAO til 0,04% LDAO ved hjælp af TSG. Derefter tilsættes imidazol til en endelig koncentration på 5 mM.
Forsigtig: imidazol er giftigt og ætsende. - Læg de solubiliserede ydre membran proteiner på ni-NTA harpiks og saml flowthrough. Genindlæs strømning på harpiksen for at øge harpiks bindingen af fhua og indsamle den sekundære flow gennem.
Bemærk: Opbevar en 20 μL alikvot opløst materiale som reference for senere analyse af natriumdodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE). - Harpiks vaskes med 250 mL IMAC-vaskebuffer, og den første 50 mL eluat opsamles. Dræn vaskebufferen til højden af harpiks sengen, og luk stophanen på søjlen.
- Tilsæt 1 mL koncentreret 10 mg/mL bio-Peptidisc peptidopløsning (tabel 1) til søjlen. Der tilsættes 50 mL fortyndet 1 mg/mL bio-Peptidisc peptidopløsning i TSG, og harpiksen omrøres med en glas stang for at resuspendere perlerne i TSG.
- Efter peptidisc-diffusering, lad harpiksen bosætte sig og dræne den overskydende 1 mg/mL bio-Peptidisc opløsning gennem harpiksen.
- Ni-NTA-vedlagte peptidisc-partikler vaskes med 50 mL TSG. Peptidisc partiklerne eluers med 15 mL IMAC-elueringsbuffer (tabel 1) indeholdende 600 mm imidazol i TSG. Saml 1 mL fraktioner og tilsæt straks 10 μL 0,5 M EDTA til Chelat udvasket nikkel ioner.
Forsigtig: EDTA er et irritationsmoment.
3. vurdering af PeptiQuick rekonstitution
- SDS-Sideanalyse
- Indlæs 10 μl aliquoter af start materialet, flyde gennem, vask (er), og elueret fraktioner fra peptiquick rekonstitution på en 12% SDS-Denaturerings gel og elektrophorese i 30 min ved en konstant strøm på 60 ma.
- Plette gelen med Coomassie blåt farvestof, deplette gelen, og Visualiser på en scanner.
- Kromatografi af størrelses udelukkelse (SEC)
- Baseret på den 12% SDS-Sideanalyse af PeptiQuick rekonstitution, isolere og samle de relevante fraktioner, og koncentrere dem ved hjælp af en 30 kDa cut-off centrifugal koncentrator.
Bemærk: i den medfølgende video samles fraktioner F3 – F7 sammen og koncentreres under 1 mL (injektions loop-volumen på SEC-instrumentet). - Injicer ~ 1 mL af de poolede IMAC-elueringsfraktioner på en gel-filtrerings s200 (300/10) kolonne med en strømningshastighed på 0,25 mL/min i TSG-buffer. Saml 1 mL fraktioner og køre dem på en 12% SDS gel til at bestemme, hvilke SEC fraktioner til at samle og koncentrere.
Bemærk: de eluerede PeptiQuick fraktioner kan samles uden koncentration, og en alikvot kan injiceres på SEC for at kontrollere kvaliteten af rekonstitutionen. Dette er en vigtig kontrol for membran proteiner, der er potentielt følsomme over for sammenlægning under centrifugal koncentration.
- Baseret på den 12% SDS-Sideanalyse af PeptiQuick rekonstitution, isolere og samle de relevante fraktioner, og koncentrere dem ved hjælp af en 30 kDa cut-off centrifugal koncentrator.
4. biolayer interferometri
- Opsætning af BLI Experimental
- Sæt 96 brønd pladen i hånden.
Bemærk: alle brønde fyldes til et endeligt volumen på 200 μL. - I kolonne 1, række A − E, indlæses 200 μL kinetik buffer for at give spidserne mulighed for at ækvibrere og danne et udgangssignal.
- Ligand (FhuA i Bio-Peptidisc) fortyndes til en koncentration på 2,5 μg/mL i kinetik bufferen (tabel 1). Indlæs 200 μL af denne fortynding i række A − D i kolonne 2.
- Tilsæt kun 200 μL kinetik buffer til E2 (reference sensoren).
- Tilsæt 200 μL kinetik buffer til kolonne 3, rækker A − E for at vaske overskydende FhuA fra spidsen.
- I kolonne 4, udføre to-fold serielle fortyndinger af analysand (ColM) ned pladen fra A4 til d4. Start med 28 nM (8 * KD) i A4 til 3,5 nM (1 * KD) i d4.
- Tilsæt 28 nM ColM til E4 for at måle for ikke-specifik binding (den højeste anvendte ColM-koncentration).
- Der tilsættes 200 μL kinetik buffer til kolonne 5, rækker A − E.
Bemærk: her vil ColM adskille sig fra spidsen, og dissociationen måles. - Anbring opsætnings pladen i BLI-instrumentet.
- Placer sensor spids bakken i BLI-instrumentet.
- Åbn BLI data Acquisition-softwaren, og vælg nyt Kinetics-eksperiment på software guiden.
- Brug fanen plade definition til at indtaste layoutet af 96 Well Plate i softwaren.
Bemærk: brøndene, der indeholder ligand, FhuA er indtastet som "belastning". Brønde, der kun indeholder buffer, indlæses som "buffer". Brønde, der indeholder analysand, ColM, indpodes som "prøven". - Brug fanen analyse definition til at definere længden af tid og pladens rotationshastighed for hvert trin i eksperimentet.
Bemærk: de eksperimentelle trin er sat op som: 1) baseline: 60 s; 2) lastning: 250 s; 3) Oprindelig plan2:300 s; 4) Association: 450 s; og 5) dissociation: 900 s. Lad ryste hastigheden som standard (1.000 rpm). Ovenstående trin er individuelt tildelt hver kolonne i 96 brønd pladen ved at vælge det ønskede trin og højreklikke på Tilføj analyse trin på hver kolonne. - Tildel det første trin ved at højreklikke på den første kolonne og vælge Start ny analyse. Sørg for, at det oprindelige trin er korrekt tildelt ved hjælp af det nederste højre vindue, og Skift til rullemenuen efter behov.
- Tildel de efterfølgende trin til hver kolonne ved at højreklikke langs pladen og vælge Tilføj analyse trin. Tildel disse til den relevante kolonne, som angivet i trin 4.1.13.
- Brug fanen sensor tildeling til at sikre, at oktet instrumentet tager BLI Pins fra den korrekte placering i sensor bakken.
Bemærk: under fanen sensor tildeling er det kun a1 − E1, der skal fremhæves blåt. Sørg for, at der er en sensor spids til stede på disse steder i sensor bakken, og sørg for, at F1 − H1 er tom. - Fremhæv F1 − H1 på skærmen, højreklik, og vælg Fjern for at markere disse som tomme. Sæt kryds i Udskift sensorer i bakken efter brug for at beholde de brugte sensorer.
- Under fanen Gennemse eksperiment, som giver et endeligt overblik over eksperimentet før udførelse, skal du gennemgå de eksperimentelle trin for at sikre, at hele opsætningen er korrekt.
- Under fanen Kør eksperiment skal du vælge en filplacering for at gemme metode filerne.
- Skift pladens temperatur til rumtemperaturen.
- Vælg gå for at køre eksperimentet.
- Sæt 96 brønd pladen i hånden.
- Analyse af BLI-data
- Åbn Octet BLI data analysis-softwaren.
- Brug fanen datavalg til at finde eksperimentet og til at kontrollere den eksperimentelle oversigt. Importer projektfilen fra den placering, der er defineret i trin 4.1.19.
- Input koncentrationerne af analysand (her, ColM) ved at vælge sensoroplysninger for hvert eksperiment.
- Tildel spidsen i E1 som reference spids.
- Brug fanen behandling til at trække reference signalet (E1) fra forsøgsdataene. Kontroller de rå data fra reference spidsen for uspecifik analysand binding. Hvis der ikke observeres nogen, Fortsæt.
Bemærk: Dette er en vigtig negativ kontrol. Hvis der observeres ikke-specifik binding, bogføres dette i trin 4.2.7. - Juster y-aksen til det andet grundlinje trin. Undlad at sætte kryds i interstep-forbindelsen. Vælg Savitzky-Golay-filtrering. Vælg Behandl data!.
- Under fanen analyse skal du vælge de eksperimentelle data i tabellen underplottet for at se tilknytnings-og dissociations kurverne med signalet fra reference sensoren trukket fra.
- Vælg 1:1-bindings modellen, og vælg en delvis kurvetilpasning. Vælg Tilpas kurver!.
- Analysér rest visnings plottet for at kontrollere kurvetilpasningen.
- Rul gennem tabellen for at se den beregnede Kd.
- Vælg Gem rapport... for at gemme et regnearksdokument med detaljer om opsætningen, afbildet for de rå og analyserede data og de beregnede dissociations konstanter.
Representative Results
Membran receptoren FhuA udtrykkes i et laboratorium E. coli stamme. Den ydre membran fraktion høstes ved centrifugering, og proteiner er solubilized ved hjælp af en to-trins vaskemiddel ekstraktion. De solubilized membran proteiner er lastet på ni-NTA agaded perler pakket i en plastik kolonne, efterfulgt af PeptiQuick arbejdsgang som præsenteret i protokollen. Efter en kvalitetskontrol ved hjælp af størrelses ekskluderende kromatografi, er bio-Peptidisc partiklerne immobiliseret på streptavidin-belagte stifter. BLI-analysen udføres for at måle kinetikken af samspillet mellem FhuA og ColM. Skematisk oversigt over dette eksperiment er præsenteret i figur 1.
En SDS gel køres for at bestemme kvaliteten af rekonstitution efter eluering af FhuA bio-Peptidisc partikler fra IMAC-søjlen (figur 2). Aliquoter af de fraktioner, der svarer til start, flyde gennem, skyller og elueringsfraktioner, indlæses på SDS-gel for at evaluere PeptiQuick-metodens succes. Nedbrydningen af fhua i strømning-fraktionen er korreleret med en berigelse i elueringsfraktioner, hvilket indikerer, at oprensningen af proteinet har været effektiv. Der observeres mindre kontaminerende protein bånd i de eluede fraktioner. SDS gel-analysen anvendes til at bestemme, hvilke fraktioner der skal samles før SEC-analysen. En naturlig gel af de elueret fhua bio-peptidisc partikler er også kørt for at bekræfte fhua opløselighed (supplerende figur 1). Migrering af det rekonstituerede protein til den oprindelige gel indikerer proteinopløselighed i et vaskemiddel frit miljø.
SEC-analysen udføres for at vurdere opløseligheden af peptidisc partiklerne. Det kromatogram, der præsenteres i figur 3a , viser en enkelt, symmetrisk topeluering på ca. 14 ml (6 ml ved den ugyldige volumen på 8,0 ml på gelen s200 10/300 kolonnen). Positionen af denne top, forbi tomrum volumen, bekræfter opløseligheden af FhuA bio-Peptidisc partikler. For reference illustrerer figur 3b et teoretisk suboptimalt peptidisc præparat. I dette tilfælde viser kromatogrammet et større protein toppunkt eluering ved det tomme volumen, hvilket indikerer tilstedeværelsen af protein aggregater. Den mindre spids eluering lige forbi de vigtigste peptidisc peak svarer til overskydende peptidisc peptider.
Interaktionen mellem FhuA og analysand ColM bestemmes efter fastgørelse af peptiskiverne til streptavidin-coatede sensorer. Sensor spidserne er først ligevægt i kinetik bufferen og overføres derefter til buffer, der indeholder FhuA-bio-Peptidiskene. Koncentrationen af FhuA-bio-Peptiskiver og den tid, de inkuberes med spidsen, optimeres forud for dette eksperiment (supplerende figur 1). Efter indlæsnings-og vaske trinene måler tilknytnings trinnet samspillet mellem de indlæste spidser og fire forskellige koncentrationer af colicin M. Den efterfølgende bevægelse af spidserne tilbage i buffer resulterer i dissociation, som måles ved bølgelængde skift af hvidt lys afspejler spidsen.
Figur 4a viser den rå data sensorgram output fra dette eksperiment. Alle spor vises ens i belastningen og de oprindelige trin, bortset fra referencesporet i gult. Reference spidsen har ingen ligand indlæst, men er udsat for analysand til assay for uspecifik binding, hvilket er en vigtig negativ kontrol. For en mere detaljeret analyse af resultaterne trækkes signalet fra reference spidsen fra sporene for de eksperimentelle spidser, så der tages højde for uspecifik binding. Dataene er justeret til starten af tilknytnings trinnet for at tillade en direkte visuel sammenligning, som vist i figur 4b. Denne sammenligning viser en stigning i bølgelængde Skift for stigende koncentrationer af colicin M. Kurven er egnet til data og udviser en klassisk 1:1 bindende model.
Det resterende observations plot (figur 4b, bund), som beskriver forskellene mellem monterings-og forsøgsdata, viser, at tilpasningen til den højeste koncentration af ColM (28 nm) er dårlig sammenlignet med de tre nedre koncentrationer. Profilen af selve kurven mangler bindende kurve plateau, som er karakteristisk for binding site mætning i en typisk bindende eksperiment. Manglen på plateau antyder heterogene binding, hvilket sandsynligvis er en artefakt af den høje ColM koncentration. Denne højeste ColM-koncentration diskonteres derfor fra analysen, og de tre andre koncentrationer anvendes til at bestemme dissociations konstanten (figur 4C, D). En to-sidet elevs t-test, på et 95% konfidensniveau, viste, at den observerede dissociationskonstant fra dette eksperiment ikke afviger væsentligt fra de værdier, der opnås ved hjælp af forskellige teknikker (figur 4e)16.
Figur 1: Oversigt for PeptiQuick-arbejdsprocessen ved hjælp af bio-Peptidiske og bli-analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: SDS gel-analyse (12%) af start-, flow-, vaske-og elueringsfraktioner indsamlet gennem PeptiQuick-arbejdsprocessen. Ca. 10 μl af prøven blev indlæst i hver vognbane og kørt i 30 minutter ved en konstant strøm på 60 ma. Gelen blev plettet med Coomassie blå, deplettet og visualiseret på en gel scanner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksperimentelle og teoretiske SEC profiler, der repræsenterer henholdsvis optimale og suboptimale reforfatninger. A) eksperimentel profil af PeptiQuick rekonstitueret fhua (~ 82 kDa) i Bio-Peptidiske. IMAC-elueringsfraktioner F3 − F7 blev samlet og koncentreret ved hjælp af en 30 kDa cut-off centrifugal koncentrator til ~ 1 mL. Denne koncentrerede prøve blev injiceret ved 0,25 mL/min på en gel filtration s200 (10/300) kolonne i TSG buffer. (B) teoretisk profil af en suboptimal PeptiQuick rekonstitution. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: undersøgelse af ColM interaktioner med FhuA rekonstitueret i Bio-Peptidiske. (A) rå data sensorgram med reference sensor spor i gult. (B, C) Top: sammenslutning og dissociation trin med partiel 1:1 binding kurve montering. Nederst: residualvisninger, som skildrer forskellen mellem eksperimentelle data og beregningsmæssige fitting. C) replotting af (B) med udelukkelse af den højeste koncentration af ColM. D) observerede tilknytnings-og dissociations rater (henholdsvisk og kfra) og dissociations konstanter (kD). E) sammenligning af fhua-ColM-dissociations konstanter opnået ved PEPTIDISC og bli (i dette eksperiment), peptidisc-og mikroskala-thermophorese (Saville, ikke-offentliggjorte data) og nanodisc-og isotermisk titrerings kalorimetri16. Fejllinjer repræsenterer et SD af usikkerhed, mens n.s. ikke betegner nogen signifikant forskel på 95% konfidensniveau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| M9-medier (pr. liter) |
| 200 mL M9 salt |
| 800 mL dH2O |
| 10 mL 40% glucose |
| 80 μL 1 M CaCl2 |
| 2,5 mL 1 M MgSO4 |
| 300 μL 15 mg/mL thiamin |
| TSG buffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glycerol |
| IMAC-vaske buffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glycerol |
| 0,04% LDAO |
| 5 mM imidazol |
| Bio-Peptidisc opløsning |
| Den klar-til-brug-bio-Peptidisc (> 95% renhed) opløses i steril dH2O. Koncentrationen og volumenet af peptidopløsningen afhænger af trinnet i rekonstituationsprocessen. |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| Bemærk: dette Bio-Peptidisc peptidlager er stabilt ved 4 °C i over en måned. |
| IMAC-Elueringsbuffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glycerol |
| 600 mM imidazol |
| Kinetik buffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 0,002% Tween-20 |
| 0,1% BSA |
Tabel 1: opskrifter til udarbejdelse af medier og løsninger.
Supplerende figur 1:4% – 16% klar Native gel analyse af elueringsfraktioner indsamlet fra PeptiQuick arbejdsgang. Ca. 10 μL af prøven blev indlæst i hver vognbane og kørt for 40 min ved en konstant strøm på 30 mA. Gelen blev plettet med Coomassie blå, deplettet, og visualiseret på en scanner. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: ligand koncentration optimering ved hjælp af en enkelt pin. A) de seks forskellige koncentrationer af fhua i Bio-Peptidisc, der er testet for binding til en enkelt streptavidin-belagt stift. Dette blev sat op i en 96 brønd plade med buffer i brøndene mellem ligand koncentrationer (Se supplerende fil 1 for setup Protocol). (B) rå data sensorgram for ligand optimering eksperiment. Stiften giver det største respons og når desuden mætning ved koncentrations nummer 4 (eller 2,5 μg/mL). Venligst klik her for at downloade dette tal.
Supplerende fil 1. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Discussion
Mens vaskemidler forbliver den enkleste metode til at udtrække og rense membran proteiner, kan disse overfladeaktive stoffer have mange uønskede virkninger på protein stabilitet, funktion og downstream-analyser1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Disse vanskeligheder har motiveret udviklingen af membran mimetika, som stræber efter at minimere tilstedeværelsen af rengøringsmidler og replikerer det oprindelige membran miljø så meget som muligt2,3,4 ,5,6. Størstedelen af rekonstitutionsmetoderne kræver dog en betydelig optimering af rekonstitutionsforholdene og kræver ofte yderligere rensningstrin, hvilket mindsker det endelige udbytte på7,8. Peptidisc spontant tilpasser sig målet membran protein og forholdsvis, kræver lidt optimering og downstream rensning9,10. I denne protokol præsenteres PeptiQuick som et simpelt middel til at strømline rekonstitutionsprotokollen til downstream-protein-protein interaktions analyse.
Selv om det er ligetil, er der flere eksperimentelle advarsler, der kan føre til mislykket rekonstitution. Blandt disse, den mest almindeligt skyldes protein aggregering. Det er derfor afgørende at udføre størrelses ekskluderings kromatografi for at overvåge rekonstituationsprocessen. For eksempel er en størrelses udelukkelse peak eluering ved Void volumen indikerer protein aggregater (figur 3b)17,18. Membran protein aggregater dannes typisk ved længerevarende udsættelse for suboptimale vaskemiddel forhold før rekonstitution. Det er især blevet konstateret, at membran proteiner i vaskemiddel har tendens til at danne aggregater, når de er koncentreret ved ultrafiltrering på centrifugal anordninger. I dette tilfælde kan følsomme membran proteiner koncentreres ved hjælp af vakuum ultra-filtrering, en blidere og mere homogen koncentrations metode, da adsorptions af proteiner til filteret er formindsket.
For at undgå proteinkoncentration bør de eluerede IMAC-fraktioner generelt samles, og en alikvot injiceres på en kolonne med størrelses udelukkelse for at kontrollere dens rekonstitutionskvalitet. Det skal bemærkes, at uindarbejdet gratis peptid elutter lige efter den vigtigste peptidisc Peak (figur 3b). Det frie stilladser hindrer ikke nødvendigvis downstream-eksperimenter. Men hvis det er nødvendigt, kan dette overskydende fjernes ved størrelses udelukkelse kromatografi. Alternativt, øge vaske volumen under rekonstitution, og før eluering fra IMAC harpiks, er nok til effektivt at fjerne det meste af det frie peptidisc peptid. Derfor anbefales størrelses udelukkelse kromatografi som en hurtig og enkel måde at kontrollere rekonstitution kvalitet.
BLI-eksperimentet kræver omhyggelig optimering af både ligand-og analysand-koncentrationer. Ligand binding skal være tilstrækkelig til at opnå et klart signal, men overbelastning vil forårsage signal mætning, hvilket resulterer i data artefakter fra overbelægning og sterisk hindring på spidsen overfladen. Derfor skal både koncentrationen af ligand og længden af tid spidsen tilbringer i ligand opløsningen optimeres for hver protein prøve (supplerende figur 2). Analysand koncentrationen skal også optimeres. Hvis dissociations konstanten er kendt, bliver dette trin lettere, da koncentrationsintervallet kan tilnæres. Et godt udgangspunkt for denne analyse er at bruge proteinkoncentrationer mellem 0,1 og 20 gange den forventede Kd19.
