Summary
このプロトコルは、2つのインフルエンザA株からエンベロープ糖タンパク質を有する高力性ウイルス性偽型粒子(pp)を生成する実験プロセスと、その感染性を決定する方法を記述する。このプロトコルは、異なるエンベロープ糖タンパク質を持つエンベロープウイルスの他のタイプのppsを開発するために非常に適応性があります。
Abstract
高病原性鳥インフルエンザA型ウイルスH5N1(HPAI H5N1)及びH7N9のヒト及びその致死性の時折の直接感染は、深刻な公衆衛生上の問題であり、流行の可能性を示唆している。しかし、ウイルスの分子理解は初歩的であり、そのエンベロープタンパク質の生物学的性質を治療標的として研究し、感染を制御する戦略を開発する必要があります。ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)エンベロープ糖タンパク質の機能解析、HAおよびNAの再種化特性を含む鳥インフルエンザウイルスを研究するための固体ウイルス擬似型粒子(pp)プラットフォームを開発し、受容体は、栄養、中和抗体、診断、感染性、薬剤開発およびワクチン設計の目的で。ここでは、2つのインフルエンザA型(HAPI H5N1および2013鳥類H7N9)からエンベロープ糖タンパク質(HA,NA)を用いてppsを確立するための実験手順について説明する。彼らの世代は、マウス白血病ウイルス(MLV)のようないくつかのウイルスの容量に基づいて、エンベロープ糖タンパク質をppに組み込む。さらに、これらのppsをRT-qPCRで定量化する方法、およびHとNの起源に応じてネイティブおよび不一致のウイルスppsの感染性検出についても詳しく説明します。このシステムは非常に柔軟で適応性があり、エンベロープドコードタンパク質を持つウイルスppsを確立するために使用することができます。したがって、このウイルス粒子プラットフォームは、多くの研究研究で野生ウイルスを研究するために使用することができます。
Introduction
ウイルス粒子の使命は、感染した宿主細胞から非感染宿主細胞にそのゲノムを輸送し、それを複製能力のある形態1の細胞質または核に送達することである。このプロセスは、最初は宿主細胞受容体への結合によって引き起こされ、続いてビリオンと細胞膜の融合が続く。インフルエンザウイルスのようなエンベロープウイルスの場合、スパイク糖タンパク質は受容体結合および融合1、2を担う。ウイルスエンベロープ糖タンパク質(例えば、パイロゲン、抗原)は、ウイルスライフサイクル開始(結合および融合)、ウイルス病因、免疫原性、宿主細胞アポトーシスおよび細胞トロピズム、細胞内分泌経路、ならびに種間の伝染および再分類など、多くの重要な特性および事象に関与している。ウイルスエンベロープ糖タンパク質に関する研究は、ウイルス感染プロセスの多くの側面を理解するのに役立ちます。擬似型ウイルス粒子(pp)は、擬似ウイルスまたは擬似粒子とも呼ばれ、擬似タイピング技術8、9、10を介して生成することができる。この技術は、C型肝炎11、12、B型肝炎13、小胞性口内炎ウイルス(VSV)14、15、およびインフルエンザウイルス16、17、18、19を含む多くのウイルスの擬似型粒子を開発するために使用されている。この技術は、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスのGag-Polタンパク質に基づいています。
擬似型ウイルス粒子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質発現プラスミドをコトランスフェクションすることにより3プラスミド系を用いて得ることができ、エンベロープenv遺伝子を欠損させるレトロウイルス包装プラスミド、およびppプロデューサー細胞に別のレポータープラスミドを得ることができる。レトロウイルスは、そのGagタンパク質によって組み立てられ、ウイルスエンベロープタンパク質1を発現する感染細胞膜から芽を出す。従って、レトロウイルスギャグタンパク質を用いて高力インフルエンザppsを得て、インフルエンザHAおよびNAを発現する細胞膜上に芽を生成することができる。これまでの研究では、すべての組み合わせにおけるHA/NAは機能的であり、ウイルスライフサイクル16、17、18、20、21で対応する機能を実行することができました。これらのppsは、ヘマグルチン酸、ノイラミニダーゼ活性、HA受容体結合トロピズム、および感染性を含むインフルエンザの生物学的特性を調べるために使用されます。HAとNAはいずれもウイルスのライフサイクルにおいて重要な表面機能タンパク質であるため、異なるインフルエンザに由来するHAとNAの不一致は、それらの間の再分け合いを部分的に示すことができる。ここでは、3プラスミド擬似タイピングシステムを用いて、2つのHAと2つのNA(HPAI H5N1株とH7N9染色に由来する)を組み合わせて8種類のインフルエンザppsを生成します。ppsのこれらの8つのタイプは、2つのネイティブpps、H5N1pp、H7N9ppが含まれています。2 つの不一致の pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp;1つの糖タンパク質(HAまたはNA)のみを収容する4つのpps、H5pp、N1pp、H7pp、N9pp.インフルエンザウイルスに関する研究、H5N1およびH7N9などの、バイオセーフティ要件によって制限される。野生インフルエンザウイルス株のすべての研究は、バイオセーフティレベル3(BSL-3)実験室で行われるべきである。擬似型ウイルス粒子技術は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)設定で人工ビリオンをパッケージ化するために使用することができます。したがって、ppsは、ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)の2つの主要な糖タンパク質に応じてインフルエンザウイルスプロセスを研究するためのより安全で有用なツールを表します。
このプロトコルは、3プラスミドコトランスフェクション戦略(図1で概観)を用いたこれらのppsの生成、ppsの定量方法、および感染性検出について説明する。ppの生産には3種類のプラスミドが含まれます(図1)。レトロウイルスGag-Polタンパク質をコードするgag-pol遺伝子をレトロウイルス包装キットからクローニングし、pcDNA 3.1プラスミドに挿入し、pcDNA-Gag-Polと名付けました。緑色蛍光タンパク質をコードする強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子をpTRE-EGFPベクターからクローニングし、pcDNA 3.1プラスミドに挿入し、pcDNA-GFPと呼んだ。クローニング中に、プライマーを介して包装シグナル(ƒ)配列を追加した。HA遺伝子およびNA遺伝子を、それぞれpVRC-HAおよびpVRC-NAと名付けられたpVRCプラスミドにクローニングした。最後のプラスミドは融合タンパク質をコードし、目的の他の融合タンパク質と置き換えることができます。当社の擬似タイピングプラットフォームには、pVRC-HAとpVRC-NAの2つの糖タンパク質発現プラスミドが含まれています。これにより、BSL-2設定における異なるウイルス株間の再種合けに関する研究を簡素化することができます。
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Protocol
1. 1日目:細胞培養と播種
- 10%胎児ウシ血清(FBS)および100 U/mLペニシリンストレプトマイシン(DMEMコンプリートミディアム)を添加したダルベッコの変性必須培地(DMEM)を用いて、60mm皿でヒト胚性腎臓(HEK)293T/17細胞を培養し、 DCM)を37ωで、5%の二酸化炭素(CO2)インキュベーターを約80%のコンフルエントまでインキュベートする。
注:HEK 293T/17低通路セルをお勧めします。 - 5 mL のリン酸緩衝生理食塩糸 (PBS) 1x で細胞を慎重に洗浄します。
メモ:HEK 293T/17セルの手動処理は、取り外しが容易なため、非常に穏やかでなければなりません。 - PBSを除去し、1 mLのトリプシンエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)溶液で細胞を解離します。37°C、5%CO2インキュベーターに入れ、細胞が解解けになるまで5分以内に入れます。
- DCM を 5 mL 追加してトリプシンを非アクティブ化します。細胞を上下に数回ピペットで単一細胞懸濁液に分散させます。
- 細胞懸濁液をプレチルド15mL遠心管に移す。4°Cで5分間、250 x gで遠心分離して細胞を採取する。
- 可能な限り多くの上清をデカントします。6 mL の DCM 培地で細胞ペレットを再サスペンドし、細胞をカウントします。DCM培地で細胞を1 x 106セル/mLに希釈します。
- 細胞をウェルあたり1mLの細胞懸濁液を用いた6ウェルプレートにシードします。プレートを軽くたたいて、細胞を均等に分配します。プレートを37°C、5%CO2インキュベーターで一晩(14~16時間)インキュベートします。
2. 2日目:リポフェクションによる4プラスミドコトランスフェクション
- 反転光顕微鏡で細胞の形態と密度を確認します。理想的には、細胞はトランスフェクション時に約85%のコンフルエントである必要があります。ウェルあたり1mLの無血清DMEM培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻します。
メモ:HEK 293T/17セルの手動処理は、取り外しが容易なため、非常に穏やかでなければなりません。 - トランスフェクトされる培養細胞のウェルごとに、トランスフェクション試薬の8μLを還元血清培地(チューブ1)で150μLの体積に希釈する。穏やかに混合し、室温で5分間インキュベート(RT、約20°C)。
注:トランスフェクションサンプルごとに、1.5 mLマイクロ遠心チューブを2本用意し、1と2を番号付けします。 - チューブ2では、プラスミドDNAの2.5μgを還元血清培地の150μLに希釈する。
注:チューブ2において、表1に示すように各プラスミドDNAを希釈する。VSVは広範囲の細胞に感染できるため、小胞性口内炎ウイルス(VSV)G糖タンパク質(プラスミドpLP-VSVG)をコードするプラスミドが陽性対照として用いられた。インフルエンザエンベロープ糖タンパク質を欠く負の対照粒子(Δenv pps)は、pcDNA-Gag-PolおよびpcDNA-GFPプラスミドを用いて生成した。 - 5分インキュベーション後、希釈したDNAと希釈トランスフェクション試薬を組み合わせます。穏やかに混ぜ、RTでさらに15分間インキュベートします。
- 細胞および無血清培地を含む対応するウェルにDNA脂質複合体を添加する。プレートを前後に揺らして軽く混ぜます。
- 37°Cで4~6時間インキュベートした後、5%CO2インキュベーターを取り出し、培地を取り出し、DMEMを2mLに交換します。37°、5%CO2インキュベーターでさらに36〜48時間インキュベートします。
注:無血清および抗体フリーのDMEMに交換してください。このプロトコルでは、2 つの HA と 2 つのナサを使用して 8 種類の pps を生成できます (表 1を参照)。
3. 3日目:影響を受けやすい細胞の播種
- 感染性アッセイのために、96ウェルプレートでウェル当たり1 x 104細胞で各タイプの感受性細胞を播種する。
注:この記事では、歯槽由来ヒト細胞株(A549細胞)とマディンダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞の2種類の標的細胞を使用して感染性アッセイを行います。MDCK細胞はインフルエンザの研究に広く用いられており、良好なコントロールとなり得る。この手順は柔軟です。他の標的細胞株は、研究要件に従って使用することができます。 - プレートを37°C、5%CO2インキュベーターで一晩(14~16時間)インキュベートします。
4. 4日目:擬似型ウイルス粒子採取、定量、感染性アッセイ
- 擬似型ウイルス粒子採取
- メディアの色を確認します。理想的には、薄いピンクまたはわずかにオレンジでなければなりません。440~460nm以下の反転蛍光生物学的顕微鏡で細胞を調べます。
- 36~48時間の経形で、0.45μmのポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜フィルターを通過してppsを収穫し、細胞破片を除去します。
- ppsを小さなボリュームのアリコートに分割します。
- ppsは-80°Cで保管してください。
注: プロトコルはここで一時停止できます。しかし、PPSの感染性は凍結および解凍後に急激に低下するので、これは推奨されません。
- 擬似型ウイルス粒子定量
- 精製ppsの20μLを1.5mLリボヌクレアーゼ(RNase)フリーマイクロ遠心管に移す。
- 0.24 U/mLベンゾナスヌクレアーゼを1μL加えます。37°Cで1時間インキュベートし、DNAおよびRNA汚染を排除します。
注:標的RNAは、一般的にダウンレギュレートされたサイトメガロウイルス(CMV)-GFP RNAは、ppsにパッケージ化されており、ベンゾナーゼヌクレアーゼによって分解されることを避けることができます。 - 試料を-70°Cで凍結し、ベンゾニンゼヌクレアーゼを不活性化します。
- 50分間50°Cで2μLのプロテイナーゼK.インキュベートを加えてエンベロープタンパク質を消化し、CMV-GFP RNAを放出します。プロテイナーゼKを100°Cで3分間不活性化する。
- ユニバーサルプローブワンステップRT-qPCRキットを使用したリアルタイム定量逆転写(qRT)-PCRによるppsの定量化は、フォワードプライマー5'-AACAAAAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTATTATtaTtaA-3'、逆プライマー5'-GGGTCTCTTGTGTACT-3'、およびプローブ5'-FAM-CCCCCAATGAAAGACCCCCCCC-TAM-3'、リアルタイムPCRサーモサイカー上。感染する前にRNAコピー数のppsを正規化します。
- 感染性アッセイ
- qRT-PCR データの観点から各タイプの pps を 4 x 105コピー/mL (pp 正規化) に希釈します。
- トシル・フェニルアラニンクロロメチルケトン(TPCK)-トリプシンをH7N9 HAを収容するppsに40μg/mLの最終濃度に添加します。37°Cで1時間インキュベートし、機能サブユニットHA1とHA2を形成します。
注:彼らはHA1-HA2切断部位で複数のアルギニンおよびリジン残基を有するので、TPCK-トリプシンでH5を収容するppsを治療する必要はありません。この多塩基性切断部位は、ユビキタス細胞プロテアーゼによって切断することができる。 - 正規化されたppsをDMEM培地(無血清)と1:1の比率(体積/体積)で混合します。
- 感受性細胞を含むプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。
- 上清を吸引し、前温PBSの0.1 mLで細胞を一度洗浄する。
- pps-DMEM 混合物の 0.1 mL を 1 ウェルに追加します。pps の各タイプの感染性テストを 1 つの影響を受けやすい細胞株にトリプリケートします (図 2を参照)。
- 96ウェルプレートを37°C、5%CO2インキュベーターで4~6時間インキュベートします。
- 上清を吸引し、DCMの0.1 mLに交換します。
- 96ウェルプレートを37°C、5%CO2インキュベーターで24~36時間インキュベートします。
5. 5日目または6日目:感染性検出
- 96ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。
- 上清を吸引し、前温PBSの0.2mLで細胞1xを洗浄する。
- PBSを除去し、0.25%トリプシンEDTA溶液の0.1 mLで細胞の解ソを解除します。
- 37°C、5%CO2インキュベーターで細胞が解解するまで3分間置きます。
注:これは細胞の塊につながるので、5分以上インキュベートしないでください。 - DCM を 0.4 mL 追加してトリプシンを非アクティブ化します。
- 細胞を上下に数回ピペットで単一細胞懸濁液に分散させます。
- 細胞懸濁液を冷却した1.5 mLマイクロ遠心管に移します。
- 蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてGFPレポーター陽性細胞を決定します。
注:GFPレポーター陽性標的細胞の比率を決定するには、対照サンプル(pps未処理A549細胞またはMDCK細胞)を使用してフローサイトメーターゲートを設定し、サンプルあたり10,000細胞のGFPレポーター陽性細胞をカウントします。
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Representative Results
上記の一般的な手順に応じて、2つのグループHA/NまたはVSV-G糖タンパク質または非エンベロープ糖タンパク質を組み合わせた10種類のppsを生成しました(表1を参照)。そのうち7人は感染性です。エンベロープなし糖タンパク質または唯一の港NAを収容するppsは、ここでの感染性を示さなかった。インフルエンザpp産生手順は図1に概観されている。ppsの透過電子顕微鏡写真(例えば、H5N1pp)を図3に示す。これらのppsの感染性アッセイの結果を図4に示す。7種類のppsの感染率は、細胞当たりのゲノムコピー(GCP)で評価した[感染の多重度(MOI)]値20.H5を抱くppsグループでは、 H5N1、(H5+N9)、およびH5の感染率は90.05±4.05%、17.78±1.58%、10.15±2.85%の細胞株A549および40.37±4.92%、5.24±1.32%、4.88±0.27%であった。H7を抱くppsグループでは、 H7N9、(H7+N1)、およびH7の感染率は10.45±2.35%、6.75±1.37%、セルラインA549および7.61±1.04%、4.12±1.29%、1.08±0.02%であった。ppsの感染性アッセイのために、特にHApp(H5pp、H7pp)、高因性ノイラミニダーゼは添加されなかった。この感染性アッセイでは、MDCK細胞を対照細胞株として用いてpps感染性を試験した。VSVGppの感染率は、A549で20.9±2.00%、MDCK細胞で16.02±2.41%であった。デルタエンベロープ糖タンパク質pp(Δenv pp)は、我々の研究において感染性を示さなかった。これらのデータはまた、多様なウイルス株からのHA/Nが感染性ウイルス粒子を正常に生成できることを示した。まとめると、当社の擬似タイピングプラットフォームは、インフルエンザ研究で使用される感染性擬似型ウイルス粒子を開発することができます。
図1:インフルエンザpp産生手順の概要(A)包装プラスミドpcDNA-Gag-pol、レポータープラスミドpcDNA-GFP、およびエンベロープ糖タンパク質発現プラスミドpVRC-HAおよびpVRC-NAを、pp産生HEK293/17細胞に共移する。(B) HEK 293/17細胞では、Gag-Polポリタンパク質が合成され、未知のメカニズムによって細胞膜に輸送されます。糖タンパク質HAおよびNAは、分泌経路を介して細胞膜上に輸送され、固定される。レポータープラスミドpcDNA-GFPは、一本鎖δGFPゲノムRNAに転写される。(C)輸送中または輸送後に、Gag-Polタンパク質は、psi-RNAパッケージングシグナルを介して一本鎖δGFPゲノムRNAをリクルートし、それによって出芽前複合体を形成する。(D)組み立てられたGag-pol-μ-RNA複合体は膜湾曲を誘導し、芽の形成につながる。出芽の間、ウイルスエンベロープ糖タンパク質HA/NASは、新生粒子に組み込まれる。出芽は、粒子が細胞膜からピンチオフとして完了します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:感染性アッセイにおける全体的な配置。1つの感受性細胞株に対する各タイプのppsの感染性試験を三重で測定した。歯槽由来ヒト細胞A549およびMDCKは、感受性細胞として使用される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ppsの透過電子顕微鏡写真濃縮されていない(左)と濃縮(右)上清。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:正規化されたppsの感染性。感染率は、感染細胞の平均±標準偏差(SD)パーセンテージ(n=3)として提示される。ppsの感染性は、A549およびMDCK細胞の2つの細胞株で評価された。7種類のppsは、2つの標的細胞に様々な感染性プロファイルを表示した。NAのみを港にするPpsは、彼らが任意の感染性を明らかにしなかったので、ここに示されていません。エンベロープなし糖タンパク質(Δenv)を収容するPpsも我々の研究では感染力を示さなかった。感染率は、サンプル当たり10,000細胞におけるGFPレポーター陽性細胞の比率を示した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| プラスミド製剤 | ||||||||||
| プラスミド(0.1μg/°L) | H5N1 | (H5+N9) | H7N9 | (H7+N1) | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | Δenv |
| pcDNA-Gag-pol | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pcDNA-GFP | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pVRC-HA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 2.14 | - | 2.14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | - | 2.14 | - | 2.14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2.14 | - |
表1:H5N1およびH7N9ウイルスに由来するHAタンパク質とNAタンパク質の組み合わせと、6ウェルプレートの1つのウェルトランスフェクションに対するプラスミドDNAの必要量(体積)。プラスミド製剤の濃度に応じて、各プラスミドDNAの必要量を算出する。1つのウェルのトランフェクションのためのプラスミドDNAの総量は2.5μgです。トランスフェクション効率が最も高く、非特異的な効果が最も低い場合は、プラスミドDNAとトランスフェクション試薬濃度を変化させることでトランスフェクション条件を最適化しました。最適化後、4つのプラスミド量の比率を16:16:1:1に設定した。6ウェルプレートの1ウェルトランスフェクションで使用されるトランスフェクション試薬の体積は8μLです(表には示されていません)。H5N1 および H7N9 ウイルスから 2 つの HA と 2 つのナサを使用して、H5N1pp、(H5 + N9)pp、H5pp、N1pp、H7N9pp、(H7 + N1)pp、H7pp および N9pp の 8 種類の pps を生成できます。エンベロープなし糖タンパク質(Δenv)または唯一のハーバーNA糖タンパク質を収容するppsは、我々の研究において感染性を示さなかった。
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Discussion
このプロトコルでは、BSL-2設定でインフルエンザウイルス擬似型粒子(pp)を生成する方法について説明する。レポータープラスミドpcDNA-GFPはppsに組み込まれ、感染性アッセイでFACSによってppsを定量するために使用することができる。インフルエンザの研究に広く用いられているため、2種類の影響を受けやすい細胞株を選びました。MDCK細胞は、これらの研究で使用される可変不死化ヒト細胞に良好な制御を提供するであろう。
このプロトコルは、GFPレポーターを組み込み、細胞膜上に芽を生成することができるレトロウイルスMLVに基づいています。この技術は、インフルエンザウイルス粒子4、22、23、24を包装するために広く開発されている。いくつかの他のシステムは、レンチウイルスHIV-1擬似タイピングシステム19、25、26またはバキュロウイルス昆虫細胞発現システム27、28、29に基づいている。ルシフェラーゼ(発光)30、31、32、33、β-gal/LacZ(色分けによる)34、35、および分泌アルカリホスファターゼ36、37などの擬似粒子産生にも他の多くのレポーター遺伝子が使用されている。Milletららは、ルシフェラーゼアッセイを用いて、コロナウイルス擬似型粒子33の感染性を定量した。ルシフェラーゼと比較して、GFPの緑色蛍光は、反転蛍光生物学的顕微鏡で容易に観察できます。これは、トランスフェクションと感染の効率をチェックするための便利な方法です。本研究では、FACSを用いてGFP陽性細胞を検出することにより、感染性を直接決定することができる。
この方法では、いくつかの手順が結果に重大な影響を与えます。最適化された細胞密度は、トランスフェクションを成功させるための重要な要素です。このプロトコルでは、80~90%のコンフルエント範囲の細胞密度がインフルエンザウイルスpp産生に最適であることが判明した。細胞密度が高いか低いと、トランスフェクション効率が低下します。プロデューサ細胞の良好な生理学的状態は、高粒子産生にとっても非常に重要である。このため、より低い細胞通路HEK 293T/17細胞は、このプロトコルでppsを生成することをお勧めします。また、トランスフェクション試薬の体積と4つのプラスミド量の比もトランスフェクション効率に影響を与える可能性があります。最高のトランスフェクション効率を得るためには、その量を変化させ、テストすることによって、これらの因子を最適化することをお勧めします。4つのプラスミド量の比率を16:16:1:1、トランスフェクション試薬の体積を8μLとして6ウェルプレートに1回のウェルトランフェクションに設定しました。もう 1 つの問題は、セルの処理です。HEK 293T/17プロデューサー細胞は接着性が低いため、セルの手動処理は非常に穏やかでなければなりません。リポペクションは細胞透過性の上昇につながり、培地中の血清および抗体は細胞毒性を増加させる可能性がある。トランスフェクト後のHEK 293T/17細胞を培養するには、無血清および抗体フリーのDMEMを使用するのが最善です。さらに、収集時間が重要です。36 –48 h トランスフェクションでは、pp コレクションの前にセル上清の色がピンクまたはオレンジピンクであることを確認する必要があります。黄色の上清は、培地が細胞増殖を支えるには酸性すぎることを示し、通常はpp収率の低下につながる。
トランスフェクションアッセイを6ウェルプレートで行った。より多くのppボリュームを得るために、トランスフェクションウェルの数を増やすことができ、同じppsを含む上清を一緒にプールすることができます。あるいは、他のいくつかの種類の血管は、pp収率を増加させるために使用することができる。例えば、18μLのトランスフェクション試薬と5.5μgのプラスミドDNAを使用して、1つの60mm皿に2.2 x 10 6細胞でトランスフェクションを行うことができます。同様に、感染性アッセイは、24ウェルプレートで行うことができる。
この手法の成功は、多くの要因の影響を受ける可能性があります。したがって、手順は、異なる種類のウイルスの粒子包装のために最適化する必要があります。
このプロトコルでは、HPAI H5N1およびH7N9の擬似型ウイルス粒子、ならびにこれらの再構成剤が生成された。この方法では、組織培養感染用量50(TCID50)または従来のMOI23、38、39の代わりに、単一細胞レベルでの感染性アッセイ(細胞あたりのゲノムコピーとして)でGFP-RNAのqRT-PCRを使用する。ウイルス感染性滴定法は、プラークアッセイまたはTCID50アッセイに基づいており、これは時間と労力の両方です。両方のアッセイは、細胞株におけるウイルス感染によって引き起こされる目に見える細胞障害効果(CPE)の測定に依存しているので、感染性の低いウイルス(すなわち、この研究ではH7pp)を硝化することは困難な場合があります。インフルエンザppsに含まれるGFP RNAのqRT-PCRでppsを正規化することは、便利で効果的かつ迅速な方法であると考えています。
私たちの技術は安全で適応性があり、受容体、栄養学、エンベロープ糖タンパク質機能、中和抗体、ウイルス対策医薬品の開発、診断、ワクチン設計などのエンベロープウイルスの研究に使用できます。評価。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は浙江省医学・健康科学技術計画(グラント番号、2017KY538)、杭州市立医科医療技術計画(グラント番号、OO20190070)、杭州医科、及び杭州医科大学の助成金によって支えられた。技術キープロジェクト(グラント番号、2014Z11)と杭州自治体の自律的な社会開発と科学研究のアプリケーションプロジェクト(グラント番号、20191203B134)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
