Summary
Bu protokol, iki influenza A suşlarından zarf glikoproteinleri ile yüksek titreyen enfeksiyöz viral psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için deneysel bir süreci ve bunların enfekteliğini nasıl belirleyeceklerini açıklamaktadır. Bu protokol, farklı zarf glikoproteinleri ile zarflı virüslerin herhangi bir tür pps geliştirmek için son derece uyarlanabilir.
Abstract
Son derece patojen kuş gribi A virüsü H5N1 (HPAI H5N1) ve H7N9 insanlar ve bunların öldürücü ara sıra doğrudan iletim ciddi halk sağlığı sorunları ve bir salgın olasılığını düşündürmektedir. Ancak, virüsün moleküler anlayışı ilkeldir ve zarf proteinlerinin biyolojik özelliklerini tedavi edici hedefler olarak incelemek ve enfeksiyonu kontrol etmek için stratejiler geliştirmek gereklidir. Kuş gribi virüsünü incelemek için katı bir viral psödotipli parçacık (pp) platformu geliştirdik, hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) zarf glikoproteinlerin fonksiyonel analizi, HAs ve NA'ların reassortment özellikleri, reseptörler, tropizmler, nötralize antikorlar, tanı, enfektivite, ilaç geliştirme ve aşı tasarımı amacıyla. Burada, iki influenza A türünden (HAPI H5N1 ve 2013 kuş H7N9) zarf glikoproteinleri (HA, NA) ile pps oluşturmak için deneysel bir prosedür açıklıyoruz. Onların nesil murine lösemi virüsü (MLV) gibi bazı virüslerin kapasitesine dayanmaktadır, bir pp içine zarf glikoproteinler dahil etmek. Buna ek olarak, bu pps RT-qPCR ile nasıl ölçülür ve yerli ve uyumsuz virüs pps enfekte algılama HAs ve NA'ların kökenine bağlı olarak ayrıntılı. Bu sistem son derece esnek ve uyarlanabilir ve zarflı virüs başka bir tür dahil edilebilir zarf glikoproteinler ile viral pps kurmak için kullanılabilir. Böylece, bu viral parçacık platformu birçok araştırma araştırmalarında vahşi virüsleri incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Viral bir parçacığın görevi, genomunu enfekte olmuş bir konak hücreden enfekte olmayan bir konak hücreye taşımak ve onu bir çoğaltma-yetkin form1'desitoplazmaya veya çekirdeğe ulaştırmaktır. Bu süreç başlangıçta konak hücre reseptörlerine bağlanması ile tetiklenir, virion ve hücre zarlarının füzyon u izledi. Grip virüsleri gibi zarflı virüsler için, başak glikoproteinler reseptör bağlama ve füzyonsorumludur 1,2. Viral zarf glikoproteinler (örneğin, pirojenler, antijenler), virüs yaşam döngüsü başlatma (bağlama ve füzyon), viral patogenez, immünojenite, konak hücre apoptozisi ve hücresel tropizm, hücresel endositik yol, yanı sıra interspecies iletim ve reassortment1,3,4,5,6,7gibi birçok önemli özellikleri ve olayları, yer almaktadır. Viral zarf glikoproteinler üzerinde araştırma bize viral enfeksiyon sürecinin birçok yönünü anlamamıza yardımcı olacaktır. Pseudotyped viral parçacıklar (pp), ayrıca pseudovirions veya psödo partikülleri olarak adlandırılan, bir psödotiplemetekniği8,9,10ile oluşturulabilir. Bu teknoloji hepatit C11,12,hepatit B13, vesiküler stomatit virüsü (VSV)14,15, ve grip virüsü16,17,18,19dahil olmak üzere birçok virüs, psödotipli parçacıklar geliştirmek için kullanılmıştır. Bu teknoloji lentiviruses veya diğer retrovirüslerin Gag-Pol protein dayanmaktadır.
Psödotipli viral parçacıklar, viral zarf glikoprotein ekspresyonu plazmidi, zarf env geni eksik retroviral ambalaj plazmidi ve pp üretici hücrelerine ayrı bir muhabir plazmid kotransfecting tarafından üç plazmid sistemi kullanılarak elde edilebilir. Retrovirüs gag proteini tarafından monte edilir ve virüs zarfprotein1ifade enfekte bir hücre zarından tomurcukları . Bu nedenle, influenza HA ve NA ifade eden bir hücresel membran üzerinde tomurcukları üretmek için retrovirus Gag proteinkullanarak yüksek titer influenza pps elde etmek mümkündür. Önceki çalışmalarımızda, tüm kombinasyonlarda HAs / NAs fonksiyonel ve viral yaşam döngüsü16,17,18,20,21karşılık gelen işlevlerini gerçekleştirmek mümkün idi. Bu pps grip biyolojik özelliklerini araştırmak için kullanılır, hemagglutination dahil, neuraminidaz aktivitesi, HA-reseptör bağlama tropizm, ve enfektivite. HA ve NA viral yaşam döngüsünde hem önemli yüzey fonksiyonel proteinler olduğundan, uyumsuz HAs ve NA'lar influenza farklı suşları türetilen kısmen aralarında reassortment gösterebilir. Burada, üç plazmid psödotipleme sistemi kullanarak, iki HAs ve iki NA 'yi (HPAI H5N1 suş ve H7N9 lekesinden türetilmiş) birleştirerek sekiz tür influenza pps üretiyoruz. Bu sekiz pps türü iki yerli pps içerir, H5N1pp, H7N9pp; iki eşleşmemiş pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; ve sadece tek bir glikoprotein (HA veya NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Grip virüsü üzerine yapılan çalışmalar, H5N1 ve H7N9 gibi biyogüvenlik gereksinimleri ile sınırlıdır. Yaban influenza virüs suşları ile ilgili tüm çalışmalar biyogüvenlik düzeyi 3 (BSL-3) laboratuarında yapılmalıdır. Psödotipli viral parçacık teknolojisi, yapay virion'u biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) ayarında paketlemek için kullanılabilir. Bu nedenle pps, iki büyük glikoproteinine bağlı olarak grip virüsü süreçlerini incelemek için daha güvenli ve yararlı bir araçtır: hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA).
Bu protokol, bu pps'lerin üretimini üç plazmid li kotransfeksiyon stratejisi (Şekil 1'degenel olarak), pps'nin nasıl ölçülecek ve enfektelik tespiti ile açıklar. PP üretimi üç çeşit plazmid içerir (Şekil 1). Retrovirüs Gag-Pol proteinini kodlayan gag-pol geni retrovirüs ambalaj kitinden klonlandı ve pcDNA 3.1 plazmidine yerleştirildi ve pcDNA-Gag-Pol olarak adlandırıldı. Yeşil Floresan Proteini kodlayan geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) geni pTRE-EGFP vektöründen klonlandı, pcDNA 3.1 plazmidine yerleştirildi ve pcDNA-GFP olarak adlandırıldı. Klonlama sırasında bir astar ile bir ambalaj sinyali () dizisi eklendi. HA ve NA genleri sırasıyla pVRC-HA ve pVRC-NA adı verilen bir pVRC plazmidine klonlandı. Son plazmid füzyon proteinini kodlar ve ilgi çekici başka bir füzyon proteini ile değiştirilebilir. Psödotipleme platformumuz iki glikoprotein ekspresyonu içerir: pVRC-HA ve pVRC-NA. Bu bir BSL-2 ayarında farklı virüs suşları arasında reassortment araştırma basitleştirebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gün 1: Hücre Kültürü ve Tohumlama
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U/mL penisilin-streptomisin (DMEM Complete Medium, DCM) 37 °C,%5 karbondioksit (CO2)inkübatörde yaklaşık %80'e kadar uyumludur.
NOT: HEK 293T/17 düşük geçiş li hücreler önerilir. - Hücreleri 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) 1x ile dikkatlice yıkayın.
NOT: HEK 293T/17 hücrelerinin elle kullanımı çok nazik olmalıdır, çünkü kolayca kopabilirler. - PBS'yi çıkarın ve hücreleri 1 mL %0,25 tripsin-etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile ayırın. Hücreleri ayrıştırılmış kadar en fazla 5 dakika için 37 °C,% 5 CO2 kuluçka makinesi çanak yerleştirin.
- 5 mL DCM ekleyerek trypsin'i devre dışı bırakın. Hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak tek hücreli süspansiyoniçine dağıtın.
- Hücre süspansiyonlarını önceden ititli 15 mL santrifüj tüpe aktarın. 4 °C'de 5 dk için 250 x g'de santrifüj ile hücreleri toplayın.
- Mümkün olduğunca süpernatant kadar decant. 6 mL DCM orta hücre peletrere resuspend ve hücreleri saymak. Hücreleri DCM orta ile 1 x 106 hücre/mL'ye seyreltin.
- Hücreleri kuyu başına 1 mL hücre süspansiyonu ile 6 kuyu plakasına tohumlayın. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe sıvazlayın. Plakayı bir gecede (14-16 saat) 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
2. Gün 2: Lipofection Aracılı Dört plazmid Kotransfeksiyon
- Ters ışık mikroskobu altında hücre morfolojisini ve yoğunluğunu kontrol edin. İdeal olarak, hücreler transfeksiyonda yaklaşık %85 oranında konpuz olmalıdır. Orta yı 1 mL serumsuz DMEM ortamı ile değiştirin ve tabağı kuvöze geri koyun.
NOT: HEK 293T/17 hücrelerinin elle kullanımı çok nazik olmalıdır, çünkü kolayca kopabilirler. - Kültürlenmiş hücrelerin her bir kuyusu için transfeksiyon reaktifinin 8 μL'sini Azaltılmış Serum Medium (tüp 1) ile 150 μL'lik bir hacme seyreltin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika (RT, yaklaşık 20 °C) için kuluçka.
NOT: Her transfeksiyon numunesi için 1 ve 2 numaralı iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. - Tüp 2'de, 2,5 μg plazmid DNA'sını 150 μL Azaltılmış Serum Medium'a seyreltin.
NOT: Tüp 2'de, Tablo 1'degösterildiği gibi her plazmid DNA'sını seyreltin. Veziküler stomatit virüsü (VSV) G glikoprotein (plazmid pLP-VSVG) pozitif kontrol olarak kullanıldı, çünkü VSV çok çeşitli hücrelere bulaşabiliyor. Influenza zarf glikoproteinlerinden (Δenv pps) yoksun negatif kontrol parçacıkları pcDNA-Gag-Pol ve pcDNA-GFP plazmidleri kullanılarak üretildi. - 5 dk kuluçka sonra, seyreltilmiş DNA seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin. Hafifçe karıştırın ve RT başka bir 15 dakika kuluçka.
- Hücreleri ve serumiçermeyen ortamı içeren ilgili kuyuya DNA-lipid kompleksini ekleyin. Plakayı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın.
- 37 °C'de 4-6 saat kuluçkadan sonra % 5 CO2 kuluçka makinesi, ortayı çıkarın ve 2 mL DMEM ile değiştirin. 37 °C,%5 CO2 kuluçka makinesinde 36-48 saat daha kuluçka.
NOT: Serumsuz ve antikorsuz DMEM ile değiştirin. Bu protokolde, sekiz pps türü oluşturmak için iki HAs ve iki NAs kullanılabilir (Tablo 1'degösterilmiştir).
3. Gün 3: Duyarlı Hücreler Tohumlama
- Enfektelik tsay için, 96 iyi plaka iyi başına 1 x 104 hücreleri duyarlı hücrelerin her türlü tohum.
NOT: Bu makalede enfekte lik tayini gerçekleştirmek için iki tür hedef hücre kullanın: alveolar türetilmiş insan hücre hattı (A549 hücreleri) ve Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücreleri. MDCK hücreleri grip araştırmalarında yaygın olarak kullanılır ve iyi bir kontrol olabilir. Bu adım esnektir. Diğer hedef hücre hatları araştırma gereksinimlerine göre kullanılabilir. - Plakayı bir gecede (14-16 saat) 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
4. Gün 4: Pseudotyped Viral Parçacık Toplama, Nicelik ve Enfekte Likitlik Testi
- Psödotipli viral parçacık koleksiyonu
- Ortamın rengini kontrol edin. İdeal olarak, açık pembe veya biraz turuncu olmalıdır. Hücreleri 440-460 nm altında ters floresan biyolojik mikroskopla inceleyin.
- 36-48 h posttransfection anda, hücre enkaz ortadan kaldırmak için 0,45 μm polivinilidene florür (PVDF) membran filtresi ile passaging tarafından pps hasat.
- Pps'yi küçük hacimli aliquots'a bölün.
- Pps'yi -80 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ancak, pps enfekteliği donma ve çözülme sonra keskin bir düşüş olacaktır, çünkü bu teşvik edilmez.
- Psödotipli viral parçacık nicelleştirme
- 20 μL saflaştırılmış pps'yi 1,5 mL ribonükleaz (RNase)-free microcentrifuge tüpüne aktarın.
- 0,24 U/mL benzonaz nükleaz 1 μL ekleyin. Herhangi bir DNA ve RNA kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Hedef RNA, yaygın olarak aşağı regüle sitomegalovirüs (CMV)-GFP RNA, pps paketlenmiş ve benzonaz nükleaz tarafından bozulmuş önlemek olabilir. - Benzonaz nükleazını inaktive etmek için örneği -70 °C'de dondurun.
- Zarf proteinlerini sindirmek ve CMV-GFP RNA'yı serbest bırakmak için 50 °C'de 30 dakika boyunca 2 μL proteinaz K. Kuluçka Makinesi ekleyin. 3 dakika boyunca 100 °C'de K proteinini inaktive edin.
- Bir Evrensel Sonda Tek AdımRT-qPCR Kiti ile gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon (qRT)-PCR ile pps ölçün, ileri astar 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', ters astar 5'-GGGTCTCTTCAGAGTGATTGACTAC-3', ve prob kullanarak 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', Bir Gerçek Zamanlı PCR termocycler üzerinde. Enfekte olmadan önce RNA kopya numarası için pps normalleştirin.
- Enfektelik tsası
- Her pps türünü qRT-PCR verileri açısından 4 x 105 kopya/mL (pp normalleştirme) seyreltin.
- Tosil-Fenilalanin Kloromilen-Keton (TPCK)-tripsin'i H7N9 HA'yı barındıran pps'lere 40 g/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. 37 °C'de 1 saat boyunca inkübasyon ile fonksiyonel alt birimleri HA1 ve HA2'yi oluşturur.
NOT: HA1-HA2 dekolte sit alanında birden fazla arginin ve lizin kalıntısı olduğundan, H5'i TPCK-tripsin ile barındıran pps'lerin tedavisine gerek yoktur. Bu çok temel dekolte sitesi her yerde hücresel proteazlar tarafından yarık olabilir. - Normalleştirilmiş pps'yi DMEM ortamı (serumsuz) ile 1:1 oranında (hacim/hacim) karıştırın.
- Hassas hücreleri içeren plakayı biyogüvenlik kabinesine getirin.
- Supernatant aspire ve önceden ısıtılmış PBS 0.1 mL ile bir kez hücreleri yıkayın.
- 0,1 mL pps-DMEM karışımını bir kuyuya ekleyin. Her pps türünün enfektelik testlerini duyarlı bir hücre hattına üç eve ayırın (Şekil 2'degenel olarak).
- 96 kuyu plakasını 37 °C,%5 CO2 kuluçka makinesinde 4-6 saat kuluçkaya yatırın.
- Supernatant aspire ve DCM 0.1 mL ile değiştirin.
- 96 kuyu plakasını 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde 24-36 h daha kuluçkaya yatırın.
5. Gün 5 veya 6: Enfekte Algılama
- 96 kuyu plakasını biyogüvenlik kabinesine getirin.
- Supernatant aspirate ve önceden ısınmış PBS 0.2 mL ile hücreleri 1x yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve 0,1 mL 0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ile hücreleri ayırın.
- Hücreler ayrışına kadar 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.
NOT: 5 dakikadan fazla kuluçkaya yatmalısınız, çünkü bu hücre kümelemeye yol açacaktır. - 0,4 mL DCM ekleyerek trypsin'i devre dışı bırakın.
- Hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak tek hücreli süspansiyon içine dağıtın.
- Hücre süspansiyonlarını soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
- Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ile GFP muhabiri pozitif hücreleri belirleyin.
NOT: GFP muhabiri pozitif hedef hücrelerin oranını belirlemek için, kontrol örneklerini (pps-işlenmemiş A549 hücreleri veya MDCK hücreleri) kullanarak akış sitometre kapılarını ayarlayın ve ardından örnek başına 10.000 hücreden oluşan GFP muhabiri pozitif hücrelerini sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan genel prosedüre bağlı olarak, iki grup HAs/NA'yı veya VSV-G glikoproteinini veya zarfsız glikoproteini birleştiren 10 tip pps ürettik (Tablo 1'degösterilmiştir). Yedisi bulaşıcı. Hiçbir zarf glikoprotein veya sadece liman NA barındıran pps burada herhangi bir enfektelik göstermedi. Grip pp üretim prosedürü Şekil 1'degenel olarak vebaktır. Pps iletim elektron mikrografları (örneğin, H5N1pp) Şekil 3'tegösterilmiştir. Bu pps'lerin enfekte lik testlerinin sonuçları Şekil 4'tegösterilmiştir. Yedi pps türünün enfekteliği hücre başına genom kopyalarında (GCP) değerlendirildi [enfeksiyonun çokluğu (MOI)] değeri 20'ye benzer. H5'i barındıran pps grubunda, H5N1, (H5+N9) ve H5 enfekteliği sırasıyla MDCK için %90,05 ± %4,05, %17,78 ± %1,58, A549 hücre hattı için %10,15 ± %2,85 ve %40,37 ± %4,92, 5,24 ± %1,32, MDCK için %4,88 ± 0,27 idi. H7'yi barındıran pps grubunda, H7N9, (H7+N1) ve H7 enfekteliği sırasıyla %10,45 ± %2,35, 6,75 ± %1,37, A549 hücre hattı için %1,23 ± %0,33 ve %7,61 ± %1,04, 4,12 ± %1,29, MDCK için %1,08 ± 0,02 idi. Pps' in enfekte edici tahlilleri için, özellikle HApp (H5pp, H7pp), eksojen nöraminidaz eklenmedi. Bu enfektelik testinde, PPS enfekteliğini test etmek için kontrol hücresi hattı olarak MDCK hücreleri de kullanılmıştır. VSVGpp'nin enfektivitesi A549 için %20.9 ± 2.00, MDCK hücreleri için %16.02 ± %2.41 idi. Delta-zarf glikoproteinler pp (Δenv pp) çalışmamızda hiçbir enfektelik gösterdi. Bu veriler aynı zamanda çeşitli virüs suşlarından gelen HAs/NAs'lerin enfeksiyöz viral parçacıkları başarıyla üretebildiğini de göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bizim psödotipleme platformu grip araştırmalarında kullanılan bulaşıcı psödotipli viral parçacıklar gelişebilir.
Şekil 1: Grip pp üretim prosedürüne genel bakış. (A) Ambalaj plazmid pcDNA-Gag-pol, muhabir plazmid pcDNA-GFP ve zarf glikoprotein ekspresyonu plazmidleri pVRC-HA ve pVRC-NA, pp üreten HEK 293/17 hücrelerine ayrılır. (B) HEK 293/17 hücrelerinde Gag-Pol poliproteinlersentez edilir ve bilinmeyen bir mekanizma ile hücre zarına taşınır. Glikoproteinler HA ve NA taşınır ve salgı yolu ile hücre zarına demirlenir. Muhabir plazmid pcDNA-GFP tek iplikçikli gfp genomik RNA'ya aktarılır. (C) Taşıma sırasında veya sonrasında, Gag-Pol proteini psi-RNA ambalaj sinyalleri aracılığıyla tek iplikli gfp-GFP genomik RNA'yı toplayarak tomurcuklanma öncesi kompleksleri oluşturur. (D) Monte gag-pol-- -RNA kompleksi membran eğriliğini tetikler ve tomurcuk oluşumuna yol açtı. Tomurcuklanma sırasında, viral zarf glikoproteinler HAs / NA'lar doğmakta olan parçacıklar içine dahil edilir. Tomurcuklanma parçacık hücre zarından kopdukça tamamlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Enfektelik telinde genel düzenleme. Her pps tipinin bir duyarlı hücre hattına yapılan enfekte liktestleri trilikat olarak ölçüldü. Alveolar türetilmiş insan hücreleri A549 ve MDCK duyarlı hücreler olarak kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PPS iletim elektron mikrografları. Konsantre olmayan (sol) ve konsantre (sağ) supernatant. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Normalleştirilmiş pps'nin enfekteliği. Enfektelik enfekte hücrelerin ortalama ± ± standart sapma (SD) yüzdesi olarak sunulur (n = 3). PPS'nin enfekteliği A549 ve MDCK hücreleri olmak üzere iki hücre hattında değerlendirildi. Yedi pps türü iki hedef hücrede çeşitli enfektelik profilleri görüntülenmiştir. Herhangi bir bulaşıcılık ortaya koyamadıkları için burada sadece NA'yı barındıran pps gösterilmez. Hiçbir zarf glikoproteinler (Δenv) barındıran pps de çalışmamızda hiçbir enfektivite gösterdi. Enfektelik yüzdesi, gfp muhabiri pozitif hücrelerin örnek başına 10.000 hücredeki oranını belirtir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| plazmid preparatları | ||||||||||
| plazmid (3L, 0.1 g/μL) | H5N1 | (H5+N9) | H7N9 | (H7+N1) | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | Δenv |
| pcDNA-Gag-pol | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pcDNA-GFP | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pVRC-HA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 2.14 | - | 2.14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | - | 2.14 | - | 2.14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2.14 | - |
Tablo 1: H5N1 ve H7N9 virüslerinden elde edilen HA ve NA proteinlerinin kombinasyonları ve 6 kuyu plakasının iyi bir şekilde transfeksiyonu için gerekli miktarda plazmid DNA'sı (hacim). Plazmid preparatlarının konsantrasyonuna göre, her plazmid DNA'sının gerekli hacmini hesaplayın. Bir kuyunun tranfeksiyonu için toplam plazmid DNA miktarı 2.5 μg'dir. En yüksek transfeksiyon verimliliğini ve en düşük spesifik olmayan etkileri elde etmek için, plazmid DNA ve transfeksiyon reaktif konsantrasyonlarını değiştirerek transfeksiyon koşullarını optimize ettik. Optimizasyondan sonra, dört plazmid miktarının oranı 16:16:1:1 olarak belirlenmiştir. 6 kuyu plakasının bir kuyu transfeksiyonunda kullanılan transfeksiyon reaktifinin hacmi 8 μL'dir (tabloda gösterilmez). H5N1 ve H7N9 virüslerinden iki HAs ve iki NAs pps sekiz tip oluşturmak için kullanılabilir: H5N1pp, (H5 + N9)pp, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1)pp, H7pp ve N9pp. Hiçbir zarf glikoproteinler (Δenv) veya sadece LIMAN NA glikoproteinler barındıran pps çalışmamızda hiçbir enfektelik gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, bir BSL-2 ayarında influenza virüs psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için bir yöntem açıklar. Muhabir plazmid pcDNA-GFP pps dahil ve bir enfektelik testi FACS tarafından pps ölçmek için kullanılabilir. Grip araştırmalarında yaygın olarak kullanıldığı için iki tür duyarlı hücre hattı seçtik. MDCK hücreleri bu çalışmalarda kullanılan değişken ölümsüzleştirilmiş insan hücrelerine iyi bir kontrol sağlayacaktır.
Bu protokol retrovirüs MLV dayanmaktadır, hangi bir GFP muhabiri dahil ve hücresel membran üzerinde tomurcukları üretmek. Bu teknik yaygın ambalaj grip virüs parçacıklarıiçingeliştirilmiştir 4,22,23,24. Bazı diğer sistemler lentiviral HIV-1 pseudotyping sistemi19,25,26 veya baculovirus-böcek hücre ifade sistemi27,28,29dayanmaktadır. Diğer birçok muhabir genler de pseudoparticle üretimi için kullanılmıştır, luciferase gibi (lüminesans)30,31,32,33, β-gal / LacZ (kolorimetri ile)34,35, ve salgılanan alkali fosfatse36,37. Millet ve ark. koronavirüs psödotipli parçacıkların enfekteliğini ölçmek için luciferase testi kullanılır33. Luciferase ile karşılaştırıldığında, GFP'nin yeşil floresan'ı ters floresan biyolojik mikroskopla kolayca gözlenir. Bu transfeksiyon ve enfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için uygun bir yoldur. Bu çalışmada, enfektelik doğrudan FACS ile GFP-pozitif hücreleri tespit edilerek tespit edilebilir.
Bu yöntemde, birkaç adım sonuçları kritik etkiler. Optimize edilmiş hücre yoğunluğu başarılı transfeksiyon için kritik bir faktördür. Bu protokolde, %80-90 aralığında ki hücre yoğunluğunun influenza virus pp üretimi için en uygun olduğu bulunmuştur. Daha yüksek veya daha düşük hücre yoğunluğu daha düşük transfeksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Üretici hücrelerinin iyi fizyolojik durumu da yüksek partikül üretimi için çok önemlidir. Bu nedenle bu protokolde pps üretmek için alt hücre geçişi HEK 293T/17 hücreleri önerilir. Ayrıca, transfeksiyon reaktifhacmi ve dört plazmid miktarlarının oranı da transfeksiyon verimliliğini etkileyebilir. En yüksek transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, bu faktörleri miktarlarını değiştirerek ve test ederek optimize etmek önerilir. Dört plazmid miktarının oranını 16:16:1:1 olarak, transfeksiyon reaktifinin hacmini ise 6 kuyuluk plakasında bir kuyu tranfection için 8 μL olarak belirledik. Başka bir konu hücrelerin işlenmesidir. HEK 293T/17producer hücreleri düşük yapışma vardır, bu nedenle hücrelerin manuel kullanımı çok nazik olmalıdır. Lipofection hücre geçirgenliğinin artmasına yol açabilir ve ortamdaserum ve antikorlar sitotoksisiteyi artırabilir. En iyisi, transfeced HEK 293T/17 hücrelerinin kültüre serumsuz ve antikorsuz DMEM'i kullanmaktır. Ayrıca, toplama süresi önemlidir. 36-48 saat post-transfection anda, hücre supernatant rengi pp toplama önce pembe veya turuncu-pembe olduğundan emin olmak için kontrol edilmelidir. Sarı supernatant orta hücre büyümesini desteklemek için çok asidik olduğunu gösterir ve genellikle kötü pp verimleri yol açar.
Transfeksiyon titresini 6 kuyuluk tabakta gerçekleştirdik. Daha fazla pp hacmi elde etmek için transfection kuyularının sayısı artırılabilir ve aynı pps içeren supernatants birlikte havuza olabilir. Alternatif olarak, gemilerin diğer bazı tür pp verimi artırmak için kullanılabilir. Örneğin, 18 μL transfeksiyon reaktifi ve 5,5 g plazmid DNA'sı bir 60 mm çanakta 2,2 x 106 hücreile transfeksiyon yapmak için kullanılabilir. Benzer şekilde, bir enfektelik tsay 24 kuyu plaka yapılabilir.
Bu tekniğin başarısı birçok faktörden etkilenebilir. Bu nedenle, prosedür virüslerin farklı parçacık ambalaj için optimize edilmelidir.
Bu protokolde HPAI H5N1 ve H7N9'un psödotipli viral partikülleri ve bunların reassortantları üretildi. Bu yöntemde, Doku Kültürü Bulaşıcı Doz 50 (TCID50) veya geleneksel MOI23,38,39yerine tek hücre düzeyinde (hücre başına genom kopyaları olarak) enfekte lik analizinde GFP-RNA qRT-PCR kullanın. Virüs enfekte titrasyon yöntemleri plak tahlilleri veya TCID50 tahlilleri dayanmaktadır, hangi zaman alıcı ve emek yoğun hem de. Her iki tahliller hücre hatlarında virüs enfeksiyonu neden görünür sitopatik etkilerin ölçümü güveniyor (CPE), bu nedenle düşük enfekte lik virüslertitrate zor olabilir (yani, Bu çalışmada H7pp). Grip pps'inde bulunan GFP RNA'nın qRT-PCR ile pps'yi normalleştirmenin uygun, etkili ve hızlı bir yöntem olduğunu düşünüyoruz.
Birlikte ele alındığında, tekniğimiz güvenli ve uyarlanabilir ve onların reseptörleri, tropizmler, zarf glikoprotein fonksiyonu, nötralize antikorlar, antivirüs ilaç geliştirme, tanı ve aşı tasarımı ve dahil olmak üzere zarflı virüsler, çalışma için kullanılabilir Değerlendirme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Zhejiang İl Tıp ve Sağlık Bilimleri ve Teknoloji Planı (Hibe Numaraları, 2017KY538), Hangzhou Belediye Tıp ve Sağlık Bilimleri ve Teknoloji Planı (Hibe Numaraları, OO20190070), Hangzhou Tıp Bilimi ve Teknoloji nin anahtarı Projesi (Grant Numbers, 2014Z11) ve Hangzhou belediye nin sosyal gelişim ve bilimsel araştırma özerk uygulama projesi (Hibe Numaraları, 20191203B134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
