Summary
Ce protocole décrit un processus expérimental pour produire des particules virales pseudotyped infectieuses à haut titre (pp) avec des glycoprotéines d'enveloppe de deux souches de grippe A et comment déterminer leur infectiosité. Ce protocole est très adaptable pour développer des pps de n'importe quel autre type de virus enveloppés avec différentes glycoprotéines d'enveloppe.
Abstract
La transmission directe occasionnelle du virus hautement pathogène de la grippe aviaire A H5N1 (HPAI H5N1) et du H7N9 aux humains et leur létalité sont de graves problèmes de santé publique et suggèrent la possibilité d'une épidémie. Cependant, notre compréhension moléculaire du virus est rudimentaire, et il est nécessaire d'étudier les propriétés biologiques de ses protéines enveloppe comme cibles thérapeutiques et de développer des stratégies pour contrôler l'infection. Nous avons développé une plate-forme solide de particules pseudotypées virales (pp) pour étudier le virus de la grippe aviaire, y compris l'analyse fonctionnelle de son enveloppe d'hémagglutinine (HA) et de neuraminidase (NA) glycoprotéines, les caractéristiques de réassortiment des HA et des NA, récepteurs, les tropismes, neutralisant les anticorps, le diagnostic, l'infectiosité, aux fins du développement de médicaments et de la conception de vaccins. Ici, nous décrivons une procédure expérimentale pour établir des pps avec les glycoprotéines d'enveloppe (HA, NA) de deux souches de grippe A (HAPI H5N1 et 2013 H7N9 aviaire). Leur génération est basée sur la capacité de certains virus, tels que le virus de la leucémie murine (MLV), d'incorporer des glycoprotéines enveloppe dans un pp. En outre, nous détaillons également comment ces pps sont quantifiés avec RT-qPCR, et la détection d'infectiosité des pps indigènes et inadaptés de virus selon l'origine des HAs et des NAs. Ce système est très flexible et adaptable et peut être utilisé pour établir des pps viraux avec des glycoprotéines enveloppe qui peuvent être incorporés dans n'importe quel autre type de virus enveloppé. Ainsi, cette plate-forme de particules virales peut être utilisée pour étudier les virus sauvages dans de nombreuses recherches.
Introduction
La mission d'une particule virale est de transporter son génome d'une cellule hôte infectée à une cellule hôte non infectée et de le livrer dans le cytoplasme ou le noyau sous une forme de réplication-compétente1. Ce processus est d'abord déclenché par la liaison aux récepteurs cellulaires hôtes, suivie par la fusion de virion et de membranes cellulaires. Pour les virus enveloppés, comme les virus grippaux, les glycoprotéines à pointe sont responsables de la liaison des récepteurs et de la fusion1,2. Les glycoprotéines d'enveloppe virale (par exemple, pyrogènes, antigènes), sont impliquées dans beaucoup de propriétés et d'événements importants, tels que l'initiation de cycle de vie de virus (liaison et fusion), la pathogénie virale, l'immunogénicité, l'apoptose de cellules d'hôte et le tropisme cellulaire, la voie endocytique cellulaire, aussi bien que la transmission et le reassortiment interspécifiques1,3,4,5,6,7. La recherche sur les glycoprotéines d'enveloppe virale nous aidera à comprendre beaucoup d'aspects du processus d'infection virale. Les particules virales pseudotypées (pp), aussi appelées pseudovirions ou pseudoparticules, peuvent être générées par une technique de pseudotypage8,9,10. Cette technologie a été utilisée pour développer des particules pseudotypées de nombreux virus, y compris l'hépatite C11,12, l'hépatite B13, virus de la stomatérite vésiculaire (VSV)14,15, et le virus de la grippe16,17,18,19. Cette technologie est basée sur la protéine Gag-Pol des lentivirus ou d'autres rétrovirus.
Les particules virales pseudotypées peuvent être obtenues à l'aide d'un système à trois plasmides en cotransfectant une enveloppe virale d'expression de glycoprotéine plasmide, un plasmide d'emballage rétroviral manquant le gène env d'enveloppe, et un plasmide de journaliste séparé dans les cellules de producteur pp. Le rétrovirus est assemblé par sa protéine Gag, et il bourgeonne à partir d'une membrane cellulaire infectée qui exprime la protéine enveloppe virale1. Par conséquent, il est possible d'obtenir des pps de grippe de haute titer utilisant la protéine de Gag rétrovirus pour produire des bourgeons sur une membrane cellulaire exprimant l'influenza HA et NA. Dans nos études précédentes, les H/NA dans toutes les combinaisons étaient fonctionnels et capables d'exécuter leurs fonctions correspondantes dans le cycle de vie viral16,17,18,20,21. Ces pps sont employés pour étudier des caractéristiques biologiques de grippe, y compris l'hémagglutination, l'activité de neuraminidase, le tropisme liant de HA-récepteur, et l'infectiosité. Étant donné que l'HA et l'AN sont deux protéines fonctionnelles de surface importantes dans le cycle de vie viral, les H et les NA dépareillés dérivés de différentes souches de la grippe peuvent en partie démontrer le réassortiment entre eux. Ici, nous produisons huit types de pps de grippe en combinant deux HAs et deux NA (dérivé de la souche H5N1 de HPAI et de la tache H7N9), utilisant un système de pseudotypage à trois plasmides. Ces huit types de pps comprennent deux pps indigènes, H5N1pp, H7N9pp; deux pps dépareillés, (H5-N9)pp, (H7-N1)pp; et quatre pps hébergeant seulement une seule glycoprotéine (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Les études sur le virus de l'influenza, telles que H5N1 et H7N9, sont limitées par des exigences de biosécurité. Toutes les études sur les souches du virus de l'influenza sauvage doivent être effectuées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 3 (BSL-3). La technologie des particules virales pseudotypées peut être utilisée pour emballer une virion artificielle dans un cadre de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Par conséquent, les pps représentent un outil plus sûr et utile pour étudier les processus de virus de l'influenza en fonction de ses deux glycoprotéines principales : l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA).
Ce protocole décrit la génération de ces pps avec une stratégie de cotransfection à trois plasmides (survu la figure 1),comment quantifier les pps, et la détection de l'infectiosité. La production pp implique trois types de plasmides (Figure 1). Le gène gag-pol, qui code la protéine rétrovirus Gag-Pol, a été cloné à partir d'un kit d'emballage rétrovirus et inséré dans le plasmide pcDNA 3.1 et nommé pcDNA-Gag-Pol. Le gène amélioré de protéine fluorescente verte (eGFP), qui code la protéine fluorescente verte, a été cloné du vecteur de pTRE-EGFP, inséré dans le plasmide de PCDNA 3.1, et appelé pcDNA-GFP. Pendant le clonage, une séquence de signal d'emballage a été ajoutée par l'intermédiaire d'une amorce. Les gènes HA et NA ont été clonés dans un plasmide pVRC, nommé pVRC-HA et pVRC-NA, respectivement. Le dernier plasmide code la protéine de fusion et peut être remplacé par n'importe quelle autre protéine de fusion d'intérêt. Notre plate-forme de pseudotypage comprend deux plasmides d'expression de glycoprotéine : pVRC-HA et pVRC-NA. Cela peut simplifier la recherche sur le réassortiment entre les différentes souches virales dans un cadre BSL-2.
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Protocol
1. Jour 1 : Culture cellulaire et ensemencement
- Cultiver le rein embryonnaire humain (HEK) 293T/17 cellules dans des plats de 60 mm avec le milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 U/mL pénicilline-streptomycine (DMEM Complete Medium, DCM) dans un 37 c, 5% de dioxyde de carbone (CO 2) (CO2)
REMARQUE : Les cellules à faible passage HEK 293T/17 sont recommandées. - Lavez soigneusement les cellules avec 5 ml de phosphate tamponné salin (PBS) 1x.
REMARQUE : La manipulation manuelle des cellules HEK 293T/17 doit être très douce, car elles se détachent facilement. - Retirez pbS et dissoisez les cellules avec 1 ml de 0,25% trypsin-éthylène diamine tétraacetic acid (EDTA) solution. Placer le plat dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 % pendant 5 min jusqu'à ce que les cellules soient dissociées.
- Désactiver la trypsine en ajoutant 5 ml de DCM. Dispersez les cellules dans une suspension à une seule cellule en faisant monter et descendre plusieurs fois.
- Transférer les suspensions cellulaires dans un tube de centrifugeuse préréfrigéré de 15 ml. Recueillir les cellules par centrifugation à 250 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Décante autant que possible du supernatant. Resuspendre la pastille cellulaire avec 6 ml de milieu DCM et compter les cellules. Diluer les cellules à 1 x 106 cellules/mL avec le milieu DCM.
- Ensemencer les cellules dans une plaque de 6 puits avec 1 ml de suspension cellulaire par puits. Tapotez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules. Incuber la plaque toute la nuit (14 à 16 h) dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
2. Jour 2: Cotransfection à quatre plasmides médiatisé par Lipofection
- Vérifiez la morphologie et la densité cellulaires sous un microscope à lumière inversée. Idéalement, les cellules devraient être environ 85% confluent à la transfection. Remplacer le milieu par 1 ml de milieu DMEM sans sérum par puits, puis remettre la plaque dans l'incubateur.
REMARQUE : La manipulation manuelle des cellules HEK 293T/17 doit être très douce, car elles se détachent facilement. - Pour que chaque puits de cellules cultivées soit transfecté, diluer 8 'L du réactif de transfection à un volume de 150 'L avec le milieu de sérum réduit (tube 1). Mélanger délicatement et incuber 5 min à température ambiante (RT, environ 20 oC).
REMARQUE : Pour chaque échantillon de transfection, préparez deux tubes microcentrifuges de 1,5 ml, numérotés 1 et 2. - Dans le tube 2, diluer 2,5 g d'ADN plasmide en 150 l de sérum réduit moyen.
REMARQUE : Dans le tube 2, diluer chaque ADN plasmide comme le montre le tableau 1. Un plasmide codant le virus de stomatérite de vésicule (VSV) Glycoprotéine de G (plasmide pLP-VSVG) a été employé comme contrôle positif, parce que VSV peut infecter un large éventail de cellules. Des particules de contrôle négatives qui n'ont pas d'enveloppe grippale glycoprotéines ont été générées à l'aide de plasmides pcDNA-Gag-Pol et pcDNA-GFP. - Après une incubation de 5 min, combiner l'ADN dilué avec le réactif de transfection dilué. Mélanger délicatement et incuber pendant 15 min à RT.
- Ajoutez le complexe ADN-lipide au puits correspondant contenant les cellules et le milieu sans sérum. Mélanger délicatement en berçant la plaque d'avant en arrière.
- Après l'incubation de 4 à 6 h dans un incubateur de CO2 de 37 oC, 5 %, retirez le milieu et remplacez-le par 2 ml de DMEM. Incuber pendant 36 à 48 h dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
REMARQUE : Remplacez-le par un DMEM sans sérum et sans anticorps. Dans ce protocole, deux AP et deux NA peuvent être utilisés pour générer huit types de pps (indiqués dans le tableau 1).
3. Jour 3: Cellules sensibles Ensemencement
- Pour l'assay d'infectiosité, ensemencez chaque type de cellules sensibles à 1 x 104 cellules par puits dans une plaque de 96 puits.
REMARQUE : Utilisez deux types de cellules cibles pour effectuer l'étude d'infectiosité dans cet article : une lignée cellulaire humaine dérivée de l'alvéolateur (cellules A549) et les cellules du rein canin Madin-Darby (MDCK). Les cellules MDCK sont largement utilisées dans la recherche sur l'influenza et peuvent être un bon contrôle. Cette étape est flexible. Toutes les autres lignées cellulaires cibles peuvent être utilisées en fonction des exigences de recherche. - Incuber la plaque toute la nuit (14 à 16 h) dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
4. Jour 4 : Pseudotyped Viral Particle Collection, Quantification, and Infectivity Testsay
- Collecte de particules virales pseudotypées
- Vérifiez la couleur du milieu. Idéalement, il devrait être rose clair ou légèrement orange. Examinez les cellules avec un microscope biologique fluorescent inversé sous 440-460 nm.
- À 36 à 48 h après la transtransfection, récoltez les pps en passant à travers un filtre à membrane de polyvinylide de polyvinylide de 0,45 m (PVDF) pour éliminer les débris cellulaires.
- Diviser les pps en petits volumes aliquots.
- Conserver les pps à -80 oC.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Cependant, cela n'est pas encouragé, parce que l'infectiosité des pps diminuera fortement après le gel et la décongélation.
- Quantification des particules virales pseudotypées
- Transférer 20 l de pps purifiés dans un tube microcentrifuge sans ribonuclage (RNase) de 1,5 ml.
- Ajouter 1 oL de 0,24 U/mL de nucléase de benzonase. Incuber à 37 oC pendant 1 h pour éliminer toute contamination par l'ADN et l'ARN.
REMARQUE : L'ARN cible, couramment régulé par cytomégalovirus (CMV)-GFP ARN, est emballé dans les pps et peut éviter d'être dégradé par la nucane de benzonase. - Congeler l'échantillon à -70 oC pour inactiver la nucane de benzonase.
- Ajouter 2 ll de protéinase K. Incubate à 50 oC pendant 30 min pour digérer les protéines de l'enveloppe et libérer l'ARN CMV-GFP. Inactiver la protéinase K à 100 oC pendant 3 min.
- Quantifier les pps par la transcription inversée quantitative en temps réel (qRT)-PCR avec un kit rt-qPCR de sonde universelle, en utilisant l'amorce avant 5'-AACAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', l'amorce inverse 5'-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3', et la sonde 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', sur un thermocycler PCR en temps réel. Normaliser les pps pour le numéro de copie d'ARN avant l'infectiosité.
- L'infection est à l'autre
- Diluer chaque type de pps en termes de données qRT-PCR à 4 x 105 copies/mL (p normalisation).
- Ajouter la tosyl-Phenylalanine Chloromethyl-Ketone (TPCK)-trypsine à une concentration finale de 40 g/mL en pps qui abritent H7N9 HA. Incuber à 37 oC pendant 1 h pour former ses sous-unités fonctionnelles HA1 et HA2.
REMARQUE: Il n'est pas nécessaire de traiter les pps qui abritent H5 avec TPCK-trypsin, parce qu'ils ont plusieurs résidus d'arginine et de lysine sur le site de clivage HA1-HA2. Ce site de clivage multi-basique peut être clivé par des protéases cellulaires omniprésentes. - Mélanger les pps normalisés avec le milieu DMEM (sans sérum) à un rapport 1:1 (volume/volume).
- Apportez la plaque contenant des cellules sensibles à l'armoire de biosécurité.
- Aspirer le supernatant et laver les cellules une fois avec 0,1 ml de PBS préchauffé.
- Ajouter 0,1 ml de mélange pps-DMEM à un puits. Tripler les tests d'infectiosité de chaque type de pps à une lignée cellulaire sensible (survu à la figure 2).
- Incuber la plaque de puits de 96 personnes pendant 4 à 6 h dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
- Aspirer le supernatant et remplacer par 0,1 ml de DCM.
- Incuber la plaque de puits 96 pendant 24 à 36 h dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
5. Jour 5 ou 6: Détection d'infectiosité
- Apportez la plaque de puits 96 à l'armoire de biosécurité.
- Aspirer le supernatant et laver les cellules 1x avec 0,2 ml de PBS préchauffé.
- Retirez pbS et dissoisez les cellules avec 0,1 ml de la solution trypsin-EDTA de 0,25%.
- Placer le plat dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 % pendant 3 min jusqu'à ce que les cellules soient dissociées.
REMARQUE: Évitez d'incuber pendant plus de 5 min, car cela conduira à l'agglutination cellulaire. - Désactiver la trypsine en ajoutant 0,4 ml de DCM.
- Dispersez les cellules en suspension monocellulaire en faisant monter et descendre plusieurs fois.
- Transférer les suspensions cellulaires dans un tube de microcentrifuge réfrigéré de 1,5 ml.
- Déterminer les cellules positives des reporters GFP avec fluorescence active de tri cellulaire (FACS).
REMARQUE : Pour déterminer le rapport entre les cellules cibles positives et les micro-femmes du GFP, fixez les portes cytométriques d'écoulement à l'aide des échantillons témoins (cellules A549 non traitées ou cellules MDCK), puis comptez les cellules reporteuses-positives gFP de 10 000 cellules par échantillon.
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Representative Results
Selon la procédure générale décrite ci-dessus, nous avons généré 10 types de pps combinant deux h/NA de groupe ou glycoprotéine vsV-G ou glycoprotéines sans enveloppe (indiquées dans le tableau 1). Sept d'entre eux sont infectieux. Les pps qui abritent de la glycoprotéine sans enveloppe ou qui n'abritent que NA n'ont montré aucune infectiosité ici. La procédure de production de la grippe pp est examinée à la figure 1. Les micrographies électroniques de transmission des pps (p. ex. H5N1pp) sont indiquées à la figure 3. Les résultats des tests d'infectiosité de ces pps sont indiqués à la figure 4. L'infectiosité des sept types de pps a été évaluée à une copie de génome par cellule (GCP) [semblable à la multiplicité de l'infection (MOI)] valeur de 20. Dans le groupe pps hébergeant H5, l'infectiosité du H5N1 (H5-N9) et du H5 était de 90,05 à 4,05 %, 17,78 , 1,58 %, 10,15 à 2,85 % pour la ligne cellulaire A549 et 40,37 , 4,92 %, 5,24 , 1,32 %, 4,88 % et 0,27 % pour MDCK, respectivement. Dans le groupe pps hébergeant H7, l'infectiosité de H7N9, (H7-N1), et H7 était de 10,45 - 2,35 %, 6,75 - 1,37 %, 1,23 - 0,33 % pour la ligne cellulaire A549 et 7,61 - 1,04 %, 4,12 , 1,29 %, 1,08 % pour 0,02 % respectivement. Pour les tests d'infectiosité des pps, en particulier HApp (H5pp, H7pp), neuraminidase exogène n'a pas été ajouté. Dans cet essai d'infectiosité, les cellules de MDCK ont été également employées comme ligne de cellule de commande pour tester l'infectiosité de pps. L'infectiosité de VSVGpp était de 20,9 à 2,00 % pour les cellules A549 et de 16,02 à 2,41 % pour les cellules MDCK. Les glycoprotéines delta-enveloppe pp (env pp) n'ont montré aucune infectiosité dans notre étude. Ces données ont également montré que les HA/NA provenant de diverses souches virales sont capables de générer avec succès des particules virales infectieuses. Pris ensemble, notre plate-forme de pseudotypage peut développer des particules virales pseudotypées infectieuses utilisées dans la recherche sur la grippe.
Figure 1 : Aperçu de la procédure de production de la grippe pp. (A) Le plasmide d'emballage pcDNA-Gag-pol, le plasmique du journaliste pcDNA-GFP, et l'enveloppe d'expression glycoprotéine plasmides pVRC-HA et pVRC-NA, sont cotransfected dans pp-producing HEK 293/17 cellules. (B) Dans les cellules HEK 293/17, les polyprotéines Gag-Pol sont synthétisées et transportées par un mécanisme inconnu jusqu'à la membrane cellulaire. Les glycoprotéines HA et NA sont transportées et ancrées sur la membrane cellulaire par la voie sécrétrice. Le plasmique de report pcDNA-GFP est transcrit dans l'ARN génomique mono-échoué. (C) Pendant ou après le transport, la protéine Gag-Pol recrute l'ARN génomique mono-échoué par l'intermédiaire des signaux d'emballage psi-ARN, formant ainsi les complexes pré-budding. (D) Le complexe assemblé Gag-pol--ARN induit la courbure de la membrane, conduisant à la formation d'un bourgeon. Pendant le bourgeonnement, l'enveloppe virale glycoprotéines HAs/NAs sont incorporées dans les particules naissantes. Le bourgeonnement est terminé lorsque la particule se détache de la membrane cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Arrangement global dans l'analyse d'infectiosité. Les tests d'infectiosité de chaque type de pps à une lignée cellulaire sensible ont été mesurés en triple. Les cellules humaines alvéolaires A549 et MDCK sont utilisées comme cellules sensibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Micrographies électroniques de transmission de pps. Supernatant non concentré (gauche) et concentré (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Infectivité des pps normalisés. L'infectiosité est présentée comme le pourcentage moyen d'écart-type (DD) des cellules infectées (n - 3). L'infectiosité des pps a été évaluée dans deux lignées cellulaires, les cellules A549 et MDCK. Sept types de pps ont montré divers profils d'infectiosité dans deux cellules cibles. Pps qui ne abritent NA ne sont pas montrés ici car ils n'ont pas manifesté d'infectiosité. Les pps qui abritent des glycoprotéines sans enveloppe (env) n'ont également montré aucune infectiosité dans notre étude. Le pourcentage d'infectieux a indiqué le rapport des cellules reporteuses-positives de GFP dans 10.000 cellules par échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| préparations plasmides | ||||||||||
| plasmide (L, 0,1 g/L) | H5N1 (H5N1) | (H5-N9) | H7N9 (h7N9) | (H7-N1) | H5 (h5) | N1 (en) | H7 H7 (h7) | N9 (en) | VSVG (EN) | Env |
| pcDNA-Gag-pol | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| PCDNA-GFP | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pVRC-HA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 2.14 | - | 2.14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | - | 2.14 | - | 2.14 | - | - |
| PCDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2.14 | - |
Tableau 1 : Combinaisons de protéines HA et NA dérivées des virus H5N1 et H7N9 et des quantités requises (volume) d'ADN plasmide pour une transfection de puits d'une plaque de 6 puits. Selon la concentration des préparations de plasmide, calculer le volume requis de chaque ADN plasmide. La quantité totale d'ADN plasmide pour la tranfection d'un puits est de 2,5 g. Pour obtenir l'efficacité de transfection la plus élevée et les effets non spécifiques les plus faibles, nous avons optimisé les conditions de transfection en variant les concentrations d'ADN plasmide et de réactif de tranfection. Après optimisation, le rapport des quatre quantités de plasmides a été fixé à 16:16:1:1. Le volume de réactif de transfection utilisé dans une transfection de puits d'une plaque de puits de 6 est de 8 L (non indiqué dans le tableau). Deux HAs et deux NA des virus H5N1 et H7N9 peuvent être utilisés pour générer huit types de pps : H5N1pp, (H5 et N9)pp, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 - N1)pp, H7pp et N9pp. Les pps qui abritent des glycoprotéines sans enveloppe (env) ou qui abritent uniquement des glycoprotéines NA n'ont montré aucune infectiosité dans notre étude.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour produire des particules pseudotypées de virus de grippe (pp) dans un arrangement de BSL-2. Le plasmique du plasmique pcDNA-GFP est incorporé dans les pps et peut être utilisé pour quantifier les pps par FACS dans un test d'infectiosité. Nous avons choisi deux types de lignées cellulaires sensibles parce qu'elles sont largement utilisées dans la recherche sur l'influenza. Les cellules MDCK fourniraient un bon contrôle aux cellules humaines immortalisées variables utilisées dans ces études.
Ce protocole est basé sur le rétrovirus MLV, qui peut incorporer un journaliste GFP et produire des bourgeons sur la membrane cellulaire. Cette technique a été largement développée pour l'emballage des particules de virus de la grippe4,22,23,24. Certains autres systèmes sont basés sur le système de pseudotypage lentiviral VIH-119,25,26 ou le système d'expression des cellules baculovirus-insectes27,28,29. Beaucoup d'autres gènes de journaliste ont également été employés pour la production de pseudoparticules, tels que la luciferase (luminescence)30,31,32,33, -gal/LacZ (par colorimétrie)34,35, et sécrété la phosphatase alcaline36,37. Millet et coll. ont utilisé l'analyse de la luciferase pour quantifier l'infectiosité des particules pseudotypées de coronavirus33. Comparé e à la luciferase, la fluorescence verte de GFP est facilement observée avec un microscope biologique fluorescent inversé. C'est un moyen pratique de vérifier l'efficacité de la transfection et de l'infection. Pour cette étude, l'infectiosité peut être déterminée directement en détectant les cellules GFP-positives avec FACS.
Dans cette méthode, plusieurs étapes affectent de façon critique les résultats. L'optimisation de la densité cellulaire est un facteur critique pour une transfection réussie. Dans ce protocole, une densité cellulaire de l'ordre de 80 à 90 % de confluents s'est avérée optimale pour la production de pp du virus de l'influenza. Une densité cellulaire plus élevée ou plus faible se traduira par une efficacité de transfection plus faible. Un bon état physiologique des cellules productrices est également très important pour la production de particules élevées. C'est pourquoi le passage inférieur de cellules HEK 293T/17 cellules sont recommandés pour produire des pps dans ce protocole. En outre, le volume de réactif de transfection et le rapport des quatre quantités de plasmides peuvent également affecter l'efficacité de la transfection. Pour obtenir l'efficacité de transfection la plus élevée, il est recommandé d'optimiser ces facteurs en variant et en testant leur quantité. Nous avons fixé le rapport de quatre quantités de plasmides comme 16:16:1:1 et le volume de réactif de transfection comme 8 L pour une tranfection de puits dans une plaque de 6 puits. Un autre problème est la manipulation des cellules. Les cellules HEK 293T/17producer sont à faible adhérence, de sorte que la manipulation manuelle des cellules doit être très douce. Lipofection peut conduire à une augmentation de la perméabilité cellulaire, et le sérum et les anticorps dans le milieu peut augmenter la cytotoxicité. Il est préférable d'utiliser des cellules HEK 293T/17 sans sérum et sans anticorps pour la culture des cellules HEK 293T/17 post-transfectes. En outre, le temps de collecte est important. À 36-48 h après la transfection, la couleur du supernatant cellulaire doit être vérifiée pour s'assurer qu'il est rose ou orange-rose avant la collecte pp. Le supernatant jaune indique que le milieu est trop acide pour soutenir la croissance cellulaire et conduit habituellement à de mauvais rendements pp.
Nous avons effectué l'exemple de transfection dans une plaque de 6 puits. Pour obtenir plus de volume pp le nombre de puits de transfection peut être augmenté et les supernatants qui contiennent les mêmes pps peuvent être mis en commun. Alternativement, un autre type de navires peut être utilisé pour augmenter le rendement pp. Par exemple, 18 l de réactif de transfection et 5,5 g d'ADN plasmide peuvent être utilisés pour effectuer la transfection avec 2,2 x 106 cellules dans un plat de 60 mm. De même, un analyse d'infectiosité peut être effectué dans une plaque de 24 puits.
Le succès de cette technique peut être influencé par de nombreux facteurs. Par conséquent, la procédure doit être optimisée pour l'emballage des particules de différents types de virus.
Dans ce protocole, des particules virales pseudotypées de HPAI H5N1 et H7N9, ainsi que leurs réassortis, ont été générées. Dans cette méthode, nous utilisons qRT-PCR de l'ARN GFP dans l'analyse d'infectiosité au niveau unicellulaire (comme copies du génome par cellule) au lieu de la culture tissulaire Dose infectieuse 50 (TCID50) ou traditionnel MOI23,38,39. Les méthodes de titration d'infectiosité de virus sont basées sur des essais de plaque ou des essais de TCID50, qui sont à la fois longs et laborieux. Les deux essais reposent sur la mesure des effets cytopathiques visibles (CPE) causés par l'infection virale dans les lignées cellulaires, de sorte qu'il peut être difficile de titrer les virus de faible infectiosité (c.-à-d., H7pp dans cette étude). Nous pensons que c'est une méthode commode, efficace, et rapide pour normaliser des pps avec qRT-PCR de l'ARN de GFP contenu dans les pps de grippe.
Pris ensemble, notre technique est sûre et adaptable, et peut être utilisée pour étudier les virus enveloppés, y compris leurs récepteurs, tropismes, fonction de glycoprotéine enveloppe, neutralisant les anticorps, le développement de médicaments antivirus, le diagnostic, et la conception de vaccins et Évaluation.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science et Projet clé technologique (Grant Numbers, 2014Z11) et Projet municipal d'application autonome de Hangzhou de développement social et de recherche scientifique (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
