Summary
Vi presenterer en metode som kombinerer membran protein rensing og rekonstituering til peptidiscs i ett enkelt kromatografiske trinn. Biotinylated stillaser brukes for direkte overflatefeste og måling av protein-ligand interaksjoner via biolayer laboratoriefasiliteter.
Abstract
Membran proteiner, inkludert transportører, kanaler og reseptorer, utgjør nesten en fjerdedel av mobil proteom og over halvparten av dagens narkotika mål. Likevel, en stor barriere for deres karakterisering og utnyttelse i akademiske eller industrielle innstillinger er at de fleste biokjemiske, Biofysiske, og narkotika screening strategier krever disse proteinene å være i en vannløselig tilstand. Vårt laboratorium nylig utviklet peptidisc, en membran mimetisk som tilbyr en "en størrelse passer alle" tilnærming til problemet med membran protein løselighet. Vi presenterer her en strømlinjeformet protokoll som kombinerer protein rensing og peptidisc rekonstituering i ett enkelt kromatografiske trinn. Denne arbeidsflyten, kalt PeptiQuick, gjør det mulig for omgåelsen dialyse og inkubasjons med polystyren perler, og dermed sterkt redusere eksponering for vaskemiddel, protein denaturering, og prøve tap. Når PeptiQuick utføres med biotinylated stillaser, kan preparatet festes direkte til streptavidin-belagte overflater. Det er ikke nødvendig å biotinylate eller modifisere membran protein målet. PeptiQuick er utstillingsmonter her med membranen reseptoren FhuA og antimikrobielle ligand colicin M, ved hjelp av biolayer laboratoriefasiliteter å bestemme den presise Kinetics av deres interaksjon. Det er konkludert med at PeptiQuick er en praktisk måte å forberede og analysere membran protein-ligand interaksjoner i løpet av en dag i et vaskemiddel-fritt miljø.
Introduction
Membran proteiner er ofte ekskludert fra narkotika eller antistoff oppdagelse forskningsprogrammer på grunn av tilbøyelighet av membran proteiner å samle utenfor lipid bilayer miljø, spesielt i nærvær av vaskemidler1. Derfor, i de senere årene, flere membran mimetics (betegnet stillaser) har blitt utviklet for å lette isolasjon og avhør av membran proteiner i et helt vaskemiddel-fritt miljø (dvs. nanodiscs, SMALPs, amphipols, etc.) 2,3,4,5,6. Imidlertid krever rekonstituering av membran proteiner i disse mimetics ofte omfattende optimalisering, som er tidkrevende og generelt ledsaget med tap av protein utvinning7,8. For å overvinne disse begrensningene, vårt laboratorium nylig utviklet en "en-størrelse passer alle" formulering kjent som peptidisc9. Peptidisc dannes når flere eksemplarer av en designer 4,5 kDa amfipatiske bihelical peptid binde til den hydrofobe overflaten av et mål membran protein. Stabil rekonstituering i peptidisc oppstår ved fjerning av vaskemiddel, entrapping både endogene lipider og solubilized membran proteiner i vannløselige partikler. Disse stabilisert partiklene er nå mottagelig for mange nedstrøms applikasjoner.
Den peptidisc metoden tilbyr flere fordeler; for eksempel er rekonstituering enkelt, siden bindingen til det peptidisc stillaset på målet styres av protein malen9,10. Den peptid støkiometri er også selv-bestemt, og tillegg av eksogene lipider er ikke nødvendig. Peptidisc formasjon oppstår ved enkel vaskemiddel fortynning, en viktig fordel over dialyse eller absorpsjon på polystyren perler, som ofte resulterer i lav protein yield på grunn av ikke-spesifikk overflate forening og aggregering11,12 ,13. Den siste peptidisc forsamlingen er svært thermostable og alltid løselig i forskjellige buffere eller i nærvær av divalent (f. eks, ni2 +). Den renhet og strukturelle homogenitet av stillaset er også høy (f. eks endotoksin-Free), og peptid kan tilpasses med funksjonelle grupper plassert på ulike posisjoner.
Vi presenterer her et laboratorium arbeidsflyt kalt PeptiQuick, også kjent som på-perler rekonstituering9. Denne protokollen kombinerer membran protein rensing og peptidisc rekonstituering til ett enkelt trinn og på samme kromatografiske støtte. Som navnet indikerer, er PeptiQuick rask sammenlignet med andre rekonstituering metoder, og det også alvorlig reduserer eksponeringstid til vaskemiddel. Bivirkninger av negative rengjøringsmidler som protein utfolder seg og aggregering forekommer ofte på en tid avhengig måte; Derfor er minimering av vaskemiddel eksponering avgjørende for å opprettholde opprinnelig protein konformasjon14,15. Dette er avgjørende for nøyaktigheten av metodene som rapporterer om protein interaksjoner og ligand bindende slektskap.
Mens du utvikler denne protokollen, presenterer vi romanen biotinylated versjon av peptidisc stillaset, kalt bio-Peptidisc. Den biotin funksjonelle grupper tillate feste av målet membran protein på streptavidin-belagte overflater. Siden biotin merking er begrenset til stillaset, bindende steder på målet membran protein forblir uendret. Ved hjelp av bio-Peptidisc, bindingen Kinetics av bakteriell membran reseptoren FhuA og antimikrobielle peptid colicin M (ColM) er bestemt16. Dette affinitet måles via biolayer laboratoriefasiliteter (BLI), som analyserer interaksjoner i sanntid basert på hvite lysforstyrrelser mønstre reflekteres fra en sensor spissen.
Ved å bruke denne protokollen, er behovet for vaskemiddel under BLI analyse eliminert, som er en viktig utvikling, som vaskemidler kan forstyrre interaksjoner. Binding slektskap kan måles raskt med denne metoden, og resultatene er sammenlignbare med de som rapporteres tidligere ved hjelp av nanodiscs og isotermiske titrering reaksjonskalorimetri (ITC)16. De kritiske trinnene i arbeidsflyten PeptiQuick vises og diskuteres, for eksempel protein forberedelser, fortynning av vaskemiddel, peptid tillegg og rekonstituering, sammen med tips for å feilsøke ligand og analytt binding i BLI-analysen. Ved hjelp av PeptiQuick arbeidsflyt, er det funnet at membran proteiner kan fanges opp i peptidiscs og deres interaksjoner målt i løpet av en dag.
Protocol
1. tilberedning og oppløseliggjøringen av membran reseptor FhuA
- Express hans6-Tagged FhuA i ESCHERICHIA coli stamme AW740. Voks celler i 18 timer ved 37 ° c i M9-medier (tabell 1). Se Mills et al.16 for en detaljert uttrykks protokoll.
- Høste celler av sentrifugering (5 000 x g, 10 min, 4 ° c) og resuspend dem i 50 ml Tris-salt-GLYSEROL (TSG) buffer (tabell 1). Dounce de resuspendert cellene og tilsett phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) til en endelig konsentrasjon på 1 mM like før lyse.
FORSIKTIG: PMSF er giftig og etsende. - Lyse cellene ved hjelp av en microfluidizer (tre passasjer) på 15 000 psi eller en fransk trykk (tre passasjer) på 8 000 psi. Pellet unlysed celler og annet uløselig materiale av lav hastighet sentrifugering (5 000 x g, 10 min, 4 ° c).
- Ultracentrifuge den supernatanten (200 000 x g, 40 min., 4 ° c) for å isolere olje membran fraksjonen. Kast supernatanten, resuspend membran pellet i en minimum mengde TSG buffer, og dounce ved hjelp av et glass eller metall douncer apparat for å sikre homogenitet.
- Utfør en Bradford analysen for å sjekke protein konsentrasjonen av resuspendert råolje membran. Fortynne råolje membranen til en endelig konsentrasjon på 3 mg/mL ved hjelp av TSG buffer før oppløseliggjøringen.
- Tilsett vaskemiddel Triton X-100 i en endelig konsentrasjon på 1% (v/v) for å selektivt solubilize den bakterielle indre membranen i 1 time ved 4 ° c med skånsom rocking. Pellet det uløselig materiale (ytre membran brøkdel) av ultracentrifugation (200 000 x g, 40 min, 4 ° c).
- Kast supernatanten som inneholder solubilized membranen og resuspend pellet i TSG til en endelig konsentrasjon på 3 mg/mL. Tilsett lauryldimethylamine oksid (LDAO) til en konsentrasjon på 1% (v/v) til den resuspendert ytre membran fraksjonen og solubilize for 1 time ved 4 ° c med skånsom rocking.
- Utfør et siste sentrifugering trinn for å pellet alt uløselig materiale (200 000 x g, 40 min, 4 ° c).
Merk: den resulterende supernatanten inneholder solubilized ytre membran proteiner, inkludert målet hans-merket FhuA.
2. rensing og rekonstituering av FhuA ved hjelp av PeptiQuick arbeidsflyt
- Pre-likevekt en ferdigpakkede ni-NTA kolonne (5 mL harpiks volum) med to kolonne volumer av immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC) vaskebuffer (tabell 1).
- Fortynne solubilized ytre membran fra 1% LDAO til 0,04% LDAO bruker TSG. Deretter legger imidazole til en endelig konsentrasjon på 5 mM.
FORSIKTIG: Imidazole er giftig og etsende. - Legg solubilized ytre membran proteiner på ni-NTA harpiks og samle sonore. Reload sonore på harpiks for å øke harpiks binding av FhuA og samle den sekundære sonore.
Merk: Oppbevar en 20 μL alikvot av solubilized materiale som referanse for senere natrium natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side) analyse. - Vask harpiks med 250 mL av IMAC vaskebuffer og samle de første 50 mL eluatet. Tøm vaskebuffer til høyden av harpiks seng volum og lukke stopcock på kolonnen.
- Tilsett 1 mL konsentrert 10 mg/mL bio-Peptidisc peptid løsning (tabell 1) til kolonnen. Tilsett 50 mL fortynnet 1 mg/mL bio-Peptidisc peptid løsning i TSG og rør harpiks med en glass stang for å resuspend perlene i TSG.
- Etter peptidisc overlapping, la harpiks å bosette og drenere overflødig 1 mg/mL bio-Peptidisc løsning gjennom harpiks.
- Vask ni-NTA vedlagte peptidisc partikler med 50 mL TSG. Eluere de peptidisc partiklene med 15 mL IMAC eluering buffer (tabell 1) som inneholder 600 mm IMIDAZOLE i TSG. Samle 1 mL fraksjoner og tilsett umiddelbart 10 μL av 0,5 M EDTA for å chelate utvasket nikkel ioner.
FORSIKTIG: EDTA er et irritasjonsmoment.
3. evaluering av PeptiQuick-rekonstituering
- SDS-side analyse
- Legg 10 μL alikvoter av Start materialet, sonore, vask (er) og eluert fraksjoner fra PeptiQuick rekonstituering på en 12% SDS-denaturering gel og electrophorese i 30 minutter ved en konstant strøm på 60 mA.
- Stain gelen med Coomassie blå fargestoff, destain gelen, og visualisere på en skanner.
- Størrelse-utelukkelse kromatografi (SEC)
- Basert på 12% SDS-PAGE analyse av PeptiQuick rekonstituering, isolere og basseng de relevante fraksjoner, og konsentrere dem ved hjelp av en 30 kDa cut-off sentrifugal konsentrat.
Merk: i den vedlagte videoen blir brøker F3 – F7 samlet og konsentrert under 1 mL (volum for injeksjons sløyfe på SEC-instrumentet). - Injiser ~ 1 mL av de grupperte IMAC-eluering brøkdeler på en gel filtrering S200 (300/10) kolonne med en strømningshastighet på 0,25 mL/min i TSG buffer. Samle 1 mL fraksjoner og kjøre dem på en 12% SDS gel for å finne ut hvilke SEC fraksjoner å svømme og konsentrere seg.
Merk: eluert PeptiQuick-brøker kan samles uten konsentrasjon, og en alikvot kan injiseres på SEC for å kontrollere kvaliteten på rekonstituering. Dette er en viktig kontroll for membran proteiner som er potensielt følsomme for aggregering under sentrifugal konsentrasjonen.
- Basert på 12% SDS-PAGE analyse av PeptiQuick rekonstituering, isolere og basseng de relevante fraksjoner, og konsentrere dem ved hjelp av en 30 kDa cut-off sentrifugal konsentrat.
4. Biolayer laboratoriefasiliteter
- BLI eksperimentell oppsett
- Sett opp 96 brønn platen for hånd.
Merk: alle brønner er fylt til et endelig volum på 200 μL. - I kolonne 1, rader A − E, Last 200 μL av Kinetics buffer slik at tipsene kan likevekt og danne et grunnlinje signal.
- Fortynne ligand (FhuA i bio-Peptidisc) til en konsentrasjon på 2,5 μg/mL i Kinetics buffer (tabell 1). Last 200 μL av denne fortynning i rader A − D i kolonne 2.
- Tilsett 200 μL av Kinetics buffer bare til E2 (referanse sensoren).
- Tilsett 200 μL av Kinetics buffer til kolonne 3, rader A − E for å vaske overflødig FhuA fra spissen.
- I kolonne 4 utfører du to ganger serie fortynninger av analytt (ColM) ned platen fra a4 til D4. Start med 28 nM (8 * KD) i A4 til 3,5 nM (1 * KD) i D4.
- Legg til 28 nM ColM til E4 for å måle for ikke-spesifikk binding (den høyeste ColM-konsentrasjonen som brukes).
- Tilsett 200 μL av Kinetics buffer i kolonne 5, rader A − E.
Merk: Her vil ColM distansere fra spissen, og dissosiasjon måles. - Plasser oppsetts platen i BLI-instrumentet.
- Plasser sensor tips skuffen i BLI-instrumentet.
- Åpne BLI datainnsamling programvare og velg ny Kinetics Experiment på programvare veiviseren.
- Bruk kategorien plate definisjon til å legge inn oppsettet på 96 brønn platen i programvaren.
Merk: brønnene som inneholder ligand, FhuA er angitt som "Load". Wells som inneholder buffer bare er angitt som "buffer". Wells som inneholder analytt, ColM, er angitt som "sample". - Bruk analysen definisjon kategorien for å definere hvor lang tid og plate rotasjon hastighet for hvert trinn i eksperimentet.
Merk: de eksperimentelle trinnene er satt opp som: 1) Baseline: 60 s; 2) lasting: 250 s; 3) planlagt: 300 s; 4) forening: 450 s; og 5) dissosiasjon: 900 s. la riste hastigheten som standard (1 000 rpm). Trinnene ovenfor er individuelt tilordnet hver kolonne i 96 brønn plate ved å velge ønsket trinn og høyreklikk Legg til analysen trinn på hver kolonne. - Tildel det første trinnet ved å høyreklikke på den første kolonnen og velge Start ny analyse. Kontroller at grunnlinje trinnet er riktig tilordnet ved hjelp av det nederste høyre vinduet, og endre med rullegardinmenyen etter behov.
- Tildel de påfølgende trinnene til hver kolonne ved å høyreklikke langs platen og velge Legg til analyse trinn. Tilordne disse til riktig kolonne, som angitt i trinn 4.1.13.
- Bruk sensor oppgave fanen for å sikre at det oktetten instrumentet tar BLI-pinner fra riktig sted i sensor skuffen.
Merk: i kategorien sensor tilordning skal bare a1 − E1 utheves blått. Sørg for at sensor spissen er til stede på disse stedene i sensor skuffen, og påse at F1 − H1 er tomme. - Uthev F1 − H1 på skjermen, høyreklikk og velg Fjern for å markere disse som tomme. Tick SKIFT sensorer i skuffen etter bruk for å beholde de brukte sensorene.
- I eksperiment fanen for gjennomgangen, som gir en endelig oversikt over eksperimentet før kjøringen, går du gjennom de eksperimentelle trinnene for å sikre at hele oppsettet er riktig.
- I kategorien Kjør eksperiment velger du en filplassering for å lagre metode filene.
- Endre plate temperaturen til romtemperaturen.
- Velg gå til for å kjøre eksperimentet.
- Sett opp 96 brønn platen for hånd.
- BLI dataanalyse
- Åpne programvaren oktetten BLI dataanalyse.
- Bruk kategorien for datautvelgelse til å finne eksperimentet og for å sjekke det eksperimentelle sammendraget. Importer prosjektfilen fra lagringsplasseringen som er definert under trinn 4.1.19.
- Angi konsentrasjonen av analytt (her, ColM) ved å velge sensorinformasjon for hvert eksperiment.
- Tildel spissen i E1 som referanse tips.
- Bruk kategorien prosessering til å trekke referanse signalet (E1) fra de eksperimentelle dataene. Kontroller rådata fra referanse tipset for ikke-spesifikk analytt binding. Hvis ingen er observert, Fortsett.
Merk: Dette er en viktig negativ kontroll. Hvis ikke-spesifikk binding er observert, vil dette bli gjort rede for i trinn 4.2.7. - Justerer y-aksen til det andre opprinnelige trinnet. Ikke kryss av interstep tilkobling. Velg Savitzky-Golay-filtrering. Velg prosess data!.
- I analyse kategorien velger du de eksperimentelle dataene i tabellen under plottet for å se tilknytningen og dissosiasjon kurvene med signalet fra referanse sensoren som trekkes fra.
- Velg den 1:1 bindings modellen, og velg en del kurve som passer. Velg Tilpass kurver!.
- Analyser det gjenværende visnings plottet for å kontrollere kurven som passer.
- Bla gjennom tabellen for å se den beregnede Kd.
- Velg Lagre rapport... for å lagre et regnearkdokument med detaljer om oppsettet, tomter for de rå og analyserte dataene og de beregnede dissosiasjon konstantene.
Representative Results
Membranen reseptoren FhuA uttrykkes i et laboratorium E. coli belastning. Den ytre membran fraksjon høstes av sentrifugering, og proteiner er solubilized ved hjelp av en to-trinns vaskemiddel utvinning. Den solubilized membran proteiner er lastet inn i ni-NTA agarose perler pakket i en plast kolonne, etterfulgt av PeptiQuick arbeidsflyt som presenteres i protokollen. Etter en kvalitetskontroll med størrelses ekskludering kromatografi, er bio-Peptidisc-partiklene immobilisert på streptavidin-belagte pinner. BLI-analysen er utført for å måle Kinetics av samspillet mellom FhuA og ColM. Den Skjematisk oversikt over dette eksperimentet er presentert i figur 1.
En SDS-gel kjøres for å bestemme kvaliteten på rekonstituering etter eluering av FhuA bio-Peptidisc-partikler fra IMAC-kolonnen (figur 2). Alikvoter av fraksjoner som tilsvarer Start, sonore, vasker, og eluering fraksjoner er lastet på SDS-gel for å evaluere suksessen til PeptiQuick-metoden. Reduksjonen av FhuA i den sonore fraksjonen er korrelert med en berikelse i eluering fraksjoner, noe som indikerer at rensing av proteinet har vært effektiv. Mindre miljøgifter protein band er observert i eluert fraksjoner. SDS gel-analysen brukes til å bestemme hvilke fraksjoner som skal samles før SEC-analysen. En innfødt gel av eluert FhuA bio-Peptidisc partikler er også kjørt for å bekrefte FhuA løselighet (supplerende figur 1). Migrering av rekonstituert protein til den innfødte gelen indikerer protein løselighet i et vaskemiddel fritt miljø.
SEC-analysen utføres for å vurdere løselighet av de peptidisc partiklene. Kromatogram som presenteres i figur 3a viser en enkelt, symmetrisk topp tent på ca. 14 ml (6 ml forbi void-volumet på 8,0 ml på gel-filtrering S200 10/300-kolonnen). Plasseringen av denne toppen, forbi tomrommet volum, bekrefter løselighet av FhuA bio-Peptidisc partikler. For referanse illustrerer figur 3b en teoretisk suboptimal peptidisc forberedelse. I dette tilfellet viser kromatogram et større protein peak tent på void volum, indikerer tilstedeværelsen av protein aggregater. De mindre peak tent bare forbi de viktigste peptidisc peak tilsvarer overflødig peptidisc peptider.
Samspillet mellom FhuA og analytt ColM bestemmes etter at peptidiscs er festet til streptavidin belagte sensorer. Sensor tipsene er først equilibrated i Kinetics buffer, deretter overført til buffer som inneholder FhuA bio-Peptidiscs. Konsentrasjonen av FhuA bio-Peptidiscs og hvor lenge de er inkubert med spissen er optimalisert før dette eksperimentet (supplerende figur 1). Etter lasting og vasketrinn, måler tilknytnings trinnet samspillet mellom de lastede tuppene og fire ulike konsentrasjoner av colicin M. Den påfølgende bevegelsen av tipsene tilbake i buffer resulterer i dissosiasjon, som måles ved bølgelengde forskyvning av hvitt lys som reflekteres av spissen.
Figur 4a viser rå data sensorgram utdata fra dette eksperimentet. Alle spor vises ensartet i lasting og Baseline trinn, bortsett fra referanse spor i gult. Referanse tipset har ingen ligand lastet, men er utsatt for analytt til analysen for ikke-spesifikk binding, som er en viktig negativ kontroll. For mer detaljert analyse av resultatene trekkes signalet fra referanse spissen fra sporene til de eksperimentelle tipsene for å gjøre rede for ikke-spesifikk binding. Dataene justeres til starten av tilknytnings trinnet for å tillate en direkte visuell sammenligning, som vist i figur 4b. Denne sammenligningen viser en økning i bølgelengde forskyvning for økende konsentrasjoner av colicin M. Kurven passer til dataene og viser en klassisk 1:1 bindende modell.
Den gjenværende visningen plottet (figur 4b, bunn), som beskriver forskjellene mellom montering og eksperimentelle data, viser montering for den høyeste konsentrasjonen av ColM (28 nM) er dårlig i forhold til de tre lavere konsentrasjoner. Profilen av kurven selv mangler bindingen kurve platået, som er karakteristisk for bindende område metning i et typisk bindende eksperiment. Mangelen på platå antyder heterogen bindende, noe som er sannsynlig en gjenstand av den høye ColM konsentrasjon. Denne høyeste ColM konsentrasjonen er derfor diskontert fra analysen, og de tre andre konsentrasjonene brukes til å bestemme dissosiasjon konstant (Figur 4C, D). En tosidig student t-test, på et 95% sikkerhetsnivå, fant at den observerte dissosiasjon konstanten fra dette eksperimentet ikke er signifikant forskjellig fra verdiene innhentet ved hjelp av ulike teknikker (figur 4e)16.
Figur 1: Oversikt for PeptiQuick-arbeidsflyt ved hjelp av bio-Peptidiscs-og bli-analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: SDS gel analyse (12%) av Start, sonore, vask, og eluering fraksjoner samlet gjennom PeptiQuick arbeidsflyt. Ca 10 μL av prøven ble lastet inn i hvert felt og kjøre i 30 minutter ved en konstant strøm av 60 ma. Gelen var farget med Coomassie blå, destained, og visualisere på en gel scanner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksperimentelle og TEORETISKE SEC-profiler som representerer optimale og suboptimal reconstitutions, henholdsvis. (A) eksperimentell SEC-profil av PeptiQuick rekonstituert FhuA (~ 82 KDA) i bio-Peptidiscs. IMAC-eluering fraksjoner F3 − F7 ble samlet og konsentrert ved hjelp av en 30 kDa sentrifugal konsentrat til ~ 1 mL. Denne konsentrerte prøven ble injisert ved 0,25 mL/min til en gel filtrering S200 (10/300) kolonne i TSG buffer. (B) teoretisk SEC-profil for en suboptimal PeptiQuick-rekonstituering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: gransker ColM interaksjoner med FhuA rekonstituert i bio-Peptidiscs. (A) rådata sensorgram med referanse sensor spor i gult. (B, C) Topp: assosiasjon og dissosiasjon trinn med delvis 1:1 bindende kurve montering. Bunn: rest visninger som viser forskjellen mellom eksperimentelle data og beregningsorientert montering. (C) Replotting av (B) med utelukkelse av den høyeste konsentrasjonen av ColM. (D) observert forening og dissosiasjon satser (kpå og kav, henholdsvis) og dissosiasjon konstanter (kD). (E) sammenligning av FhuA-ColM dissosiasjon konstanter innhentet av PEPTIDISC og bli (i dette eksperimentet), peptidisc og Mikroskala Thermophoresis (Saville, upubliserte data), og nanodisc og isotermiske titrering reaksjonskalorimetri16. Feilfelt representerer ett SD av usikkerhet, mens n.s. betegner ingen signifikant forskjell på 95% sikkerhetsnivå. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| M9 Media (per liter) |
| 200 mL M9 salt |
| 800 mL dH2O |
| 10 mL 40% glukose |
| 80 μL 1 M CaCl2 |
| 2,5 mL 1 M MgSO4 |
| 300, μL 15 mg/mL Tiamin |
| TSG-buffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glyserol |
| IMAC vaske buffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glyserol |
| 0,04% LDAO |
| 5 mM Imidazole |
| Bio-Peptidisc løsning |
| Løs opp den klare til bruk bio-Peptidisc (> 95% renhet) i steril dH2O. Konsentrasjonen og volumet av peptid løsningen avhenger av trinnet i prosessen med rekonstituering. |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| Merk: denne bio-Peptidisc peptid aksjen er stabil ved 4 ° c i over en måned. |
| Eluering buffer for IMAC |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glyserol |
| 600 mM Imidazole |
| Kinetics buffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 |
| 50 mM NaCl |
| 0,002% mellom-20 |
| 0,1% BSA |
Tabell 1: oppskrifter for utarbeidelse av medier og løsninger.
Supplerende figur 1:4% – 16% klar innfødt gel analyse av eluering fraksjoner som er samlet inn fra PeptiQuick arbeidsflyten. Omtrent 10 μL av prøven ble lastet inn i hvert felt og kjørt i 40 min ved en konstant strøm på 30 mA. Gelen var farget med Coomassie blå, destained, og visualisere på en skanner. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 2: ligand konsentrasjon optimalisering ved hjelp av en enkelt PIN. (A) de seks ulike konsentrasjoner av FhuA i bio-Peptidisc testet for binding til en enkelt streptavidin belagt PIN. Dette ble satt opp i en 96 brønn plate med buffer i brønnene mellom ligand konsentrasjoner (se tilleggsfil 1 for oppsetts protokoll). (B) rådata sensorgram for ligand optimalisering eksperimentet. Pinnen gir den største responsen, og i tillegg når metning ved konsentrasjon nummer 4 (eller 2,5 μg/mL). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Discussion
Mens vaskemidler forblir den enkleste metoden for å trekke ut og rense membran proteiner, kan disse overflateaktive stoffene ha mange uønskede effekter på protein stabilitet, funksjon, og nedstrøms analyser1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Disse vanskelighetene har motivert utviklingen av membran mimetics, som streber etter å minimere tilstedeværelsen av vaskemidler og gjenskape den innfødte membran miljø så mye som mulig2,3,4 ,5,6. De fleste metoder for rekonstituering krever imidlertid betydelig optimalisering av betingelsene for rekonstituering og krever ofte ytterligere rensing trinn, noe som reduserer den endelige avkastningen på7,8. Den peptidisc spontant tilpasser seg til målet membran protein og relativt, krever lite optimalisering og nedstrøms rensing9,10. I denne protokollen er PeptiQuick presentert som en enkel måte å effektivisere rekonstituering protokollen for nedstrøms protein-protein interaksjon analyse.
Selv om det er enkelt, er det flere eksperimentelle begrensninger som kan føre til mislykket rekonstituering. Blant disse, den vanligste skyldes protein aggregering. Det er derfor avgjørende å utføre størrelses ekskludering kromatografi for å overvåke prosessen med rekonstituering. For eksempel, en størrelses utestenging peak tent på void volumet er en indikasjon på protein aggregater (figur 3b)17,18. Membran protein aggregater dannes vanligvis ved langvarig eksponering for under optimale rengjørings forhold før rekonstituering. Spesielt har det blitt funnet at membran proteiner i vaskemiddel har en tendens til å danne aggregater når konsentrert av ultrafiltrering på sentrifugal enheter. I dette tilfellet, kan følsomme membran proteiner være konsentrert ved hjelp av vakuum ultra-filtrering, en mildere og mer homogen metode for konsentrasjon siden absorpsjon av proteiner til filteret er redusert.
Generelt, for å unngå proteinkonsentrasjon, bør eluert IMAC-fraksjoner samles, og en alikvot injiseres på en størrelses ekskluderings spalte for å kontrollere kvaliteten på rekonstituering. Det bør bemerkes at kommunefritt peptid elutes like etter de viktigste peptidisc Peak (figur 3b). Den frie stillaset ikke nødvendigvis hindre nedstrøms eksperimenter. Men hvis det er nødvendig, kan dette overskuddet fjernes ved størrelses ekskludering kromatografi. Alternativt, øke vaske volumet under rekonstituering, og før eluering fra IMAC harpiks, er nok til å effektivt fjerne det meste av gratis peptidisc peptid. Derfor anbefales størrelses ekskludering kromatografi som en rask og enkel måte å kontrollere rekonstituering kvalitet.
BLI-eksperimentet krever nøye optimalisering av både ligand og analytt konsentrasjoner. Ligand binding må være tilstrekkelig for å få et klart signal, men overbelastning vil føre til signal metning, noe som resulterer i data gjenstander fra overbefolkning og elektrosteriske hindring på spissen overflaten. Derfor må både konsentrasjonen av ligand og lang tid som spissen bruker i den ligand løsningen, optimaliseres for hvert protein utvalg (supplerende figur 2). Analytt konsentrasjon må også optimaliseres. Hvis dissosiasjon konstant er kjent, blir dette trinnet enklere, ettersom konsentrasjons området kan anslås. Et godt utgangspunkt for denne analysen er å bruke protein konsentrasjoner mellom 0,1-og 20-fold den forventede KD19.
Etter BLI datainnsamling, må nøye dataanalyse utføres for å unngå feil tolkning. Beregningen av dissosiasjon konstanten er avhengig av at det er plass til en bindings kurve. Med mindre innbindingen støkiometri er allerede kjent, en klassisk 1:1 bimolecular vekselvirkningen modell burde bli brukt for det Initial passer. Det bør bemerkes at en heterogen bindende kurve er ofte et resultat av gjenstander og ikke-ideelle atferd forårsaket av høy analytt konsentrasjon, som kan bli misforstått som en kompleks bindende modell. Derfor senke analytt konsentrasjonen til sensorgram profilen viser 1:1 bindende støkiometri kan bidra til å skille heterogen binding fra mer komplekse interaksjoner. Eventuelle gjenværende heterogene bindende data blir deretter diskontert som vist i Figur 420.
I denne rapporten måles en dissosiasjon konstant på 2,28 ± 0,74 nM for FhuA-ColM-samhandlingen. Denne verdien er konsistent med den dissosiasjon konstanten som tidligere er bestemt i vår gruppe med nanodisc eller peptidisc ved hjelp av ITC eller MST, henholdsvis (figur 4e)16. Denne konsistensen gir trygghet om peptidisc rekonstituering og BLI-analyse som et middel til å bestemme interaksjons Kinetics. Viktigere, bør det bemerkes at proteiner er vanligvis immobilisert på streptavidin biosensors enten gjennom biotin kjemiske kryss-linking eller område-spesifikk tillegg ved hjelp av E. coli biotin ligase BirA21. Tydeligvis, biotinylating den peptidisc stillaset, i stedet for målet membran protein, har mange fordeler. Stillaset biotinylation sparer tid og minimerer potensialet for å forstyrre viktige protein bindende områder. Vi har også funnet at PeptiQuick gjelder for et bredt spekter av protein mål klasser, inkludert G-protein-sammenkoblede reseptorer (GPCRs), ion-kanaler, og β-fat membran proteiner. Generelt bør det bemerkes at den første vaskemiddel ekstrakt av membran proteiner i en aggregat-fri tilstand er kritisk, og at umiddelbar rekonstituering i peptidisc avtar nedstrøms aggregering problemer. Gitt enkelhet, er det seg at PeptiQuick vil bli utvidet til andre streptavidin-baserte bindende analyser, for eksempel overflate Plasmon resonans (SPR), ELISA analyser og affinitet pull-Downs bruker streptavidin perler.
Disclosures
FD er grunnlegger av Peptidisc Biotech å distribuere Peptidisc peptider til det akademiske samfunnet. Peptidisc Biotech er også samarbeid med industrielle bioteknologi og Pharma selskaper å implementere Peptidisc i sine funn arbeidsflyter. Open Access publikasjon av denne artikkelen ble sponset av FortéBio.
Acknowledgments
Vi takker Natural Sciences og engineering Research Council of Canada. JS har et CGS-M CIHR stipend. LT ble støttet av bioteknologi og biologiske vitenskaper forskningsråd-finansiert South West biovitenskap doktorgrads trening partnerskap [opplæring Grant Reference BB/M009122/1]. FD er en tier II Canada Research Chair.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | - |
| Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
| Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
| CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
| EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
| Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | - |
| Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
| Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
| Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
| MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
| Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
| Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | - |
| Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
| Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | - |
| Protein Assay Dye - Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration |
| Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
| Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
| Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | - |
| Thiamine | Merck | 69271 | - |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
| Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
| Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
| Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | - |
References
- Rawlings, A. E. Membrane proteins: always an insoluble problem. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).
- Popot, J. L. Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions. Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).
- Lee, S. C., et al. A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment. Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).
- Frauenfeld, J., et al. A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins. Nature Methods. 13, 345-351 (2016).
- Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs. Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins. Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).
- Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins. Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).
- Carlson, M. L., et al. The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution. eLife. 7, 34085 (2018).
- Carlson, M. L., et al. Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries. eLife. 8, 46615 (2019).
- Serdakowski, A., et al. A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal. International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).
- Smith, S. M. Strategies for the Purification of Membrane Proteins. Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).
- Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
- Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics. Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).
- Montigny, C., et al. Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics. PLoS ONE. 12 (1), 0170481 (2017).
- Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).
- FortéBio. Octet System Data Acquisition User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2014/01/Data-Acquisition-Octet.pdf (2014).
- FortéBio. Octet System Data Analysis User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Data-Analysis-Octet.pdf (2011).
- Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Research. 8, 135 (2019).
