Denne protokol beskriver en eksperimentel proces til fremstilling af infektiøse virale pseudo skrevne partikler (PP) med kuvert glycoproteiner fra to influenza A-stammer, og hvordan deres infektionsevne kan bestemmes. Denne protokol er meget tilpasningsdygtig til at udvikle PPS af enhver anden type kappeklædte vira med forskellige konvolut glycoproteiner.
Lejlighedsvis direkte overførsel af højpatogen aviær influenza A-virus H5N1 (HPAI H5N1) og H7N9 til mennesker og deres dødelighed er alvorlige folkesundhedsproblemer og antyder muligheden for en epidemi. Men vores molekylære forståelse af virussen er rudimentær, og det er nødvendigt at studere de biologiske egenskaber af dens konvolut proteiner som terapeutiske mål og udvikle strategier til at kontrollere infektion. Vi udviklede en solid viral pseudo-type partikel (PP)-platform til at studere aviær influenzavirus, herunder den funktionelle analyse af dens hemagglutinin (HA) og neuraminidasetypen (Na) konvolut glycoproteiner, resortiments egenskaberne af HAs og NAs, receptorer, tropismer, neutraliserende antistoffer, diagnose, infektivitet, med henblik på narkotika udvikling og vaccine design. Her beskriver vi en eksperimentel procedure for at etablere PPS med kuvert glycoproteiner (HA, NA) fra to influenza A-stammer (HAPI H5N1 og 2013 aviær H7N9). Deres generation er baseret på kapaciteten af nogle vira, såsom murine leukæmivirus (MLV), at indarbejde kuvert glycoproteiner i en PP. Desuden er vi også detaljeret, hvordan disse PPS er kvantificeret med RT-qPCR, og infektivitet påvisning af indfødte og uoverensstemmende virus PPS afhængigt af oprindelsen af HAs og NAs. Dette system er meget fleksibelt og tilpasningsdygtigt og kan bruges til at etablere virale PPS med kuvert glycoproteiner, der kan inkorporeres i enhver anden form for kappeklædte virus. Således kan denne viral partikel platform bruges til at studere vilde vira i mange forskningsundersøgelser.
Missionen af en viral partikel er at transportere sit genom fra en inficeret værtscelle til en ikke-inficeret værtscelle og at levere den til cytoplasmaet eller kernen i en replikeringskompetent formular1. Denne proces er oprindeligt udløst af binding til Host celle receptorer, efterfulgt af fusion af virion og cellulære membraner. For kappeklædte vira, som influenzavirus, er Spike glycoproteiner ansvarlig for receptor binding og fusion1,2. Viral konvolut glycoproteiner (f. eks. pyrogener, antigener), er involveret i mange vigtige egenskaber og begivenheder, såsom virus livscyklus initiering (binding og fusion), viral patogenese, immunogenicitet, Host Cell apoptose og cellulære tropisme, den cellulære endocytic pathway, samt interspecies transmission og resortiments1,3,4,5,6,7. Forskning på viral konvolut glycoproteiner vil hjælpe os med at forstå mange aspekter af den virale infektions proces. Pseudo-skrevne virale partikler (PP), også kaldet pseudovirioner eller pseudopartikler, kan genereres gennem en pseudotyping Technique8,9,10. Denne teknologi er blevet brugt til at udvikle pseudo-skrevne partikler af mange vira, herunder hepatitis C11,12, hepatitis B13, vesikulær stomatitis virus (VSV)14,15og influenzavirus16,17,18,19. Denne teknologi er baseret på gag-pol protein af lentivira eller andre retrovira.
Pseudoskrevne virale partikler kan opnås ved hjælp af et tre-plasmid-system ved at cotransfficerer en viral konvolut glykoprotein ekspression plasmid, en antiretroviral emballage plasmid mangler konvolutten env genet, og en separat reporter plasmid i PP producer celler. Retrovirus er samlet af dens gag protein, og det knopper fra en inficeret celle membran, der udtrykker virus konvolut protein1. Derfor er det muligt at opnå høj titer influenza PPS ved hjælp af retrovirus gag protein til at producere knopper på en cellulær membran, der udtrykker influenza HA og NA. I vores tidligere undersøgelser, har/NAS i alle kombinationer var funktionelle og i stand til at udføre deres tilsvarende funktioner i viral livscyklus16,17,18,20,21. Disse KKS anvendes til at undersøge influenza biologiske egenskaber, herunder hemagglutination, neuraminidaseaktivitet, HA-receptor bindende tropisme og infektivitet. Fordi HA og NA begge er vigtige overflade funktionelle proteiner i den virale livscyklus, har uoverensstemmende og NAs afledt af forskellige stammer af influenza delvist kan demonstrere resortiments mellem dem. Her genererer vi otte typer af influenza PPS ved at kombinere to har og to NAs (afledt af HPAI H5N1 stamme og H7N9 Stain), ved hjælp af en tre-plasmid pseudotyping system. Disse otte typer PPS omfatter to Native PPS, H5N1pp, H7N9pp; to uoverensstemmende KKS (H5 + N9) PP, (H7 + N1) PP; og fire PPS kun harkedeligt en enkelt glykoprotein (ha eller na), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. undersøgelser af influenzavirus, såsom H5N1 og H7N9, er begrænset af biosikkerhedskrav. Alle undersøgelser af vilde influenzavirusstammer bør udføres på et biosikkerhedsniveau 3 (BSL-3) laboratorium. Pseudotyp viral partikel teknologi kan bruges til at pakke en kunstig virion i en biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) indstilling. Derfor er PPS et sikrere og nyttigt redskab til at studere influenzavirus processer afhængigt af dens to store glycoproteiner: hemagglutinin (HA) og neuraminidasetypen (Na).
Denne protokol beskriver genereringen af disse PPS med en tre-plasmid cotransfection strategi (oversete i figur 1), hvordan man kvantificerer PPS, og infektivitet påvisning. PP-produktionen involverer tre typer plasmid’er (figur 1). Gag-pol genet, som koder retrovirus gag-pol protein, blev klonet fra en retrovirus emballage kit og indsat i pcdna 3,1 plasmid og hedder Pcdna-gag-pol. Det forbedrede grønne fluorescerende protein (eGFP)-gen, som koder grønt fluorescerende protein, blev klonet fra pTRE-EGFP-vektor, indsat i pcDNA 3,1 plasmid, og kaldet pcDNA-GFP. Under kloning blev en pakke signal sekvens tilføjet via en primer. HA-og NA-gener blev klonet ind i en pVRC-plasmid, der blev henholdsvis pVRC-HA og pVRC-NA. Det sidste plasmid koder fusions proteinet og kan udskiftes med ethvert andet fusionsprotein af interesse. Vores pseudo Typing platform indeholder to glykoprotein udtryks plasmider: pvrc-ha og pvrc-na. Dette kan forenkle forskningen i omsortimentet mellem forskellige virusstammer i en BSL-2-indstilling.
I denne protokol beskriver vi en metode til fremstilling af pseudo-viruspartikler (PP) i en BSL-2-indstilling. Indberetteren plasmid pcDNA-GFP er indarbejdet i PPS og kan anvendes til at kvantificere KKS ved FACER i en infektivitetsanalyse. Vi valgte to typer af modtagelige cellelinjer, fordi de er meget udbredt i influenza forskning. Mdck celler ville give en god kontrol til de variable udødeliggjort humane celler, der anvendes i disse undersøgelser.
Denne protokol er baseret på retrovirus…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Zhejiang Provincial medicin og sundhed videnskab og teknologiplan (Grant numre, 2017KY538), Hangzhou kommunale medicin og sundhed videnskab og teknologiplan (Grant numre, OO20190070), Hangzhou Medical Science og Teknologi nøgleprojekt (tilskuds numre, 2014Z11) og Hangzhou Municipal selvstændigt applikations projekt for social udvikling og videnskabelig forskning (tilskuds numre, 20191203B134).
Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |