Denne protokollen beskriver en eksperimentell prosess for å produsere høy-titer smittsomme viral pseudotyped partikler (PP) med konvolutt glykoproteiner fra to influensa A stammer og hvordan du kan bestemme deres infectivity. Denne protokollen er svært tilpasningsdyktig til å utvikle PPS av andre typer innhyllet virus med forskjellige konvolutt glykoproteiner.
En og annen direkte overføring av det svært patogene fugleinfluensa A-viruset H5N1 (HPAI H5N1) og H7N9 til mennesker og deres dødelighet er alvorlige folkehelseproblemer og tyder på muligheten for en epidemi. Men vår molekylære forståelse av viruset er elementær, og det er nødvendig å studere de biologiske egenskapene til sin konvolutt proteiner som terapeutiske mål og å utvikle strategier for å kontrollere infeksjonen. Vi utviklet en solid viral pseudotyped partikkel (PP) plattform for å studere fugleinfluensaviruset, inkludert funksjonell analyse av sin hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) konvolutt glykoproteiner, de reassortment egenskapene til HAs og NAs, reseptorer, tropisms, nøytralisere antistoffer, diagnose, infectivity, i forbindelse med narkotika utvikling og vaksine design. Her beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å etablere PPS med konvolutten glykoproteiner (HA, NA) fra to influensa A stammer (HAPI H5N1 og 2013 avian H7N9). Deres generasjon er basert på kapasiteten til enkelte virus, for eksempel murine leukemi virus (MLV), å innlemme konvolutt glykoproteiner inn i en PP. I tillegg har vi også detalj hvordan disse PPS er kvantifisert med RT-qPCR, og infectivity påvisning av Native og ikke-samsvarende virus PPS avhengig av opprinnelsen til har og NAs. Dette systemet er svært fleksibelt og tilpasningsdyktig og kan brukes til å etablere viral PPS med konvolutt glykoproteiner som kan innlemmes i en annen type innhyllet virus. Dermed kan denne viral partikkel plattform brukes til å studere vill virus i mange forsknings undersøkelser.
Oppdraget av en viral partikkel er å transportere sine Genova fra en infisert vert celle til en ikke-infisert vert celle og å levere den inn i cytoplasma eller kjernen i en replikering-kompetent form1. Denne prosessen er i utgangspunktet utløst av binding til vert celle reseptorer, etterfulgt av fusjon av virionet og cellulære membraner. For innhyllet virus, som influensa virus, Spike glykoproteiner er ansvarlig for reseptor binding og Fusion1,2. Viral konvolutt glykoproteiner (f. eks pyrogener, antigener), er involvert i mange viktige egenskaper og hendelser, for eksempel virus livssyklus initiering (binding og Fusion), viral patogenesen, immunogenisitet, Host Cell apoptose og mobilnettet tropism, mobilnettet endocytic Pathway, samt interspecies overføring og reassortment1,3,4,5,6,7. Forskning på viral konvolutt glykoproteiner vil hjelpe oss å forstå mange aspekter av viral infeksjon prosessen. Pseudotyped viral partikler (PP), også betegnet pseudovirions eller pseudoparticles, kan genereres gjennom en pseudotyping teknikk8,9,10. Denne teknologien har blitt brukt til å utvikle pseudotyped partikler av mange virus, inkludert hepatittC 11,12, hepatitt B13, flytande stomatitt virus (VSV) 14,15, og influensa virus16,17,18,19. Denne teknologien er basert på gag-Pol protein av lentiviruses eller andre retroviruses.
Pseudotyped viral partikler kan fås ved hjelp av en tre-plasmider system ved å cotransfecting en viral konvolutt glykoprotein uttrykk plasmider, en retroviral emballasje plasmider mangler konvolutten env genet, og en egen reporter plasmider i PP produsent celler. Retrovirus er satt sammen av sin gag protein, og det knopper fra en infisert celle membran som uttrykker viruset konvolutt protein1. Derfor er det mulig å oppnå høy titer influensa PPS bruke retrovirus gag protein å produsere knopper på en mobilnettet membran uttrykker influensa HA og NA. I våre tidligere studier, har/NAs i alle kombinasjoner var funksjonelle og i stand til å utføre sine tilsvarende funksjoner i viral livssyklus16,17,18,20,21. Disse PPS brukes til å undersøke influensa biologiske egenskaper, inkludert hemagglutination, neuraminidase aktivitet, HA-reseptor bindende tropism, og infectivity. Fordi HA og NA er begge viktige overflaten funksjonelle proteiner i viral livssyklus, samsvarer ikke har og NAs avledet fra ulike stammer av influensa kan delvis demonstrere reassortment mellom dem. Her genererer vi åtte typer influensa PPS ved å kombinere to har og to NAs (avledet fra HPAI H5N1 belastning og H7N9 flekken), ved hjelp av en tre-plasmider pseudotyping system. Disse åtte typer PPS inkluderer to innfødte PPS, H5N1pp, H7N9pp; to ikke-samsvarende PPS, (H5 + N9) PP, (H7 + N1) PP; og fire PPS bare harboring en enkelt glykoprotein (HA eller NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. studier på influensa viruset, slik som H5N1 og H7N9, er begrenset av biosafety krav. Alle studier av vill influensa virusstammer bør utføres i et biosafety nivå 3 (BSL-3) laboratorium. Pseudotyped viral partikkel teknologi kan brukes til å pakke en kunstig virionet i en biosafety nivå 2 (BSL-2) innstilling. Derfor PPS representerer et tryggere og nyttig verktøy for å studere influensa viruset prosesser avhengig av sine to store glykoproteiner: hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA).
Denne protokollen beskriver generering av disse PPS med en tre-plasmider cotransfection strategi (leses i figur 1), hvordan å kvantifisere PPS, og infectivity deteksjon. PP-produksjonen omfatter tre typer plasmider (figur 1). Den gag-Pol genet, som koder for retrovirus gag-Pol protein, ble klonet fra en retrovirus emballasje Kit og settes inn i pcDNA 3,1 plasmider og oppkalt PcDNA-gag-pol. Den forbedrede grønne fluorescerende protein (eGFP) genet, som koder Green fluorescerende protein, ble klonet fra pTRE-EGFP vektor, settes inn i pcDNA 3,1 plasmider, og kalte pcDNA-GFP. Under kloning, en emballasje signal (ψ) sekvensen ble lagt til via en primer. HA og NA gener ble klonet i en pVRC plasmider, oppkalt pVRC-HA og pVRC-NA, henholdsvis. Den siste plasmider koder Fusion protein og kan erstattes med andre Fusion protein av interesse. Vår pseudotyping plattform inkluderer to glykoprotein uttrykk plasmider: pVRC-HA og pVRC-NA. Dette kan forenkle forskningen på reassortment mellom ulike virusstammer i en BSL-2 innstilling.
I denne protokollen beskriver vi en metode for å produsere influensa virus pseudotyped partikler (PP) i en BSL-2 innstilling. Reporteren plasmider pcDNA-GFP er innlemmet inn i PPS og kan brukes å kvantifisere PPS av FACS inne en infectivity analysen. Vi valgte to typer mottakelige cellelinjer fordi de er mye brukt i influensa forskning. MDCK celler ville gi en god kontroll til variabelen udødeliggjort menneskelige celler som brukes i disse studiene.
Denne protokollen er basert på retroviru…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine og Health Science and Technology plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science og Teknologi nøkkel Project (Grant Numbers, 2014Z11) og Hangzhou kommunale autonome søknad prosjekt for sosial utvikling og vitenskapelig forskning (Grant Numbers, 20191203B134).
Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |