Summary
تفاصيل المخطوطة الحالية كيفيه عزل هيبوكامبال الشرايين والشعيرات الدموية من دماغ الفار وكيفيه الضغط عليها للضغط علي التصوير العضلي ، والمناعي ، والكيمياء الحيوية ، والدراسات الجزيئية.
Abstract
من التغييرات السلوكية خفيه إلى الخرف في مرحله متاخره ، يتطور العجز المعرفي الوعائي عاده بعد الاسكيميه الدماغية. السكتة الدماغية وتوقف القلب هي امراض المثلية الجنسية بشكل ملحوظ ، وكلاهما يحفز نقص التروية الدماغية. ومع ذلك ، كان التقدم في فهم الاعاقه المعرفية الوعائية ، ومن ثم تطوير العلاجات الخاصة بالجنس ، محدود جزئيا من التحديات في التحقيق في دوران المخ من نماذج الفئران في الدراسات الوظيفية. هنا ، نقدم نهجا لفحص الإشارات الشعرية إلى الشريانية في السابق فيفو هيبوكامبال الشعيرات الشعرية-Pareniole (hicapa) الاعداد من الدماغ الماوس. نحن وصف كيفيه عزل ، تعليب ، والضغط علي دوران الاوعيه الدقيقة لقياس قطر شرايين استجابه لتحفيز الشعرية. نعرض الضوابط الوظيفية المناسبة التي يمكن استخدامها للتحقق من سلامه الاعداد HiCaPA وعرض النتائج النموذجية ، بما في ذلك اختبار البوتاسيوم كعامل اقتران الاوعيه الدموية وتاثير المثبط تميزت مؤخرا من Kir2 الداخل تصحيح البوتاسيوم قناه الاسره ، ML133. وعلاوة علي ذلك ، نقارن الاستجابات في الاستعدادات التي يتم الحصول عليها من الفئران الذكور والإناث. في حين ان هذه البيانات تعكس التحقيقات الوظيفية ، ويمكن أيضا ان تستخدم نهجنا في البيولوجيا الجزيئية ، والكيمياء المناعية ، ودراسات الفيزيولوجيا الكهربية.
Introduction
وكانت الدورة الدموية علي سطح الدماغ موضوع الكثير من الدراسة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى امكانيه الوصول التجريبية. ومع ذلك ، فان طوبولوجيا الاوعيه الدموية الدماغية تخلق مناطق متميزة. وعلي النقيض من شبكه قرض قويه غنيه في اناستاوسيس مع قدره كبيره لأعاده توجيه تدفق الدم ، والشرايين داخل الاوعيه الدموية (PAs) العرض التبعي محدوده ، كل واحد منهم النبض حجم منفصل من الانسجه العصبية1،2. وهذا يخلق تاثير عنق الزجاجة علي تدفق الدم الذي ، مع الميزات الفسيولوجية فريدة من نوعها3،4،5،6،7،8، يجعل الشرايين داخل الدماغ موقع حاسم لتدفق الدم الدماغي (cbf) المادة9،10. وعلي الرغم من التحديات التقنية المتاصله في عزل وتعليب نظام الأداء ، شهد العقد الأخير زيادة في الاهتمام بالدراسات الوظيفية السابقة لفيفو باستخدام السفن المضغوطة11و12و13و14و15و16و17. أحد أسباب هذا الاهتمام المتزايد هو الجهد البحثي الكبير الذي اجري علي اقتران الاوعيه العصبية (NVC), اليه الحفاظ علي فرط الدم الوظيفي الدماغ18.
إقليميا, CBF يمكن ان تزيد بسرعة بعد تنشيط العصبية المحلية19. أليات الخلوية وخصائص الإشارات التي تتحكم في NVC غير مفهومه تماما. ومع ذلك, حددنا دور غير متوقع سابقا لشعيرات الدماغ خلال nvc في الاستشعار عن النشاط العصبي وترجمته إلى اشاره الكهربائية الاستقطاب لتمدد الشرايين المنبع20,21,22. إمكانيات العمل23و24 وفتح القناات الكبيرة التي تعمل بالتوصيل Ca2 +-المنشطk + (BK) علي القدمين الفلكيتين25,26 زيادة تركيز أيون البوتاسيوم الخلالي [k +]o, الذي يؤدي إلى تنشيط المعدل الداخلي القويK + (كير) القناات في بطانة الاوعيه يتم تنشيط هذه القناة عن طريق الخارجيةK + ولكن أيضا عن طريق فرط الاستقطاب نفسه. الانتشار من خلال تقاطعات الفجوة ، التيار فرط الاستقطاب ثم يجدد في الخلايا البطانية الشعرية المجاورة تصل إلى الشرايين ، حيث انه يسبب الاسترخاء عضلي وزيادة cbf20،21. وقد أدت دراسة هذه اليه إلى تطوير الاستعداد لقياس القطر الشرايين اثناء التحفيز الشعري مع العوامل الفعالة للاوعيه ، بالضغط علي الشعيرات الشعرية. ويتكون التحضير CaPA من الجزء الشرياني الداخلي الذي تم تعليبه مع الاجتثاث الشعرية سليمه ، المصب. يتم ضغط نهايات الشعرية ضد قاع الزجاج الغرفة بواسطة ميكروماص ، والتي يسد وتستقر تشكيل الاوعيه الدموية بأكمله20،21.
قدمنا سابقا الابتكارات المفيدة من خلال التصوير الاستعدادات capa من اللحاء الماوس20,21 والشرايين من اللوزة الفئران13 والحصين16,17. كما يتلقى الاوعيه الدموية هيبوكامبال المزيد من الاهتمام نظرا لقابليها للظروف المرضية ، وهنا نقدم طريقه خطوه بخطوه لاعداد CaPA من الفرس الحصين (HiCaPA) التي لا يمكن استخدامها فقط في الدراسات NVC وظيفية ولكن أيضا في البيولوجيا الجزيئية ، والكيمياء المناعية ، والفيزيولوجيا الكهربية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة علي جميع التجارب من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعه كولورادو, Anschutz الطبية الحرم الجامعي وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية من المعاهد الوطنية للصحة.
1-الحلول
- استخدام MOPS-المحلول الملحي المخزنة لتشريح والحفاظ علي عينات في 4 درجه مئوية قبل استخدامها. لا غاز الحل. اعداد MOPS مخزنه المالحة مع التركيب التالي: 135 mM كلوريد الصوديوم ، 5 ملم KCl ، 1 مم KH2بو4، 1 مم mops4، 2.5 mM cacl2، 5 مم الجلوكوز ، 3 مم mops ، 0.02 mm أدتا ، 2 ملليمتر Pyruvate ، 10 ملغ/مل البقري مصل الزلال ، pH 7.3 في 4 ° c.
- استخدام السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) كحل الحمام ومحلول ماصه. الغاز علي حد سواء aCSF و Ca2 +-مجانا acsf مع 5 ٪ CO2، 20 ٪ س2، و N2 التوازن. اعداد الحل مع التركيب التالي: 125 mM كلوريد الصوديوم ، 3 ملم KCl ، 26 ملم ناسكو3، 1.25 Mm الجناح2بو4، 1 مم mgcl2، 4 مم الجلوكوز ، 2 مم cacl2، pH 7.3 (مع التهوية مع 5 ٪ CO2، 20 ٪ س2، و N2 التوازن).
- الحصول علي تمدد القصوى في Ca اسميا2 +-مجانا acsf (0 مم [ca2 +]o, 5 mm egta).
2-اعداد غرفه الأعضاء
- ادراج الشعيرات الدموية الزجاجية البورسيليكات (خارج القطر = 1.2 مم ؛ القطر الداخلي = 0.69 مم ؛ الطول = 10 سم) في ساحبه زجاجيه. سحب الشعرية لجعل طويلة ، غيض رقيقه في نهاية واحده.
- إلى جانب واحد من الغرفة ، قم باضافه الكانولا التي يمكنها الاتصال بمضخة التمعجيه مصغره للضغط علي الوعاء بالاناره. تحت المجهر تشريح ، كسر غيض من قني بحيث يكون صغيرا بما يكفي لتناسب السفينة من الفائدة ، ولكن كبيره بما يكفي للسماح للحلول لتدفق من خلال غيض. تاكد من ان الطرف هو تقريبا 10-15 ميكرومتر في القطر.
- ملء قني باستخدام حقنه مع فلتر 0.22 μm المرفقة مع acsf الأوكسيجين. تاكد من عدم وجود فقاعات الهواء أو الحطام في cannula.
- أضافه اثنين من الأكلات الأخرى إلى الجانب الآخر من الغرفة. لا تكسر نصائحهم.
3. الحصين تشريح والعزلة
- موت ببطء وقطع راس الماوس. لهذه التجربة ، استخدم ماوس C57BL6/J البالغ من العمر 8 أسابيع لمقارنه الاختلافات بين الذكور والإناث. حقن الماوس مع بنتوباربيتال وقطع الراس مع مقص الجراحية.
- باستخدام مقص تشريح الصغيرة ، وقطع الجلد علي طول الخط الأوسط في الأعلى من راسه. تحريك الجلد قباله إلى الجانبين.
- بدءا من الجانب الذيليه من الجمجمة ، وقطع الجمجمة علي طول الخط الأوسط حتى يتم الوصول إلى المصابيح حاسة الشم. أزاله أجزاء من الجمجمة حتى يتم كشف المخ.
- أزاله الدماغ ببطء ، بدءا بالقرب من الأنف من الماوس. فصل الدماغ من المصابيح حاسة الشم, الأعصاب القحفيه, والحبل الشوكي عن طريق قطع من خلال الهياكل مع مقص تشريح الصغيرة.
- وضع الدماغ في لوحه تشريح مع الحل MOPS ما يكفي لغمر تماما عليه. باستخدام المجهر تشريح ، وضع الدماغ في وسط لوحه تشريح مع الجانب البطني التي تواجه أسفل.
- باستخدام شفره الحلاقة ، وقطع الدماغ في النصف علي طول الشق الطولي. امسك النصل بحيث تكون الحافة الحاده موازيه لأسفل لوحه التشريح. اضغط علي النصل من خلال الدماغ في ضربه واحده. نقل نصف الكره الواحد إلى جانب اللوحة.
- نفذ الخطوات التالية لكل نصف كره بشكل منفصل أو بالتوازي.
- وضع نصف الكره الارضيه في وسط اللوحة حتى الخط الأوسط هو الذي يواجه أسفل. ثم استخدام شفره الحلاقة لقطع علي طول الشق عرضيه لأزاله المخيخ وجذع الدماغ. دفع النصل مباشره من خلال الانسجه.
- تدوير نصف الكره الارضيه بحيث يواجه الجانب الإنسي (الشكل 1ا). استخدام ملعقة واحده لعقد الدماغ في المكان. باستخدام ملعقة ثانيه ، قم بادراج الطرف أسفل الجسم السفلي ومغرفة تحت لأزاله المهاد ، الحاجز ، والأعماق ، والتي تغطي الحصين (الشكل 1ب).
- تاكد من ان الحصين هو الآن مرئية كبنيه منحنيه بالقرب من الجانب الخلفي لمخ. استخدام ملعقة واحده لعقد مخ في مكان, استخدام ملعقة الثانية لمغرفة الحصين من مخ (الشكل 1ج).
- نقل وهيبوكامبي إلى لوحه تشريح جديده شغل حوالي منتصف الطريق مع حل MOPS. تجاهل بقية الدماغ.
4-العزلة الشريانية هيبوكامبال
- أكمل الخطوات التالية لكل حصين.
- دبوس أسفل واحده من وهيبوكامبي باستخدام دبابيس صغيره في كل نهاية القسم. الشريان الهيبوكامبال يواجه.
- باستخدام ملقط حاد جدا ، وتمتد بلطف أقسام صغيره من الحصين. وهذا سوف يخفف من الانسجه المحيطة الشرايين ، مما يجعل من الأسهل لتشريح لهم.
- البحث من خلال الانسجه هيبوكامبال الظهرية لتحديد الشريان العرضي الخارجي (الشكل 1ج)16،27.
- انتزاع بلطف الشريان عرضيه الخارجية وسحب ببطء بعيدا عن الانسجه لجمع الشرايين والشعيرات الدموية النبض منطقه CA3 من الحصين.
- بمجرد عدم وجود المزيد من السفن لأزالها من الانسجه ، وتجاهل وهيبوكامبي. إبقاء الاوعيه علي الجليد في لوحات في حين لا تكون قيد الاستخدام.
5. هيبوكامبال الشعيرات الشعرية-pareniole الشرياني
- العثور علي الشرايين مع الفرع الذي ينتهي مع الشعيرات الدموية. انقله إلى غرفه الأعضاء تاكد من ان الشرايين حوالي 15-30 μm عند المتوسعة بالبالكامل (الشكل 1د).
- بعناية جبل الاوعيه الدموية عن طريق دفع غيض قني من خلال الجدار الشرياني تحت المنطقة المستهدفة. الشريحة بعناية السفينة علي قني حتى يكون هناك ما يكفي من الانسجه لوضع التعادل علي.
- جعل عقده فضفاضة مع الغرز النايلون 12-0 بحيث تناسبها علي الاوعيه الدموية و cannula. استخدام عقده نصف عقبه لتامين العلاقات. ثم سحب نهايات لتشديد عقده وتامين الشرايين إلى cannula. أزاله اي فروع السفينة الدخيلة تحت التعادل عن طريق سحب بلطف لهم مع ملقط.
- جعل ربطه عنق أخرى وتامينه علي الطرف الآخر من الشرايين لختم عليه.
- خفض قني مع السفينة المرفقة حتى انها مسطحه ضد كوفيرسليب في الجزء السفلي من الغرفة. يجب الحرص علي عدم خفض قني كثيرا أو انها سوف كسر.
- باستخدام واحده قني علي الجانب الآخر من الغرفة ، وخفض ذلك بحيث النقطة من ذلك دبابيس أسفل التعادل علي نهاية الشريان.
- استخدام قني الثالث لدبوس أسفل الفرع الشعرية إلى coverslip. وضع غيض علي مقربه من نهاية الفرع في حين ترك نهايات الشعيرات الدموية المكشوفة (وليس تحت cannula).
6. ضغط التصوير العضلي
- نقل الغرفة من نطاق تشريح إلى المجهر مع برنامج التسجيل.
- قم بتوصيل التدفق وتدفق الأنابيب إلى الغرفة للحصول علي التروية. بدء ترويه مع تسخين acsf (37 درجه مئوية) بمعدل تدفق 4 مل/دقيقه.
- قم بتوصيل الكانولا المضغوطة بمضخة التمعجيه مقترنة بمحول ضغط واجلب الضغط الداخلي إلى 20 مم زئبق.
- بدء تشغيل برنامج التسجيل. ضبط المجهر وإعدادات التصوير لتحقيق أوضح صوره ممكنة. أبدا التسجيل بمجرد ان يتم تحسين الإعدادات لبرنامج الكشف.
- زيادة ضغط السفينة تصل إلى 40 مم زئبق اثناء تسجيل قطر الشرايين مع برنامج الكشف عن الحافة.
- السماح ~ 15-20 دقيقه لغسل الحل MOPS من الغرفة مع aCSF ، والسماح للتحضير HiCaPA لتتوازن وتطوير لهجة عضلي.
- لاختبار جدوى السفينة ، وتطبيق 1 μM NS309 الحل إلى الحمام ترويه (انظر الشكل 2ا ، ب والقسم نتائج الممثل). يجب ان تمدد الجزء شرايين ، مما يدل علي حوالي 30-40 ٪ نغمه ميوجينيك كما سبق وصفها3،14،20.
7. التحفيز البؤري لنهايات الشعرية
- مره واحده وقد تم تحديد لهجة خط الأساس لل الشرايين وتقييم وظيفة بطانية ، اختبار استجابه التحفيز الشعرية.
- باستخدام ساحبه الزجاج ، وجعل كانولاس بحيث يكون هناك نقطه غرامه في نهاية واحده. كسر غيض من قني بحيث يتم اختبار المخدرات يمكن ان تتدفق من خلال غيض بسلاسة في 5 psi.
- ملء قني مع محلول المخدرات من الفائدة وأضافه إلى الجزئي 3-محور تعلق علي المجهر. توصيل الأنابيب من نظام طرد الضغط إلى cannula.
- خفض ببطء قني في الحمام بالقرب من الشعيرات الدموية ، والحرص علي عدم ضرب اي جزء من السفينة أو الاجهزه في الغرفة. مناوره غيض من قني بجانب نهايات الشعيرات الدموية دون لمسها. الحفاظ علي غيض من قني قباله الكوفيرسليب لمنع السفينة من ان تحفز إذا كانت التسريبات قني.
- عندما تكون جاهزه لتحفيز الشعيرات الدموية ، وخفض قني إلى الشفة وبجوار الشعيرات الدموية. تنشيط نظام طرد الضغط مع وقت الطرد المطلوب (هنا 20 ثانيه). بمجرد الانتهاء من التحفيز ، ورفع قني قليلا لتجنب المزيد من التحفيز.
- كرر التحفيز عند الضرورة. تغيير الضغط نظام طرد قني لاختبار مركبات المخدرات المختلفة.
- للتاكد من ان يتم تحفيز فقط الشعيرات الدموية ، وملء قني مع 1 μM NS309 الحل وتكرار الخطوات المذكورة أعلاه.
ملاحظه: الخلايا الشعرية البطانية لا تعبر عنK + القناات التي تم تنشيطها من قبل NS309 ، التالي فان الشرايين يجب ان لا تستجيب للتحفيز. إذا كانت الشرايين العقديه ، ثم سوف تحتاج إلى ان تكون أعاده وضعها أو قطر الحفرة سوف تحتاج إلى ان تكون أصغر (انظر الشكل 2ا ، ب والقسم نتائج الممثل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البطانيات الصغيرة (SK) والمتوسطة التوصيل (IK) Ca2 +-الحساسةK + القناات ممارسه تاثير المماطلة علي قطر PAs. تطبيق الحمام من 1 μM NS309 ، وهو الاصطناعية أيك و SK قناه ناهض ، تسبب بالقرب من توسيع القصوى (الشكل 2ا ، ب). ومع ذلك ، تفتقر الخلايا الغشائية الشعرية أيك وقناات SK ولم فرط الاستقطاب ردا علي NS30920. ونتيجة لذلك ، تحفيز نهايات الشعرية مع 1 μM NS309 بواسطة الضغط البؤري طرد (20 ثانيه ، 5 رطل) لم يسبب تمدد الشرايين المنبع (الشكل 2ا ، ب). وتشير هذه النتيجة إلى ان NS309 لم تصل إلى الشرايين في الاستعدادات HiCaPA ويمكن استخدامها كعنصر تحكم لتقييم التقييد المكاني للمجمع المطبق علي الشعيرات الدموية عن طريق طرد الضغط.
تم تصميم هذا الاعداد بشكل أساسي لقياس الإشارات الكهربائية الداخلية من الشعيرات الدموية إلى نظام الأداء. باستخدام اعداد HiCaPA ، قمنا بتطبيق aCSF التي تحتوي علي 10 ملمK + علي نهايات الشعرية وقياس تمدد شرايين المنبع (الشكل 2ا ، ج) كما فعلنا سابقا في الاستعدادات capa من الاوعيه الدموية القشرية20. ثم قمنا بالتحقيق ، لأول مره لمعرفتنا ، الإشارات الكهربائية الشعرية إلى الشريانية في الفئران الإناث باستخدام الاستعدادات HiCaPA. ولم يختلف التمدد الشرايين الذي أثاره التحفيز الشعري مع 10 ممK + بين الاستعدادات من الفئران الذكور والإناث (الشكل 2ا ، ج).
وأخيرا ، فائده أساسيه أخرى لهذا النهج هو امكانيه تطبيق الاداات الدوائية في الحمام قبل التحفيز الشعري. هنا اختبرنا تاثير ML133 ، وضعت مؤخرا مثبط Kir228. بالاضافه إلى 10 μM ML133 إلى الحمام ترويه إلغاء عمليا الناجمة عن الشعرية الشرايين تمدد استجابه لل 10 ملمك + في hicapa الاستعدادات من كل من الفئران الذكور والإناث (الشكل 2ا ، ج). وتشير هذه النتيجة الاخيره إلى ان قناه كير 2.1 يتوسط الإشارات الكهربائية في الاوعيه الدموية الدماغية الإناث كما وصفنا سابقا في دوران الاوعيه الدقيقة القشرية للدماغ الذكور.
الشكل 1: منهجيه العزل والضغط من هيبوكامبال الشعيرات الشعرية (HiCaPA) اعداد من الماوس. (ا) يتم قطع الدماغ المعزولة حديثا في النصف في الطائرة السهمي بعد الشق بين الكره ووضعها مع الجانب الإنسي التي تواجهها. (ب) يتم أزاله المهاد ، والحاجز ، وما بعده بلطف للكشف عن الحصين. (ج) يتم أزاله الحصين بعناية. (د) يتم عزل الشرايين مع الأشجار الشعرية من الحصين ويتم تعليب أحد طرفي الجزء شرايين بماصه صغيره متصلة بنظام ضغط ، والطرف الآخر مسدود. يتم إغلاق نهايات شعريه والحفاظ عليها ضد كوفيرسليب مع غيض من ماصه الزجاج. يرصد القطر الداخلي مع نظام الكشف عن الحافة في واحد أو عده مناطق من الشرايين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحفيز البؤري من الشعيرات الدموية مع 1 μM NS309 ليس له تاثير علي قطر شرايين المنبع ، علي عكس التحفيز مع aCSF التي تحتوي علي 10 ملمK +. (ا) التسجيل التمثيلي لقطر شرايين المنبع الذي يظهر تاثير تطبيق الحمام من 1 μm NS309 متبوعا بالتحفيز المتتابع للشعيرات الشعرية (20 ثانيه ، 5 رطلا في البوصة) مع 1 μm NS309 و acsf تحتوي علي 10 ممK + في غياب أو وجود مثبط قناه Kir2 ML133. تطبيق 10 ملمK + علي الشعيرات الدموية أنتجت توسع شرايين المنبع السريع الذي تم حظره بواسطة 10 μM ML133. NS309 لم يسبب تمدد. ويوضح غياب تمدد شرايين المنبع استجابه للتحفيز الشعري مع NS309 ان المركبات التي يتم إخراجها من الضغط لا تصل إلى الشرايين. (ب) بيانات موجزه تبين التغيرات في القطر الناجمة عن 1 μM NS309 المطبقة في الحمام أو علي الأطراف الشعرية (ن = 14 ؛ * * * *p < 0.0001 ، الاقتران t-اختبار). (ج) بيانات موجزه تبين التغيرات في القطر الشرايين الناجمة عن 10 ممK + تطبق مباشره علي الشعيرات الدموية في الاستعدادات hicapa من الذكور (ن = 6) أو الإناث (n = 8) الفئران قبل وبعد 10 μM ML133 تم تطبيقها في الحمام (* * *p < 0.0005 ، نوفاسكوتيا يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاعداد المضغوط HiCaPA (هيبوكامبال الشعرية-pareniole) الموصوفة في المخطوطة الحالية هو امتداد لإجراءاتنا الراسخة لعزل ، والضغط ، ودراسة الشرايين العقديه29. وقد ذكرنا مؤخرا ان القناات كير 2.1 في الدماغ الخلايا الغشائية الشعرية الزيادات في [K +]o المرتبطة التنشيط العصبية ، وتوليد اشاره فرط الاستقطاب التصاعدي الذي يوسع الشرايين المنبع20. الكشف عن هذا الدور غير المتوقع سابقا لشعيرات الشعرية كان ممكنا في جزء من خلال تطوير التحضير capa من الاوعيه الدقيقة القشرية20,21. تقدم هذه المخطوطة نهجا تجريبيا مماثلا ولكن من هيكل أعمق وأكثر تقييدا من الدماغ الماوس لوصف نهج بسيط وقابل للتكرار للتحقيق في الإشارات الشعرية إلى الشريانية اثناء اقتران الاوعيه الدموية العصبية.
دوران الدماغ المجهري هش بشكل رائع وبعض الممارسات ، وخاصه التقليل من تمدد ومناوله الاوعيه ، يجب ان تستخدم لضمان بقاء الشرايين والشعيرات الدموية. التطوير عفويه من النغمة [ميوتون] المؤشر اولي من تحضير قدره30. ويمكن بعد ذلك تقييم وظيفة بطانية عن طريق أضافه القناات SK و IK ' ناهض NS309 إلى حل الحمام, الذي ينبغي ان يسبب توسيع الحد الأقصى بالقرب. في حاله عدم تطوير لهجة أو استجابه لتطبيق الحمام من NS309 ، يجب ان يتم استبدال اعداد واحد آخر. كما يستخدم NS309 لاختبار انتشار التحفيز الشعري البؤري. لان الخلايا الشعرية البطانية تفتقر SK و IK قنوات20، والتسليم المحلي من NS309 علي الشعيرات الدموية عن طريق الضغط طرد ينبغي ان يكون لها اي تاثير علي القطر شرايين المنبع كما هو موضح في الشكل 2، مما يدل علي ان المركبات لا تحفز بطريق الخطا الشرايين. وبمجرد التحقق من صحة هذه الخطوات ، يمكن اختبار الإشارات الشعرية إلى الشريانية.
هنا درسنا الإشارات الكهربائية عن طريق تحفيز الشعيرات الدموية مع aCSF التي تحتوي علي 10 ملمK +. ومع ذلك ، يمكن استكشاف طرائق الإشارات المختلفة باستخدام النهج الحالي من خلال تحفيز الشعيرات الدموية مع مختلف العوامل المعروفة للاوعيه أو الناقلات العصبية. ومن الفوائد الأخرى لهذا الاعداد امكانيه التحقيق في الاتفاقية ومقارنتها في نهاية المطاف بين الكائنات المختلفة وبين مختلف مناطق المخ. وهذا مثير للاهتمام بشكل خاص لان الدماغ ليست مستهدفه بانتظام من الامراض الدماغية الوعائية31,32. وهناك قيد عام علي النهج المعروض هنا هو انه من خلال عزل دوران الاوعيه الدقيقة ، يتم فقدان المكونات الحاسمة للوحدة العصبية ، مثل الخلايا العصبية والفلكية. الاستعدادات الأخرى ، مثل نافذه الجمجمة للتصوير في الجسم الخارجي cbf ، والحفاظ علي هيكل وحده الاوعيه الدموية سليمه وأكثر ملاءمة لدراسة nvc في نظام سليم. ومع ذلك ، في اعداد نافذه الجمجمة ، من الصعب علي الشرايين الصورة من دون معدات محدده ، مثل المجهر متعدد الفوتونات ، والمناطق الأعمق ، مثل الحصين ، لا تزال صعبه للصورة. وفي هذا الصدد ، فان النهج الذي تم تطويره في مختبر Filosa باستخدام تدفق الاناره للحث علي النغمة العضلية في شرائح المخ يمثل رابطا أنيقا بين شريحة المخ ونهج الجسم الحي33. ومع ذلك ، فان الانسجه العصبية المحيطة يمكن ان تحد من تغلغل المخدرات المطبقة موضعيا ، وزيادة إمكاناتها خارج الهدف وجعل التفسيرات صعبه ، لان العديد من أنواع الخلايا تتعرض للادويه. ونحن في المقام الأول تطوير نهجنا الجسم السابق لمعالجه هذه القضايا المحتملة. وفي الختام ، ينبغي استخدام نهج متعددة بالاقتران مع الدراسة الكاملة لهذه الاتفاقية.
وباختصار ، يصف هذا التقرير الاعداد السليم السابق لهيبوكامبال الشريانية والشعيرات الدموية المضغوطة التي تسمح باختبار اثار العوامل الدوائية والبيولوجية علي المعلمات الوظيفية في مواقع منفصلة علي طول السلسلة الشعرية-الشريانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا جولز موران علي التعليقات الثاقبة علي المخطوطة. وقد تم تمويل هذا البحث من خلال جوائز من المنظمة التي لا تبغي الربح التابعة لمؤسسه كاداسيل معا ، ومركز صحة المراه والبحوث ، وR01HL136636 NHLBI (FD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S.
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
