Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Prozess zur Herstellung hochtiter infektiöser viraler pseudotypisierter Partikel (pp) mit Hüllglykoproteinen aus zwei Influenza-A-Stämmen und wie ihre Infektiosität bestimmt werden kann. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig, um pps von jeder anderen Art von umhüllten Viren mit verschiedenen Hüll-Glykoproteinen zu entwickeln.
Abstract
Die gelegentliche direkte Übertragung des hoch pathogenen Aviären Influenza-A-Virus H5N1 (HPAI H5N1) und H7N9 auf den Menschen und ihre Letalität sind ernste Probleme der öffentlichen Gesundheit und deuten auf die Möglichkeit einer Epidemie hin. Unser molekulares Verständnis des Virus ist jedoch rudimentär, und es ist notwendig, die biologischen Eigenschaften seiner Hüllproteine als therapeutische Ziele zu untersuchen und Strategien zur Bekämpfung von Infektionen zu entwickeln. Wir entwickelten eine solide virale pseudotypisierte Partikel-(pp)-Plattform zur Untersuchung des Aviären Influenzavirus, einschließlich der funktionellen Analyse seiner Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) Hüllproteine, die Neusortierungseigenschaften der HAs und NAs, Rezeptoren, Tropismen, neutralisierende Antikörper, Diagnose, Infektiosität, für die Zwecke der Arzneimittelentwicklung und Impfstoffentwicklung. Hier beschreiben wir ein experimentelles Verfahren zur Ermittlung von pps mit den Hüllproteinen (HA, NA) aus zwei Influenza-A-Stämmen (HAPI H5N1 und 2013 avian H7N9). Ihre Erzeugung basiert auf der Fähigkeit einiger Viren, wie dem murinen Leukämievirus (MLV), Hüllglykoproteine in ein pp zu integrieren. Darüber hinaus beschreiben wir auch, wie diese pps mit RT-qPCR quantifiziert werden, und die Infektiositätserkennung von nativen und nicht übereinstimmenden Virus-Pps, abhängig vom Ursprung der HAs und NAs. Dieses System ist hochflexibel und anpassungsfähig und kann verwendet werden, um virale pps mit Hüll-Glykoproteinen herzustellen, die in jede andere Art von umhüllten Viren eingearbeitet werden können. So kann diese virale Partikelplattform verwendet werden, um Wildviren in vielen Forschungsuntersuchungen zu untersuchen.
Introduction
Die Mission eines viralen Teilchens besteht darin, sein Genom von einer infizierten Wirtszelle in eine nicht infizierte Wirtszelle zu transportieren und in einer replikationskompetenten Form1in das Zytoplasma oder den Zellkern zu liefern. Dieser Prozess wird zunächst durch Bindung an Wirtzellrezeptoren ausgelöst, gefolgt von der Fusion von Virion und Zellmembranen. Für umhüllte Viren, wie Influenzaviren, sind die Spike-Glykoproteine für die Rezeptorbindung und Fusion1,2verantwortlich. Virale Hüllkinkoproteine (z.B. Pyrogene, Antigene) sind an vielen wichtigen Eigenschaften und Ereignissen beteiligt, wie z. B. Viruslebenszyklusinitiierung (Bindung und Fusion), virale Pathogenese, Immunogenität, Wirtszellapoptose und zellulärer Tropismus, der zelluläre endozytische Weg, sowie die Übertragung und Neusortierung zwischen Denspezies1,3,4,5,6,7. Die Forschung an viralen Hüllproteinen wird uns helfen, viele Aspekte des Virusinfektionsprozesses zu verstehen. Pseudotypisierte Viruspartikel (pp), auch Pseudovirions oder Pseudopartikel bezeichnet, können durch eine Pseudotypisierungstechnik8,9,10erzeugt werden. Diese Technologie wurde verwendet, um pseudotypisierte Partikel vieler Viren zu entwickeln, einschließlich Hepatitis C11,12, Hepatitis B13, vesikuläre Stomatitis Virus (VSV)14,15, und Influenza-Virus16,17,18,19. Diese Technologie basiert auf dem Gag-Pol-Protein von Lentiviren oder anderen Retroviren.
Pseudotypisierte Viruspartikel können mit einem Drei-Plasmid-System gewonnen werden, indem ein virales Hüllprotein-Expressionsplasmid, ein retrovirales Verpackungsplasmid, das das Hüllen-Env-Gen fehlt, und ein separates Reporter-Plasmid in pp-Produzentenzellen kotransfiziert werden. Das Retrovirus wird durch sein Gag-Protein zusammengesetzt, und es knospen aus einer infizierten Zellmembran, die das Virus Hülle Protein1ausdrückt. Daher ist es möglich, mit dem Retrovirus Gag-Protein mit hilfe des Retrovirus Gag-Proteins grippereiche Pnospen auf einer Zellmembran zu erhalten, die Influenza HA und NA exekliniert. In unseren früheren Studien waren HAs/NAs in allen Kombinationen funktional und in der Lage, ihre entsprechenden Funktionen im viralen Lebenszyklus16,17,18,20,21auszuführen. Diese pps werden verwendet, um biologische Influenza-Eigenschaften zu untersuchen, einschließlich Hämagglutination, Neuraminidase-Aktivität, HA-Rezeptor-Bindung Tropismus, und Infektiosität. Da HA und NA wichtige oberflächenfunktionelle Proteine im viralen Lebenszyklus sind, können nicht übereinstimmende HAs und NAs, die aus verschiedenen Grippestämmen abgeleitet sind, teilweise eine Neusortierung zwischen ihnen nachweisen. Hier erzeugen wir acht Arten von Influenza-Pps, indem wir zwei HAs und zwei NAs (abgeleitet vom HPAI H5N1-Stamm und dem H7N9-Fleck) mit einem Drei-Plasmid-Pseudotypisierungssystem kombinieren. Diese acht Arten von pps umfassen zwei native pps, H5N1pp, H7N9pp; zwei nicht übereinstimmende pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; und vier Pps, die nur ein einzelnes Glykoprotein (HA oder NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp beherbergen. Studien zum Influenzavirus, wie H5N1 und H7N9, sind durch Biosicherheitsanforderungen begrenzt. Alle Untersuchungen der Wildinfluenza-Virusstämme sollten in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt werden. Die pseudotypisierte virale Partikeltechnologie kann verwendet werden, um ein künstliches Virion in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) zu verpacken. Daher stellen pps ein sichereres und nützliches Werkzeug dar, um die Influenza-Virusprozesse in Abhängigkeit von seinen beiden wichtigsten Glykoproteinen zu untersuchen: Hemagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA).
Dieses Protokoll beschreibt die Generierung dieser pps mit einer Drei-Plasmid-Kotransfektionsstrategie (im Überblick in Abbildung 1), wie pps zu quantifizieren und Infektiositätsnachweis. Die pp-Produktion umfasst drei Arten von Plasmiden (Abbildung 1). Das Gag-Pol-Gen, das das Retrovirus Gag-Pol-Protein kodiert, wurde aus einem Retrovirus-Verpackungskit geklont und in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und mit dem Namen pcDNA-Gag-Pol aufgenommen. Das verbesserte Grüne fluoreszierende Protein (eGFP) Gen, das grünes Fluoreszenzprotein kodiert, wurde aus dem pTRE-EGFP-Vektor geklont, in das pcDNA 3.1-Plasmid eingeführt und als pcDNA-GFP bezeichnet. Beim Klonen wurde über eine Grundierung eine Verpackungssignalsequenz hinzugefügt. Die HA- und NA-Gene wurden in ein pVRC-Plasmid namens pVRC-HA bzw. pVRC-NA geklont. Das letzte Plasmid kodiert das Fusionsprotein und kann durch jedes andere Fusionsprotein von Interesse ersetzt werden. Unsere Pseudotypisierungsplattform umfasst zwei Glykoproteinexpressionsplasmide: pVRC-HA und pVRC-NA. Dies kann die Forschung zur Neusortierung zwischen verschiedenen Virusstämmen in einer BSL-2-Einstellung vereinfachen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tag 1: Zellkultur und Seeding
- Kultivieren Sie menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T/17 Zellen in 60 mm Schalen mit Dulbeccos modifiziertem essentiellen Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (DMEM Complete Medium, DCM) in einem 37 °C, 5% Kohlendioxid (CO2) Inkubator bis ca. 80% Confluent.
HINWEIS: HEK 293T/17 Arme-Durchgangszellen werden empfohlen. - Waschen Sie die Zellen sorgfältig mit 5 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) 1x.
HINWEIS: Die manuelle Handhabung der HEK 293T/17-Zellen muss sehr schonend sein, da sie sich leicht lösen. - Entfernen Sie PBS und dissoziieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin-Ethylendin-Tetraessigsäure (EDTA)-Lösung. Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für nicht mehr als 5 min, bis die Zellen dissoziiert sind.
- Deaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 5 ml DCM hinzufügen. Dispergieren Sie die Zellen in eine einzellige Suspension, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen.
- Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein vorgechilltes 15 ml Zentrifugenrohr. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 250 x g für 5 min bei 4 °C.
- Dekant so viel von dem Überstand wie möglich. Setzen Sie das Zellpellet mit 6 ml DCM-Medium aus und zählen Sie die Zellen. Verdünnen Sie die Zellen auf 1 x 106 Zellen/ml mit DCM-Medium.
- Säen Sie die Zellen in eine 6 Brunnenplatte mit 1 ml Zellsuspension pro Brunnen. Klopfen Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (14-16 h) in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
2. Tag 2: Vier-Plasmid-Cotransfektion durch Lipofection vermittelt
- Überprüfen Sie die Zellmorphologie und -dichte unter einem invertierten Lichtmikroskop. Idealerweise sollten Zellen bei Transfektion etwa 85 % konfluent sein. Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml serumfreies DMEM-Medium pro Brunnen, und legen Sie die Platte dann wieder in den Inkubator.
HINWEIS: Die manuelle Handhabung der HEK 293T/17-Zellen muss sehr schonend sein, da sie sich leicht lösen. - Für jeden Zutransfizierten Brunnen kultivierter Zellen 8 l des Transfektionsreageims auf ein Volumen von 150 l mit reduziertem Serummedium (Tube 1) verdünnen. Sanft mischen und 5 min bei Raumtemperatur (RT, ca. 20 °C) inkubieren.
HINWEIS: Bereiten Sie für jede Transfektionsprobe zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre mit den Nummern 1 und 2 vor. - In Tube 2 verdünnen Sie 2,5 g Plasmid-DNA in 150 l reduziertes Serummedium.
HINWEIS: In Tube 2 jede Plasmid-DNA, wie in Tabelle 1dargestellt, verdünnen. A plasmid encoding vesicular stomatitis virus (VSV) G glycoprotein (plasmid pLP-VSVG) was used as a positive control, because VSV is able to infect a wide range of cells. Negative Kontrollpartikel ohne Influenza-Hüllkurven-Glykoproteine (env pps) wurden mit pcDNA-Gag-Pol und pcDNA-GFP-Plasmiden erzeugt. - Kombinieren Sie nach einer Inkubation von 5 min die verdünnte DNA mit einem verdünnten Transfektionsreagenz. Mischen Sie sanft und brüten für weitere 15 min bei RT.
- Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex in den entsprechenden Brunnen, der die Zellen und das serumfreie Medium enthält. Mischen Sie sanft, indem Sie die Platte hin und her schaukeln.
- Nach der Inkubation für 4–6 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, entfernen Sie das Medium, und ersetzen Sie durch 2 ml DMEM. Inkubieren Sie für weitere 36–48 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
HINWEIS: Ersetzen Sie dies durch serum- und antikörperfreies DMEM. In diesem Protokoll können zwei HAs und zwei NAs verwendet werden, um acht Arten von pps zu generieren (siehe Tabelle 1).
3. Tag 3: Anfällige Zellen Seeding
- Für den Infektiositätstest säen Sie jede Art von anfälligen Zellen bei 1 x 104 Zellen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte.
HINWEIS: Verwenden Sie zwei Arten von Zielzellen, um den Infektiositätstest in diesem Artikel durchzuführen: eine alveolarabgeleitete menschliche Zelllinie (A549-Zellen) und die Madin-Darby-Canine Kidney(MDCK)-Zellen. MDCK-Zellen sind weit verbreitet in der Grippeforschung und können eine gute Kontrolle sein. Dieser Schritt ist flexibel. Alle anderen Zielzelllinien können je nach Forschungsbedarf verwendet werden. - Inkubieren Sie die Platte über Nacht (14-16 h) in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
4. Tag 4: Pseudotypisierte Virale Partikelsammlung, Quantifizierung und Infektiositätstest
- Pseudotypisierte virale Partikelsammlung
- Überprüfen Sie die Farbe des Mediums. Idealerweise sollte es hellrosa oder leicht orange sein. Untersuchen Sie die Zellen mit einem invertierten fluoreszierenden biologischen Mikroskop unter 440–460 nm.
- Bei 36–48 h Nachtransfektion ernten Sie die pps, indem Sie einen 0,45 m Polyvinylidenfluorid -Membranfilter (PVDF) passieren, um Zellablagerungen zu beseitigen.
- Teilen Sie die pps in kleine Volumen-Aliquots auf.
- Bewahren Sie die pps bei -80 °C auf.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Dies wird jedoch nicht gefördert, da die Infektiosität der pps nach dem Einfrieren und Auftauen stark abnehmen wird.
- Pseudotypisierte virale Partikelquantifizierung
- 20 l gereinigte pps auf ein 1,5 ml Ribonuklease (RNase)-freies Mikrozentrifugenrohr übertragen.
- Fügen Sie 1 l von 0,24 U/ml Benzonase-Nuklease hinzu. Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um jegliche DNA- und RNA-Kontamination zu beseitigen.
HINWEIS: Ziel-RNA, häufig downreguliertes Cytomegalievirus (CMV)-GFP-RNA, ist in den pps verpackt und kann vermeiden, durch Benzonase-Nuklease abgebaut zu werden. - Die Probe bei -70 °C einfrieren, um die Benzonase-Nuklease zu inaktivieren.
- Fügen Sie 2 L Proteinase K. Inkubieren bei 50 °C für 30 min, um die Hüllhautproteine zu verdauen und die CMV-GFP-RNA freizusetzen. Die Proteinase K bei 100 °C für 3 min inaktivieren.
- Quantifizieren Sie die pps durch quantitative Reverse-Transkription (qRT)-PCR in Echtzeit mit einem Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit, mit dem Vorwärtsprimer 5'-AACAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', dem Reverse Primer 5'-GGGTCTCTTCAGAGTGATTGGATTGACTAC-3', und der Sonde 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', auf einem Echtzeit-PCR-Thermocycler. Normalisieren Sie die pps für RNA-Kopiernummer vor der Infektiosität.
- Infektiitätstest
- Verdünnen Sie jede Pps-Art in Bezug auf die qRT-PCR-Daten auf 4 x 105 Kopien/ml (pp Normalisierung).
- Fügen Sie Tosyl-Phenylalanin Chloromethyl-Keton (TPCK)-Trypsin zu einer Endkonzentration von 40 g/ml in pps hinzu, die H7N9 HA enthalten. Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um seine funktionalen Untereinheiten HA1 und HA2 zu bilden.
HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die pps, die H5 beherbergen, mit TPCK-Trypsin zu behandeln, da sie mehrere Arginin- und Lysinrückstände an der HA1-HA2-Spaltungsstelle haben. Diese multi-basic Spaltung Sekolleté-Site kann durch allgegenwärtige zelluläre Proteasen zerklaut taufen. - Mischen Sie normalisierte pps mit DMEM medium (serumfrei) im Verhältnis 1:1 (Volumen/Volumen).
- Bringen Sie die Platte mit anfälligen Zellen in den Biosicherheitsschrank.
- Den Überstand ansaugen und die Zellen einmal mit 0,1 ml vorgewärmtem PBS waschen.
- 0,1 ml pps-DMEM-Mischung zu einem Brunnen geben. Dreifache Infektiitätstests jeder Pps-Typs auf eine anfällige Zelllinie (überblickt in Abbildung 2).
- Inkubieren Sie die 96-Wellplatte für 4–6 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
- Aspirieren Sie den Überstand und ersetzen Sie mit 0,1 ml DCM.
- Inkubieren Sie die 96-Wellplatte für weitere 24–36 h in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
5. Tag 5 oder 6: Infektiositätserkennung
- Bringen Sie die 96 Well Platte in den Biosicherheitsschrank.
- Den Überstand ansaugen und die Zellen 1x mit 0,2 ml vorgewärmten PBS waschen.
- Entfernen Sie PBS und dissoziieren Sie die Zellen mit 0,1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung.
- Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 3 min, bis die Zellen getrennt sind.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine Inkubation für mehr als 5 min, da dies zu Zellverklumpungen führt. - Deaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 0,4 ml DCM hinzufügen.
- Dispergieren Sie die Zellen in einzellige Suspension, indem Sie mehrmals nach oben und unten pipetieren.
- Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein gekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Bestimmen Sie die GFP-Reporter-positiven Zellen mit Fluoreszenz Activated Cell Sorting (FACS).
ANMERKUNG: Um das Verhältnis der GFP-Reporter-positiven Zielzellen zu bestimmen, legen Sie die Durchflusszytometer-Gatter mithilfe der Kontrollproben (pps-unbehandelte A549-Zellen oder MDCK-Zellen) fest, und zählen Sie dann die GFP-Reporter-positiven Zellen von 10.000 Zellen pro Probe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abhängig von dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren haben wir 10 Arten von pps erzeugt, die zwei Gruppen-HAs/NAs oder VSV-G-Glykoprotein oder No-Envelope-Glykoproteine kombinieren (siehe Tabelle 1). Sieben von ihnen sind ansteckend. Die pps, die no-envelope Glycoprotein oder nur Hafen NA beherbergen, zeigten hier keine Infektiosität. Das Herstellungsverfahren für Influenza pp ist in Abbildung 1dargestellt. Transmissionselektronenmikroskopie von pps (z.B. H5N1pp) ist in Abbildung 3dargestellt. Die Ergebnisse der Infektiositätstests dieser pps sind in Abbildung 4dargestellt. Die Infektiosität der sieben Pps-Typen wurde mit einem Genomkopien pro Zelle (GCP) [ähnlich der Multiplizität der Infektion (MOI)] von 20 bewertet. In der pps-Gruppe mit H5, die Infektiosität von H5N1 (H5+N9) und H5 betrug 90,05 x 4,05 %, 17,78 % bis 1,58 %, 10,15 % bei 2,85 % für die Zelllinie A549 bzw. 40,37 % bei 4,92 %, 5,24 % 1,32 %, 4,88 % bei 0,27 % für MDCK. In der pps-Gruppe mit H7, die Infektiosität von H7N9 (H7+N1) und H7 betrug 10,45 x 2,35 %, 6,75 x 1,37 %, 1,23 % bei 0,33 % für die Zelllinie A549 bzw. 7,61 x 1,04 %, 4,12 % 1,29 %, 1,08 % bei 0,02 % für MDCK. Für die Infektiositätstests der pps, insbesondere HApp (H5pp, H7pp), wurde keine exogene Neuraminidase hinzugefügt. In diesem Infektiositätstest wurden die MDCK-Zellen auch als Kontrollzelllinie verwendet, um die Infektiosität der pps zu testen. Die Infektiosität von VSVGpp betrug 20,9 x 2,00 % für A549 und 16,02 % bei MDCK-Zellen. Die Delta-Hüll-Glykoproteine pp (env pp) zeigten in unserer Studie keine Infektiosität. Diese Daten zeigten auch, dass HAs/NAs aus verschiedenen Virusstämmen in der Lage sind, erfolgreich infektiöse Viruspartikel zu erzeugen. Zusammengenommen kann unsere Pseudotypisierungsplattform infektiöse pseudotypisierte Viruspartikel entwickeln, die in der Grippeforschung verwendet werden.
Abbildung 1: Überblick über das Herstellungsverfahren für Influenza pp. (A) Das Verpackungsplasmid pcDNA-Gag-pol, das Reporterplasmid pcDNA-GFP und die Hüllproteinexpressionsplasmide pVRC-HA und pVRC-NA werden in pp-produzierende HEK 293/17-Zellen kotransfiziert. (B) In HEK 293/17-Zellen werden die Gag-Pol-Polyproteine synthetisiert und durch einen unbekannten Mechanismus zur Zellmembran transportiert. Die Glykoproteine HA und NA werden über den sekretonischen Weg auf die Zellmembran transportiert und verankert. Reporterplasmid pcDNA-GFP wird in die einsträngige genomische RNA von GFP transkribiert. (C) Während oder nach dem Transport rekrutiert das Gag-Pol-Protein über die psi-RNA-Verpackungssignale die einsträngige genomische RNA-RNA und bildet so die vorblühenden Komplexe. (D) Der zusammengesetzte Gag-pol--RNA-Komplex induziert eine Membrankrümmung, die zur Bildung einer Knospe führt. Während des Aufblühens werden die viralen Hüllproteine HAs/NAs in die entstehenden Partikel eingearbeitet. Das Aufblühen ist abgeschlossen, wenn das Teilchen von der Zellmembran abkniff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gesamtanordnung im Infektiositätstest. Die Infektiositätstests jeder Art von pps zu einer anfälligen Zelllinie wurden in Dreifacherdikate gemessen. Alveolar-abgeleitete menschliche Zellen A549 und MDCK werden als anfällige Zellen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Transmissionselektronenmikroskopie von pps. Unkonzentriert (links) und konzentriert (rechts) Überstand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Infektiosität normalisierter pps. Die Infektiosität wird als mittlerer Prozentsatz der Standardabweichung (SD) infizierter Zellen (n = 3) dargestellt. Die Infektiosität von pps wurde in zwei Zelllinien, A549 und MDCK-Zellen, untersucht. Sieben Arten von pps zeigten verschiedene Infektiositätsprofile in zwei Zielzellen. Pps, die nur NA beherbergen, werden hier nicht gezeigt, da sie keine Infektiosität manifestierten. Auch Pps, die no-envelope-Glykoproteine enthalten, zeigten in unserer Studie keine Infektiosität. Der Prozentsatz der Infektiosität bezeichnete das Verhältnis der GFP-Reporter-positiven Zellen in 10.000 Zellen pro Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Plasmidpräparate | ||||||||||
| Plasmid (l, 0,1 g/l) | H5N1 | (H5+N9) | H7N9 | (H7+N1) | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | Env |
| pcDNA-Gag-pol | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pcDNA-GFP | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pVRC-HA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 2.14 | - | 2.14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | - | 2.14 | - | 2.14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2.14 | - |
Tabelle 1: Kombinationen von HA- und NA-Proteinen, die aus H5N1- und H7N9-Viren gewonnen werden, und die erforderlichen Mengen (Volumen) der Plasmid-DNA für eine Brunnentransfektion einer 6-Well-Platte. Berechnen Sie nach der Konzentration der Plasmidpräparate das erforderliche Volumen jeder Plasmid-DNA. Die Gesamtmenge der Plasmid-DNA für die Tranfektion eines Bohrbrunnens beträgt 2,5 g. Um die höchste Transfektionseffizienz und die geringsten unspezifischen Effekte zu erzielen, haben wir die Transfektionsbedingungen durch unterschiedliche Plasmid-DNA- und Tranfektionsreagenzkonzentrationen optimiert. Nach der Optimierung wurde das Verhältnis der vier Plasmide-Mengen auf 16:16:1:1 festgelegt. Das Volumen des Transfektionsreagenzes, das in einer Brunnentransfektion einer 6-Well-Platte verwendet wird, beträgt 8 l (nicht in der Tabelle dargestellt). Zwei HAs und zwei NAs von H5N1- und H7N9-Viren können verwendet werden, um acht Arten von pps zu erzeugen: H5N1pp, (H5 + N9)pp, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1)pp, H7pp und N9pp. Die pps, die no-envelope Glycoproteine enthalten oder nur NA-Glykoproteine beherbergen, zeigten in unserer Studie keine Infektiosität.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Pseudotyppartikeln (pp) des Influenzavirus in einer BSL-2-Einstellung. Das Reporter-Plasmid pcDNA-GFP ist in die pps integriert und kann verwendet werden, um pps von FACS in einem Infektiositätstest zu quantifizieren. Wir haben uns für zwei Arten von anfälligen Zelllinien entschieden, weil sie in der Grippeforschung weit verbreitet sind. MDCK-Zellen würden eine gute Kontrolle für die variablen verewigten menschlichen Zellen bieten, die in diesen Studien verwendet werden.
Dieses Protokoll basiert auf dem Retrovirus MLV, das einen GFP-Reporter integrieren und Knospen auf der Zellmembran produzieren kann. Diese Technik wurde weit entwickelt für die Verpackung von Influenza-Virus-Partikel4,22,23,24. Einige andere Systeme basieren auf dem lentiviralen HIV-1 Pseudotypisierungssystem19,25,26 oder dem Baculovirus-Insektenzellexpressionssystem27,28,29. Viele andere Reportergene wurden auch für die Pseudopartikelproduktion verwendet, wie Luziferase (Lumineszenz)30,31,32,33, '-gal/LacZ (durch Kolometrie)34,35, und sezernierte alkalische Phosphatase36,37. Millet et al. verwendeten den Luziferase-Assay, um die Infektiosität von koronaviruspseudotypisierten Partikeln zu quantifizieren33. Im Vergleich zur Luziferase ist die grüne Fluoreszenz von GFP mit einem invertierten fluoreszierenden biologischen Mikroskop leicht zu beobachten. Dies ist eine bequeme Möglichkeit, Transfektion und Infektionseffizienz zu überprüfen. Für diese Studie kann die Infektiosität direkt durch den Nachweis der GFP-positiven Zellen mit FACS bestimmt werden.
