Summary
Этот протокол описывает экспериментальный процесс по производству высокотитра инфекционных вирусных псевдотипированных частиц (pp) с оболочкой гликопротеинов из двух штаммов гриппа А и как определить их инфекционность. Этот протокол очень адаптируется к разработке pps любого другого типа окутанных вирусов с различными гликопротеины оболочки.
Abstract
Случайная прямая передача высокопатогенного вируса птичьего гриппа А H5N1 (HPAI H5N1) и H7N9 людям и их летальности являются серьезными проблемами общественного здравоохранения и указывают на возможность эпидемии. Тем не менее, наше молекулярное понимание вируса является рудиментарным, и необходимо изучить биологические свойства его оболочки белков в качестве терапевтических целей и разработать стратегии по борьбе с инфекцией. Мы разработали твердую вирусную псевдотипированную частицу (pp) платформу для изучения вируса птичьего гриппа, включая функциональный анализ его гемагглютинина (HA) и нейраминидаза (NA) конвертгликопротеинов, реассортировызные характеристики HAs и NAs, рецепторы, тропизмы, нейтрализация антител, диагностика, инфекционность, для целей разработки лекарств и разработки вакцин. Здесь мы описываем экспериментальную процедуру по установлению pps с оболочкой гликопротеинов (HA, NA) из двух штаммов гриппа А (HAPI H5N1 и 2013 птичьи H7N9). Их генерация основана на способности некоторых вирусов, таких как вирус мурин лейкемии (MLV), включать конверт гликопротеинов в pp. Кроме того, мы также подробно, как эти pps количественно с RT-qPCR, и инфекционность обнаружения родной и несовместимые вирусpps в зависимости от происхождения HAs и NAs. Эта система является очень гибкой и адаптируемой и может быть использована для создания вирусных pps с конвертом гликопротеинов, которые могут быть включены в любой другой тип окутанного вирусом. Таким образом, эта платформа вирусных частиц может быть использована для изучения диких вирусов во многих исследованиях.
Introduction
Миссия вирусной частицы состоит в том, чтобы транспортировать ее геном из инфицированной клетки-хозяина в неинфицированную клетку-хозяина и доставить ее в цитоплазму или ядро в рецифицируемой форме1. Этот процесс первоначально вызван связыванием с рецепторами клеток-хозяев, а затем слиянием вирионных и клеточных мембран. Для окутанных вирусов, таких как вирусы гриппа, шип гликопротеинов отвечают за связывание рецепторов и слияние1,2. Вирусные гликопротеины конверта (например, пирогенны, антигены), участвуют во многих важных свойствах и событиях, таких как инициирование жизненного цикла вируса (связывание и слияние), вирусный патогенез, иммуногенность, апоптоз клеток-хозяев и клеточный тропизм, клеточный эндоцитарный путь, а также межвидовая передача и реассортициция1,3,4,5,6. Исследования вирусных гликопротеинов конверт поможет нам понять многие аспекты процесса вирусной инфекции. Псевдотипированные вирусные частицы (pp), также называемые псевдовирии или псевдочастицы, могут быть получены с помощью псевдотипирования техники8,9,10. Эта технология была использована для разработки псевдотипированных частиц многих вирусов, в том числе гепатита С11,12, гепатита В13,везикулярный стоматит вирус (VSV)14,15, и вирус гриппа16,17,18,19. Эта технология основана на протеине Gag-Pol лентивирусов или других ретровирусов.
Псевдотипированные вирусные частицы могут быть получены с помощью трех плазмидной системы путем котрансфектации вирусного конверта гликопротеина экспрессии плазмида, ретровирусной упаковки плазмид отсутствует конверт env гена, и отдельный репортер плазмид в pp клеток производителя. Ретровирус собран его протеином Gag, и он бутоны от зараженной мембраны клетки который выражает протеин конверта вируса1. Таким образом, можно получить высокий титр гриппа pps с помощью ретровирусного белка Gag для производства почек на клеточной мембране, выражающей гриппHA и NA. В наших предыдущих исследованиях, HAs / NAs во всех комбинациях были функциональными и в состоянии выполнять свои соответствующие функции в вирусном жизненном цикле16,17,18,20,21. Эти pps использованы для того чтобы исследовать характеристики гриппа биологически, включая hemagglutination, деятельность neuraminidase, tropism связывания HA-рецептора, и infectivity. Поскольку HA и NA являются важными поверхностными функциональными белками в вирусном жизненном цикле, несоответствие HAs и NAs, полученных из различных штаммов гриппа, может частично продемонстрировать реассортивность между ними. Здесь мы создаем восемь типов гриппа pps, объединяя два HAs и два NAs (производные от штамма HPAI H5N1 и h7N9 пятно), используя три плазмидной псевдотипирования системы. Эти восемь типов pps включают в себя два родного pps, H5N1pp, H7N9pp; два несовпадающих pps, (H5'N9)pp, (H7'N1)pp; и четыре pps только укрывательство одного гликопротеина (HA или NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Исследования вируса гриппа, такие как H5N1 и H7N9, ограничены требованиями биобезопасности. Все исследования штаммов вируса дикого гриппа должны проводиться в лаборатории биобезопасности 3 (BSL-3). Псевдотипированная технология вирусных частиц может быть использована для упаковки искусственного вириона в условиях биобезопасности 2 (BSL-2). Таким образом, pps представляют собой более безопасный и полезный инструмент для изучения процессов вируса гриппа в зависимости от двух основных гликопротеинов: гемагглютинина (HA) и нейраминидаза (NA).
Этот протокол описывает генерацию этих pps с трехплазмидной стратегией котрансфекции (см. рисунок 1),как количественно pps, и обнаружение инфекции. PP производства включает в себя три вида плазмидов(Рисунок 1). Ген кляп-пол, который кодирует ретровирусный белок Gag-Pol, был клонирован из комплекта упаковки ретровирусов и вставлен в плазмид pcDNA 3.1 и назван pcDNA-Gag-Pol. Улучшенный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) ген, который кодирует зеленый флуоресцентный белок, был клонирован из вектора pTRE-EGFP, вставлен в плазмид pcDNA 3.1 и называется pcDNA-GFP. Во время клонирования последовательность упаковочного сигнала (яп. ) была добавлена через грунтовку. Гены HA и NA были клонированы в плазмид pVRC, названный pVRC-HA и pVRC-NA, соответственно. Последний плазмид кодирует белок синтеза и может быть заменен любым другим интересуемым белком синтеза. Наша псевдотипивная платформа включает в себя два гликопротеина экспрессии плазмиды: pVRC-HA и pVRC-NA. Это может упростить исследования по реассортиции между различными штаммами вируса в условиях BSL-2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. День 1: Культура клеток и посев
- Культивировать эмбриональные почки человека (HEK) 293T/17 клеток в 60 мм блюда с dulbecco модифицированных основных средств (DMEM) дополнен 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) и 100 U/mL пенициллин-стрептомицин (DMEM Полный средний, DCM) в 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа (CO2) инкубатора до около 80% слияния.
ПРИМЕЧАНИЕ: РЕКОМЕНДУЕТся низкий проход HEK 293T/17. - Тщательно промыть клетки с 5 мл фосфата буферного солья (PBS) 1x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ручная обработка клеток HEK 293T/17 должна быть очень нежной, потому что они легко отсоединяются. - Удалить PBS и разъединить клетки с 1 мл 0,25% трипсин-этилен диамин тетраацетической кислоты (ЭДТА) раствор. Поместите блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 не более 5 мин до тех пор, пока клетки не будут разобщены.
- Деактивировать трипсин, добавляя 5 мл DCM. Разогнать клетки в одноклеточную подвеску, несколько раз поднимигая вверх и вниз.
- Перенесите суспензию клеток в преохлажденный 15-мл центрифуг. Соберите клетки центрифугированием при 250 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Декант, как много супернатанта, насколько это возможно. Отрежь пеллетку клетки с 6 мл среднего DCM и посчитайте клетки. Разбавить клетки до 1 х 106 ячеек/мл со средним DCM.
- Семя клетки в 6 хорошо пластины с 1 мл клеточной подвески на хорошо. Аккуратно погладить тарелку, чтобы равномерно распределить клетки. Инкубировать тарелку на ночь (14-16 ч) в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
2. День 2: Четырехплазмидный котрансфекция, опосредованный липофекцией
- Проверьте морфологию и плотность клеток под перевернутым световым микроскопом. В идеале, клетки должны быть примерно 85% конфлюентприратива при трансфекции. Замените среду 1 мл безсыворотки DMEM среды на хорошо, а затем положить пластину обратно в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ручная обработка клеток HEK 293T/17 должна быть очень нежной, потому что они легко отсоединяются. - Для каждого колодца культивированных клеток, которые необходимо переделать, разбавьте 8 л трансфекционного реагента в объем е 150 л с уменьшенной сывороткой Medium (трубка 1). Смешайте осторожно и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT, примерно 20 градусов по Цельсию).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца трансфекции, подготовить два 1,5 мл микроцентрифуговых труб, пронумерованных 1 и 2. - В трубке 2 разбавить 2,5 мкг плазмидной ДНК в 150 л уменьшенной сыворотки Medium.
ПРИМЕЧАНИЕ: В трубке 2 разбавить каждую плазмидную ДНК, как показано в таблице 1. Плазмидкодирующий вирус везикулярного стоматита (VSV) G гликопротеин (плазмид pLP-VSVG) был использован в качестве положительного контроля, потому что VSV способен заразить широкий спектр клеток. Отрицательные контрольные частицы, в нее отсутствуют гликопротеины по оболочке гриппа (Зенв пп) были сгенерированы с помощью плазмидов pcDNA-Gag-Pol и pcDNA-GFP. - После 5 мин инкубации смешайте разбавленную ДНК с разбавленным трансфекционным реагентом. Смешайте осторожно и инкубировать еще 15 минут на RT.
- Добавьте комплекс ДНК-липидов к соответствующему колодцу, содержащему клетки и среду, свободную от сыворотки. Смешайте осторожно, качая пластину вперед и назад.
- После инкубации в течение 4-6 ч в 37-C, 5% CO2 инкубатор, удалить среду, и заменить 2 мл DMEM. Инкубировать еще 36-48 ч в 37 кв. м, 5% CO2 инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заменить ссывороткой и без антител DMEM. В этом протоколе два HAs и два Н.А. могут быть использованы для генерации восьми типов pps (показано в таблице 1).
3. День 3: Восприимчивые клетки посева
- Для инфекционности ассс, семена каждого типа восприимчивых клеток на 1 х 104 клетки на хорошо в 96 хорошо пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте два типа целевой ячейки для выполнения инфекционного асссеев в этой статье: альвеолярной линии клеток человека (клетки A549) и клетки почки Мадина-Дарби (MDCK). Клетки MDCK широко используются в исследованиях гриппа и могут быть хорошим контролем. Этот шаг является гибким. Любые другие целевые линии клеток могут быть использованы в соответствии с требованиями исследования. - Инкубировать тарелку на ночь (14-16 ч) в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
4. День 4: Псевдотипированные Вирусные частицы Коллекция, количественная и инфекционная асссе
- Псевдотипированный сбор вирусных частиц
- Проверьте цвет среды. В идеале он должен быть светло-розовым или слегка оранжевым. Изучите клетки с перевернутым флуоресцентным биологическим микроскопом под 440-460 нм.
- На 36-48 ч посттрансфекции, урожай pps путем пропуска через 0,45 мкм поливинидена фторид (PVDF) мембранный фильтр для устранения мусора клеток.
- Разделите pps на небольшие аликоты объема.
- Храните pps при -80 градусах по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Однако это не поощряется, так как инфекционность ппс резко снизится после замораживания и оттаивания.
- Псевдотипированная количественная количественная оценка вирусных частиц
- Передача 20 зЛ очищенных pps в 1,5 мл рибонуклеаза (RNase) без микроцентрифуг трубки.
- Добавьте 1 зл 0,24 U/mL бензоназа нуклеазы. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч, чтобы исключить любое загрязнение ДНК и РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевая РНК, обычно вниз регулируется цитомегаловирус (CMV)-GFP РНК, упакован в pps и может избежать деградации бензоназа нуклеазы. - Заморозить образец при -70 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать бензозазу нуклеаза.
- Добавьте 2 зЛ протеиназа K. Инкубировать при 50 градусах по Цельсию в течение 30 минут, чтобы переварить оболочку белков и выпустить РНК CMV-GFP. Инактивируйте протеиназа K при 100 градусах По Цельсия в течение 3 мин.
- Количественноpps в режиме реального времени количественной обратной транскрипции (qRT)-PCR с универсальным зондом Одноступенчатый RT-qPCR Kit, используя передний грунт 5'-AACAAAGCTCGCGTTTAA-3', обратный грунт 5'-GGGTCTCTTCAGAGGATTTACTACTAC-3', и зонд 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', на термоцикле ПЦР в режиме реального времени. Нормализуить pps для номера копии РНК до инфекции.
- Асссеив инфекции
- Разбавить каждый тип pps с точки зрения данных qRT-PCR до 4 х 105 экземпляров/мл (pp нормализации).