Efter BLI data Acquisition skal der foretages omhyggelig dataanalyse for at undgå fejlfortolkninger. Beregningen af dissociations konstanten afhænger af en bindings kurves pasform. Medmindre bindende støkiometri allerede er kendt, en klassisk 1:1 interaktion interaktions model bør anvendes til den indledende montering. Det skal bemærkes, at en heterogen bindings kurve ofte er resultatet af artefakter og ikke-ideal adfærd forårsaget af høj analysand koncentration, som kan misfortolkes som en kompleks bindings model. Derfor, sænke analysand koncentrationen indtil sensorgram profil viser 1:1 binding støkiometri kan hjælpe med at skelne heterogene binding fra mere komplekse interaktioner. Eventuelle resterende heterogene bindings data diskonteres derefter som vist i figur 420.
I denne rapport måles en dissociationskonstant på 2,28 ± 0,74 nM for FhuA-ColM-interaktionen. Denne værdi er i overensstemmelse med den dissociationskonstant, der tidligere blev fastlagt i vores gruppe med nanodisc eller peptidisc med henholdsvis ITC eller MST (figur 4E)16. Denne konsistens giver tillid til peptidisc rekonstitution og BLI analyse som et middel til at bestemme interaktions kinetik. Det er vigtigt at bemærke, at proteiner normalt er immobiliseret på streptavidin biosensorer enten gennem biotin kemisk Cross-Linking eller site-specifikke tilsætning ved hjælp af E. coli biotin Ubiquitinligase BirA21. Åbenbart, biotinylating peptidisc stilladset, i stedet for målet membran protein, har mange fordele. Stillads biotinylering sparer tid og minimerer potentialet til at forstyrre vigtige protein bindingssteder. Vi har også konstateret, at PeptiQuick er gældende for en bred vifte af protein Target klasser, herunder G-protein-koblede receptorer (GPCRs), Ion-kanaler, og β-Tønder membran proteiner. Generelt skal det bemærkes, at det oprindelige vaskemiddel ekstrakt af membran proteiner i en aggregat-fri tilstand er kritisk, og at umiddelbar rekonstitution i peptidisc nedsætter downstream-Akkumulerings problemer. I betragtning af den enkelhed, det er forestillede, at PeptiQuick vil blive udvidet til andre streptavidin-baserede bindende assays, såsom overflade Plasmon resonans (SPR), ELISA assays, og affinitet pull-Downs ved hjælp af streptavidin perler.
Disclosures
FD er grundlægger af Peptidisc Biotech til at distribuere peptidisc peptider til det akademiske samfund. Peptidisc Biotech er også partner med industrielle Biotech og Pharma virksomheder til at implementere peptidisc i deres opdagelse arbejdsgange. Åben adgang offentliggørelse af denne artikel blev sponsoreret af FortéBio.
Acknowledgments
Vi takker Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. JS besidder en CGS-M CIHR stipendium. LT blev støttet af Forskningsrådet for bioteknologi og biologisk videnskab, finansieret South West Biosciences ph. d.-UDDANNELSESPARTNERSKAB [uddannelse Grant reference BB/M009122/1]. FD er en tier II Canada-forsknings stol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | - |
| Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
| Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
| CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
| EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
| Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | - |
| Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
| Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
| Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
| MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
| Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
| Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | - |
| Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
| Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | - |
| Protein Assay Dye - Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration |
| Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
| Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
| Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | - |
| Thiamine | Merck | 69271 | - |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
| Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
| Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
| Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | - |
References
- Rawlings, A. E. Membrane proteins: always an insoluble problem. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).
- Popot, J. L. Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions. Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).
- Lee, S. C., et al. A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment. Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).
- Frauenfeld, J., et al. A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins. Nature Methods. 13, 345-351 (2016).
- Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs. Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins. Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).
- Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins. Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).
- Carlson, M. L., et al. The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution. eLife. 7, 34085 (2018).
- Carlson, M. L., et al. Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries. eLife. 8, 46615 (2019).
- Serdakowski, A., et al. A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal. International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).
- Smith, S. M. Strategies for the Purification of Membrane Proteins. Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).
- Lin, S. H., Guidotti, G.
- Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics. Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).
- Montigny, C., et al. Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics. PLoS ONE. 12 (1), 0170481 (2017).
- Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).
- FortéBio. Octet System Data Acquisition User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2014/01/Data-Acquisition-Octet.pdf (2014).
- FortéBio. Octet System Data Analysis User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Data-Analysis-Octet.pdf (2011).
- Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Research. 8, 135 (2019).