Bei dieser Methode wirken sich mehrere Schritte kritisch auf die Ergebnisse aus. Die optimierte Zelldichte ist ein entscheidender Faktor für eine erfolgreiche Transfektion. In diesem Protokoll wurde eine Zelldichte im Bereich von 80–90% Konfluent als optimal für die Produktion von Influenza-Viren pp gefunden. Eine höhere oder niedrigere Zelldichte führt zu einer geringeren Transfektionseffizienz. Ein guter physiologischer Zustand der Erzeugerzellen ist auch für die hohe Partikelproduktion sehr wichtig. Aus diesem Grund wird niedrigerzellige HEK 293T/17-Zellen empfohlen, um pps in diesem Protokoll zu produzieren. Auch das Volumen des Transfektionsreagenzes und das Verhältnis der vier Plasmide mengen können sich auch auf die Transfektionseffizienz auswirken. Um die höchste Transfektionseffizienz zu erzielen, wird empfohlen, diese Faktoren zu optimieren, indem sie ihre Menge variieren und testen. Wir setzen das Verhältnis von vier Plasmidengrößen auf 16:16:1:1 und das Volumen des Transfektionsreagenzes auf 8 'L für eine Brunnentranktion in einer 6-Well-Platte. Ein weiteres Problem ist der Umgang mit den Zellen. Die HEK 293T/17-Erzeugerzellen sind niedrig adhäsionsarm, daher muss die manuelle Handhabung der Zellen sehr schonend sein. Lipofection kann zu einer Erhöhung der Zelldurchlässigkeit führen, und Serum und Antikörper im Medium können die Zytotoxizität erhöhen. Es ist am besten, serum- und antikörperfreie DMEM zu verwenden, um posttransfizierte HEK 293T/17-Zellen zu kultiieren. Darüber hinaus ist die Abholzeit wichtig. Bei 36–48 h nach der Transfektion muss die Farbe des Zellüberstandes überprüft werden, um sicherzustellen, dass er vor der pp-Sammlung rosa oder orange-rosa ist. Gelber Überstand zeigt an, dass das Medium zu sauer ist, um das Zellwachstum zu unterstützen und in der Regel zu schlechten pp-Erträgen führt.
Wir führten den Transfektionstest in einer 6-Well-Platte durch. Um mehr pp Volumen zu erhalten, kann die Anzahl der Transfektionsbrunnen erhöht werden und Überstände, die die gleichen pps enthalten, können zusammengepoolt werden. Alternativ kann eine andere Art von Gefäßen verwendet werden, um den pp-Ertrag zu erhöhen. Zum Beispiel können 18 l Transfektionsreagenz und 5,5 g Plasmid-DNA verwendet werden, um transfektionmitieren mit 2,2 x 106 Zellen in einer 60-mm-Schale durchzuführen. Ebenso kann ein Infektiositätstest in einer 24-Well-Platte durchgeführt werden.
Der Erfolg dieser Technik kann durch viele Faktoren beeinflusst werden. Daher sollte das Verfahren für die Partikelverpackung verschiedener Arten von Viren optimiert werden.
In diesem Protokoll wurden pseudotypisierte Viruspartikel von HPAI H5N1 und H7N9 sowie deren Reassortantien erzeugt. Bei dieser Methode verwenden wir qRT-PCR der GFP-RNA im Infektiositätstest auf Einzelzellebene (als Genomkopien pro Zelle) anstelle von Tissue Culture Infectious Dose 50 (TCID50) oder traditionellem MOI23,38,39. Virusinfektiationsmethoden basieren auf Plaque-Assays oder TCID50-Assays, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind. Beide Assays basieren auf der Messung der sichtbaren zytopathischen Wirkungen (CPE), die durch Virusinfektionen in Zelllinien verursacht werden, so dass es schwierig sein kann, Viren mit geringer Infektiosität zu itrieren (d. h. H7pp in dieser Studie). Wir denken, dass es eine bequeme, effektive und schnelle Methode ist, pps mit qRT-PCR der GFP-RNA in Influenza-pps zu normalisieren.
Zusammengenommen ist unsere Technik sicher und anpassungsfähig und kann verwendet werden, um umhüllte Viren zu untersuchen, einschließlich ihrer Rezeptoren, Tropismen, Hüllglykoproteinfunktion, Neutralisierung von Antikörpern, Entwicklung von Antiviren-Medikamenten, Diagnose und Impfstoffdesign und Bewertung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien von Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science and Technologieschlüsselprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) und Kommunales autonomes Anwendungsprojekt hangzhou für soziale Entwicklung und wissenschaftliche Forschung (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