- Добавьте Tosyl-Phenylalanine Хлорометил-Кетон (TPCK)-трипсин к окончательной концентрации 40 мкг/мл в pps, которые гавани H7N9 HA. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч, образуя функциональные подразделения HA1 и HA2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует нет необходимости для лечения pps, которые гавани H5 с TPCK-трипсин, потому что они имеют несколько остатков аргинина и лизина на HA1-HA2 декольте сайте. Этот многопрофильный сайт расщепления может быть расщеплен вездесущими клеточными протеазами. - Смешайте нормализованные pps со средним DMEM (без сыворотки) в соотношении 1:1 (объем/объем).
- Принесите пластину, содержащую восприимчивые клетки, в шкаф биобезопасности.
- Аспирируйте супернатант и мыть клетки один раз с 0,1 мл предварительно разогретого PBS.
- Добавьте 0,1 мл смеси pps-DMEM к одной скважине. Triplicate инфекционности тесты каждого типа pps к одной восприимчивой линии клеток (рассматривается на рисунке 2).
- Инкубировать 96 хорошо пластины для 4-6 ч в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатора.
- Призадыхать супернатант и заменить 0,1 мл DCM.
- Инкубировать 96 хорошо пластины еще 24-36 ч в 37 кс, 5% CO2 инкубатора.
5. День 5 или 6: Обнаружение инфекции
- Принесите пластину 96 скважин в шкаф биобезопасности.
- Призадыхать супернатант и промыть клетки 1x с 0,2 мл предварительно разогретого PBS.
- Удалить PBS и разъединить клетки с 0,1 мл 0,25% трипсин-EDTA раствор.
- Поместите блюдо в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор в течение 3 мин, пока клетки не будут разобщены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте инкубации в течение более 5 мин, потому что это приведет к слипанию клеток. - Деактивировать трипсин, добавляя 0,4 мл DCM.
- Разогнать клетки на одноклеточную подвеску, несколько раз поднимигая вверх и вниз.
- Перенесите суспензию клеток в охлажденный микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
- Определите GFP репортер-положительные клетки с флуоресценцией Активированная сортировка клеток (FACS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить соотношение GFP репортер-положительных целевых ячеек, установить поток цитометра ворота с помощью контрольных образцов (pps-необработанных a549 клеток или MDCK клетки), а затем рассчитывать GFP репортер-положительных ячеек 10000 ячеек на образец.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В зависимости от общей процедуры, описанной выше, мы создали 10 типов pps, сочетающих две группы HAs/NAs или ГЛИкопротеин VSV-G или гликопротеины без конверта (показано в таблице 1). Семь из них заразны. PPS, которые гавани не-конверт гликопротеин или только гавань NA не показали какой-либо инфекции здесь. Процедура производства гриппа pp рассматривается на рисунке 1. На рисунке 3показаны электронные микрографы трансмиссии pps (например, H5N1pp). Результаты анализов инфекционности этих pps показаны на рисунке 4. Инфекционность семи типов pps оценивалась по копиям генома на одну клетку (GCP) (по аналогии с множественностью инфекции (MOI) значение 20. В группе pps укрывательство H5, инфекционность H5N1, (H5'N9), и H5 была 90,05 и 4,05%, 17,78 и 1,58%, 10,15 и 2,85% для клеточной линии A549 и 40,37 и 4,92%, 5,24 - 1,32%, 4,88 м.0ц. В группе pps, укрывающей H7, инфекционность H7N9, (H7'N1), и H7 составила 10,45 х 2,35%, 6,75 и 1,37%, 1,23 и 0,33% для клеточной линии A549 и 7,61 и 1,04%, 4,12 и 1,29%, 1,08 Для анализов инфекции pps, особенно HApp (H5pp, H7pp), экзогенная нейраминидаза не была добавлена. В этом анализе инфекционности, клетки MDCK также были использованы как линия клетки управления для того чтобы испытать pps infectivity. Инфекционность VSVGpp составила 20,9 и 2,00% для A549 и 16,02 и 2,41% для клеток MDCK. Дельта-конверт гликопротеинов pp (Зенв pp) не показал инфекции в нашем исследовании. Эти данные также показали, что HAs/ NAs из различных штаммов вируса способны успешно генерировать инфекционные вирусные частицы. В совокупности наша псевдотипивная платформа может разрабатывать инфекционные псевдотипированные вирусные частицы, используемые в исследованиях гриппа.
Рисунок 1: Обзор процедуры производства гриппа pp. ()Упаковка плазмид pcDNA-Gag-pol, репортер плазмид pcDNA-GFP, и конверт гликопротеин выражение плазмиды pVRC-HA и pVRC-NA, котрансфицируются в PP-производства HEK 293/17 клеток. (B) В клетках HEK 293/17 полипротеины Gag-Pol синтезируются и транспортируются неизвестным механизмом в клеточную мембрану. Гликопротеины HA и NA транспортируются и закрепляются на клеточной мембране через секреторный путь. Репортер плазмид pcDNA-GFP транскрибируется в одноцепочечную геномную РНК. (C) Во время или после транспортировки, Gag-Pol белка вербует одноцепочечной геномной РНК через пси-РНК упаковки сигналов, тем самым образуя предварительно бутонизации комплексов. (D) Собранный комплекс Gag-pol---RNA индуцирует искривление мембраны, что приводит к образованию бутона. Во время бутонизации, вирусный конверт гликопротеинов HAs / NAs включены в зарождающихся частиц. Побуживание завершается, как частица отжимает от клеточной мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Общая договоренность в ассочтивности инфекционности. Тесты инфекционности каждого типа pps к одной восприимчивой линии клеток были измерены в тройном. Альвеолярные клетки человека A549 и MDCK используются в качестве восприимчивых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Трансмиссионные электронные микрографы pps. Неконцентрированный (слева) и концентрированный (справа) супернатант. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Инфекция нормализованных pps. Инфекция представлена как средний процент стандартного отклонения (SD) инфицированных клеток (n No 3). Инфекция pps оценивалась в двух клеточных линиях, A549 и MDCK. Семь типов pps отображаются различные профили инфекции в двух целевых ячеек. Pps, что только гавань NA не показаны здесь, поскольку они не проявляют никакой инфекции. Pps, которые гавани не-конверт гликопротеинов (Зенв) также не показали инфекции в нашем исследовании. Процент инфекционности обозначал соотношение GFP репортер-положительных клеток в 10000 клеток на выборку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| плазмидные препараты | ||||||||||
| плазмида (КЛ, 0,1 мкг/Л) | H5N1 | (H5'N9) | H7N9 | (H7'N1) | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | Зенв |
| pcDNA-Gag-pol | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pcDNA-GFP | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pVRC-HA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 2.14 | - | 2.14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | - | 2.14 | - | 2.14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2.14 | - |
Таблица 1: Комбинации белков HA и NA, полученных из вирусов H5N1 и H7N9, а также требуемые количества (объем) плазмидной ДНК для одной хорошо трансфекционной пластины 6 скважин. В соответствии с концентрацией плазмидных препаратов, рассчитать необходимый объем каждой плазмидной ДНК. Общее количество плазмидной ДНК для транфекции одной скважины составляет 2,5 мкг. Чтобы получить самую высокую эффективность трансфекции и самые низкие неспецифические эффекты, мы оптимизировали условия трансфекции путем изменения плазмидной ДНК и концентраций реагентов трансфекции. После оптимизации соотношение четырех плазмидов было установлено как 16:16:1:1. Объем трансфекционного реагента, используемого в одной скважине трансфекции 6 скважинной пластины, составляет 8 зл (не показано в таблице). Два HAs и два NAs из вирусов H5N1 и H7N9 могут быть использованы для создания восьми типов pps: H5N1pp, (H5 и N9)pp, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 и N1)pp, H7pp и N9pp. Pps, которые гавани не-конверт гликопротеинов (Зенв) или только гавань NA гликопротеинов показали не инфекционность в нашем исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы описываем метод производства псевдотипированных частиц вируса гриппа (pp) в условиях BSL-2. Репортер плазмид pcDNA-GFP включен в pps и может быть использован для количественной оценки pps FACS в анализе инфекции. Мы выбрали два типа восприимчивых клеточных линий, потому что они широко используются в исследованиях гриппа. Клетки MDCK обеспечат хороший контроль над переменными увековеченными человеческими клетками, используемыми в этих исследованиях.
Этот протокол основан на ретровирусе MLV, который может включать репортера GFP и производить почки на клеточной мембране. Этот метод был широко разработан для упаковки частиц вируса гриппа4,22,23,24. Некоторые другие системы основаны на лентивирусной системе псевдотипирования ВИЧ-119,25,26 или системе экспрессии клеток baculovirus-насекомых27,28,29. Многие другие гены репортера также были использованы для производства псевдочастиц, таких как люцифераза (люминесценция)30,31,32,33, й-гал / Лака (по кололиметрии)34,35, и выделяется щелочной фосфатазы36,37. Милле и др. использовали люциферазу для количественной оценки инфекционности коронавирусных псевдотипированных частиц33. По сравнению с люциферазой, зеленая флуоресценция GFP легко наблюдается с перевернутым флуоресцентным биологическим микроскопом. Это удобный способ проверить эффективность трансфекции и инфекции. Для этого исследования, инфекционность может быть определена непосредственно путем обнаружения GFP-положительных клеток с FACS.
В этом методе несколько шагов критически влияют на результаты. Оптимизированная плотность клеток является критическим фактором для успешного трансфекции. В этом протоколе было установлено, что плотность клеток в диапазоне 80-90% конфлюкса оптимальна для производства вируса гриппа pp. Более высокая или более низкая плотность клеток приведет к снижению эффективности трансфекции. Хорошее физиологическое состояние клеток-производителей также очень важно для производства частиц с высоким содержанием частиц. Вот почему нижний проход клеток HEK 293T/17 клетки рекомендуется производить pps в этом протоколе. Кроме того, объем трансфекционного реагента и соотношение четырех плазмидов также могут повлиять на эффективность трансфекции. Для получения наивысшей эффективности трансфекции рекомендуется оптимизировать эти факторы путем изменения и тестирования их количества. Мы установили соотношение четырех количеств плазмиды как 16:16:1:1 и объем трансфекционного реагента как 8 л для одной хорошо tranfection в 6 хорошо пластины. Другой проблемой является обработка ячеек. Клетки HEK 293T/17производительные являются низкой адгезией, поэтому ручная обработка клеток должна быть очень мягкой. Липотекция может привести к увеличению проницаемости клеток, а сыворотка и антитела в среде могут увеличить цитотоксичность. Лучше всего использовать безсыворотки и антитела без DMEM для культуры пост-трансинфицированных HEK 293T/17 клеток. Кроме того, время сбора имеет важное значение. На 36-48 ч после трансфекции, цвет клеточной супернатантии должны быть проверены, чтобы убедиться, что это розовый или оранжево-розовый перед pp коллекции. желтый супернатант указывает на то, что среда слишком кислой для поддержки роста клеток и обычно приводит к плохой урожайности pp.
Мы провели трансфекционный асссев в 6 колодцевой пластине. Для получения большего объема pp количество трансфекционных скважин может быть увеличено и супернатанты, которые содержат те же pps могут быть объединены вместе. Кроме того, некоторые другие виды судов могут быть использованы для повышения доходности pp. Например, 18 л трансфекционного реагента и 5,5 мкг плазмидной ДНК могут быть использованы для выполнения трансфекции с 2,2 х 106 клетками в одной тарелке 60 мм. Аналогичным образом, асссецид инфекционности может быть проведен в 24 хорошо пластины.
На успех этой техники могут влиять многие факторы. Поэтому процедура должна быть оптимизирована для упаковки частиц различных видов вирусов.
В этом протоколе были созданы псевдотипированные вирусные частицы HPAI H5N1 и H7N9, а также их реассорта. В этом методе мы используем qRT-PCR GFP-RNA в анализе инфекционности на одноклеточном уровне (как копии генома на клетку) вместо инфекционной дозы культуры ткани 50 (TCID50) или традиционного MOI23,38,39. Методы заражения вирусом основаны на анализах налета или TCID50, которые являются трудоемкими и трудоемкими. Оба исследования полагаются на измерение видимых цитопатических эффектов (CPE), вызванных вирусной инфекцией в клеточных линиях, так что это может быть трудно титрат вирусов низкой инфекции (т.е. H7pp в этом исследовании). Мы считаем, что это удобный, эффективный и быстрый метод нормализации pps с qRT-PCR РНК GFP, содержащейся в гриппе pps.
В совокупности наша техника безопасна и адаптируема, и может быть использована для изучения окутанных вирусов, включая их рецепторы, тропизмы, функцию гликопротеина, нейтрализацию антител, разработку антивирусных препаратов, диагностику и разработку вакцины и Оценки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от провинции Чжэцзян медицины и здравоохранения науки и техники плана (Грант Номера, 2017KY538), Ханчжоу муниципальной медицины и здравоохранения науки и техники плана (Грант Номера, OO20190070), Ханчжоу медицинской науки и Проект "Технологический ключевой проект" (Grant Numbers, 2014-11) и муниципальный проект автономного применения в Ханчжоу социального развития и научных исследований (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
