यह प्रोटोकॉल दो इंफ्लूएंजा ए उपभेदों से लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के साथ उच्च-टिटर संक्रामक वायरल छद्म कणों (पीपी) का उत्पादन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है और उनकी संक्रामकता को कैसे निर्धारित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन के साथ किसी भी अन्य प्रकार के लिफाफे वाले वायरस के पीपीएस को विकसित करने के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है।
अत्यधिक रोगजनक एवियन इंफ्लूएंजा ए वायरस H5N1 (HPAI H5N1) और मनुष्यों के लिए H7N9 और उनकी घातकता के सामयिक प्रत्यक्ष संचरण गंभीर सार्वजनिक स्वास्थ्य के मुद्दों और एक महामारी की संभावना का सुझाव है । हालांकि, वायरस के बारे में हमारी आणविक समझ प्रारंभिक है, और यह चिकित्सकीय लक्ष्यों के रूप में अपने लिफाफा प्रोटीन के जैविक गुणों का अध्ययन करने के लिए और संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए रणनीतियों को विकसित करने के लिए आवश्यक है । हमने एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस का अध्ययन करने के लिए एक ठोस वायरल छद्म कण (पीपी) मंच विकसित किया, जिसमें इसके हेमग्ग्लूटिनिन (एचए) और न्यूरामिनिड्स (एनए) लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन, एचएएस और एनआईएस की पुनर्वर्गीकरण विशेषताओं का कार्यात्मक विश्लेषण शामिल है, दवा विकास और वैक्सीन डिजाइन के प्रयोजनों के लिए रिसेप्टर्स, ट्रोपिज्म, एंटीबॉडी, निदान, संक्रमितता को बेअसर करना। यहां, हम दो इंफ्लूएंजा ए उपभेदों (HAPI H5N1 और 2013 एवियन एच7एन9) से लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (एचए, एनए) के साथ पीपीएस स्थापित करने के लिए एक प्रायोगिक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। उनकी पीढ़ी कुछ वायरस की क्षमता पर आधारित है, जैसे कि मूत्र ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी), लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन को पीपी में शामिल करने के लिए। इसके अलावा, हम यह भी विस्तार करते हैं कि इन पीपीएस को आरटी-क्यूपीसीआर के साथ कैसे निर्धारित किया जाता है, और एचएएस और एनआईएस की उत्पत्ति के आधार पर देशी और बेमेल वायरस पीपीएस का संक्रमितता का पता लगाया जाता है। यह प्रणाली अत्यधिक लचीला और अनुकूलनीय है और इसका उपयोग लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के साथ वायरल पीपीएस स्थापित करने के लिए किया जा सकता है जिसे किसी अन्य प्रकार के वायरस में शामिल किया जा सकता है। इस प्रकार, इस वायरल कण मंच कई शोध जांच में जंगली वायरस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एक वायरल कण का मिशन संक्रमित मेजबान कोशिका से अपने जीनोम को गैर-संक्रमित मेजबान कोशिका तक ले जाना और इसे प्रतिकृति-सक्षम रूप1में साइटोप्लाज्म या नाभिक में वितरित करना है। यह प्रक्रिया शुरू में सेल रिसेप्टर्स की मेजबानी के लिए बाध्यकारी द्वारा ट्रिगर की जाती है, जिसके बाद विरोन और सेलुलर झिल्ली का संलयन होता है। इन्फ्लूएंजा वायरस की तरह लिफाफे वाले वायरस के लिए, स्पाइक ग्लाइकोप्रोटीन रिसेप्टर बाइंडिंग और फ्यूजन1,2के लिए जिम्मेदार हैं। वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (उदाहरण के लिए, पायजेन्स, एंटीजन), वायरस लाइफसाइकिल दीक्षा (बाध्यकारी और संलयन), वायरल रोगजनन, इम्यूनोजेनिकिटी, होस्ट सेल एपोप्टोसिस और सेलुलर ट्रोपिज्म, सेलुलर एंडोसाइटिक पाथवे, साथ ही इंटरस्पीट्स ट्रांसमिशन और रेसॉर्टमेंट1,3,4,5,6,7जैसे कई महत्वपूर्ण गुणों और घटनाओं में शामिल हैं । वायरल लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन पर शोध से हमें वायरल इंफेक्शन प्रक्रिया के कई पहलुओं को समझने में मदद मिलेगी। छद्म टाइप किए गए वायरल कण (पीपी), जिसे छद्म विग्रह या छद्म लेख भी कहा जाता है, को छद्म टाइपिंग तकनीक8,9,10के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग हेपेटाइटिस सी11,12,हेपेटाइटिस बी13,वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस (वीएसवी)14,15और इन्फ्लूएंजा वायरस16,17, 18,19सहित कई वायरसों के छद्म कणों को विकसित करने के लिए किया गया है । यह तकनीक लेंटिवायरस या अन्य रेट्रोवायरस के गैग-पोल प्रोटीन पर आधारित है।
छद्म टाइप किए गए वायरल कणों को वायरल लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड, एक रेट्रोवायरल पैकेजिंग प्लाज्मिड को लिफाफा एनवी जीन गायब करके तीन-प्लाज्मिड सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, और पीपी निर्माता कोशिकाओं में एक अलग रिपोर्टर प्लाज्मिड। रेट्रोवायरस अपने गैग प्रोटीन द्वारा इकट्ठा किया जाता है, और यह एक संक्रमित कोशिका झिल्ली से कलियों को व्यक्त करता है जो वायरस लिफाफा प्रोटीन1को व्यक्त करता है। इसलिए, इन्फ्लूएंजा एचए और एनए व्यक्त करने वाली सेलुलर झिल्ली पर कलियों का उत्पादन करने के लिए रेट्रोवायरस गैग प्रोटीन का उपयोग करके उच्च टिटर इन्फ्लूएंजा पीपीएस प्राप्त करना संभव है। हमारे पिछले अध्ययनों में, सभी संयोजनों में एचएएस/एनआईएस कार्यात्मक थे और वायरल जीवन चक्र16,17,18,20, 21में अपने इसी कार्यों को करने में सक्षम थे । इन पीपीएस का उपयोग इन्फ्लूएंजा जैविक विशेषताओं की जांच करने के लिए किया जाता है, जिसमें हेमग्ग्लूटिनेशन, न्यूरामिनिड्स गतिविधि, एचए-रिसेप्टर बाध्यकारी ट्रोपिज्म और संक्रमितता शामिल हैं। क्योंकि एचए और एनए वायरल जीवन चक्र में महत्वपूर्ण सतह कार्यात्मक प्रोटीन हैं, इंफ्लूएंजा के विभिन्न उपभेदों से प्राप्त बेमेल हास और नास आंशिक रूप से उनदोनों के बीच पुनर्वर्गीकरण प्रदर्शित कर सकते हैं । यहां, हम तीन-प्लाज्मिड छद्म टाइपिंग सिस्टम का उपयोग करके दो एचए और दो एनआईए (एचपीएआई एच5एन1 स्ट्रेन और एच7एन9 दाग से व्युत्पन्न) के संयोजन से आठ प्रकार के इन्फ्लूएंजा पीपीएस उत्पन्न करते हैं। इन आठ प्रकार के पीपीएस में दो देशी पीपीएस, एच5एन1पीपी, एच7एन9पीपी शामिल हैं; दो बेमेल पीपीएस, (H5 +N9) पीपी, (H7 +N1) पीपी; और चार पीपीएस केवल एक ही ग्लाइकोप्रोटीन (एचए या एनए), एच5पीपी, एन1पीपी, एच7पीपी, एन9पीपी को शरण देते हैं । एच5एन1 और एच7एन9 जैसे इंफ्लूएंजा वायरस पर अध्ययन, जैव सुरक्षा आवश्यकताओं द्वारा सीमित हैं । जंगली इन्फ्लूएंजा वायरस उपभेदों के सभी अध्ययनों को जैव सुरक्षा स्तर 3 (बीएसएल-3) प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए। छद्म टाइप वायरल पार्टिकल तकनीक का उपयोग बायोसेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल-2) सेटिंग में कृत्रिम विरियन को पैकेज करने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, पीपीएस अपने दो प्रमुख ग्लाइकोप्रोटीन के आधार पर इन्फ्लूएंजा वायरस प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक सुरक्षित और उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं: हेमैगग्लूटिनिन (एचए) और न्यूरामिनिडसे (एनए)।
यह प्रोटोकॉल तीन-प्लाज्मिड कॉट्रांसफेक्शन रणनीति (चित्रा 1में अवलोकन), पीपीएस की मात्रा कैसे निर्धारित करना है, और संक्रमण का पता लगाने के साथ इन पीपीएस की पीढ़ी का वर्णन करता है। पीपी उत्पादन में तीन प्रकार के प्लाज्मिड(चित्रा 1)शामिल हैं। गैग-पोल जीन, जो रेट्रोवायरस गैग-पोल प्रोटीन को एन्कोड करता है, को रेट्रोवायरस पैकेजिंग किट से क्लोन किया गया था और पीसीडीएनए ३.१ प्लाज्मिड में डाला गया था और pcDNA-Gag-Pol नाम दिया गया था । उन्नत ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) जीन, जो ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एन्कोड करता है, को PTRE-EGFP वेक्टर से क्लोन किया गया था, जिसे पीसीडीएनए 3.1 प्लाज्मिड में डाला गया था, और जिसे पीसीडीएनए-जीएफपी कहा जाता है। क्लोनिंग के दौरान, एक प्राइमर के माध्यम से एक पैकेजिंग सिग्नल () अनुक्रम जोड़ा गया था। एचए और एनए जीन को क्रमशः पीवीआरसी प्लाज्मिड में क्लोन किया गया, जिसका नाम क्रमश पीवीआरसी-एचए और पीवीआरसी-एनए था । पिछले प्लाज्मिड फ्यूजन प्रोटीन को एन्कोड करता है और इसे ब्याज के किसी अन्य फ्यूजन प्रोटीन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हमारे छद्म टाइपिंग प्लेटफॉर्म में दो ग्लाइकोप्रोटीन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड्स शामिल हैं: पीवीआरसी-एचए और पीवीआरसी-एनए। यह बीएसएल-2 सेटिंग में विभिन्न वायरस उपभेदों के बीच पुनर्वर्गीकरण पर अनुसंधान को सरल बना सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम बीएसएल-2 सेटिंग में इन्फ्लूएंजा वायरस छद्म कणों (पीपी) का उत्पादन करने की विधि का वर्णन करते हैं। रिपोर्टर प्लाज्मिड pcDNA-GFP पीपीएस में शामिल है और एक संक्रमित परख में FACS द्वारा पीपीएस क?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को झेजियांग प्रांतीय चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (अनुदान संख्या, २०१७KY538), हांग्जो म्यूनिसिपल मेडिसिन एंड हेल्थ साइंस एंड टेक्नोलॉजी प्लान (ग्रांट नंबर, OO20190070), हांग्जो मेडिकल साइंस और से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था प्रौद्योगिकी प्रमुख परियोजना (ग्रांट नंबर, 2014Z11) और हांग्जो नगरपालिका स्वायत्त अनुप्रयोग सामाजिक विकास और वैज्ञानिक अनुसंधान (ग्रांट नंबर, 20191203B134) की स्वायत्त अनुप्रयोग परियोजना।
Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |