Summary
Den nåværende manuskriptet detaljer hvordan å isolere hippocampus arterioler og blodkar fra musen hjernen og hvordan å pressurize dem for press myography, immunofluorescence, biokjemi, og molekylær studier.
Abstract
Fra subtile atferdsendringer til sen-stadiet demens, vaskulær kognitiv svekkelse vanligvis utvikler følgende cerebral iskemi. Hjerneslag og hjertestans er bemerkelsesverdig seksuelt dimorphic sykdommer, og begge induserer cerebral iskemi. Men fremgang i forståelsen av vaskulær kognitiv svekkelse, og deretter utvikle sex-spesifikke behandlinger, har vært delvis begrenset av utfordringer i å undersøke hjernen mikrosirkulasjonen fra musemodeller i funksjonelle studier. Her presenterer vi en tilnærming for å undersøke kapillær-til-arteriole signalering i en ex vivo hippocampus kapillær-parenkymatøs Arteriole (HiCaPA) forberedelse fra mus hjernen. Vi beskriver hvordan du isolerer, kannelerer og pressurize mikrosirkulasjonen for å måle arterioler diameter som respons på kapillær stimulering. Vi viser hvilke egnede funksjonelle kontroller kan brukes til å validere HiCaPA forberedelse integritet og vise typiske resultater, inkludert testing kalium som en nevrovaskulære kopling agent og effekten av den nylig karakterisert hemmer av Kir2 innover rectifying kalium kanal familien, ML133. Videre sammenligner vi svarene i forberedelsene innhentet fra mannlige og kvinnelige mus. Selv om disse dataene reflekterer funksjonelle undersøkelser, kan tilnærmingen vår også brukes i molekylærbiologi, immunokjemi og elektrofysiologi studier.
Introduction
Den saify sirkulasjon på overflaten av hjernen har vært gjenstand for mye studier, dels på grunn av sin eksperimentelle tilgjengelighet. Topologien i cerebral blodkar skaper imidlertid atskilte områder. I motsetning til den robuste saify nettverk rik på anastomoser med betydelig kapasitet for å omdirigere blodstrømmen, den intracerebrale parenkymatøs arterioler (Pas) presentere begrenset sikkerhet forsyning, hver av dem perfusing en diskret volum av nervøse vev1,2. Dette skaper en flaskehals effekt på blodstrømmen som, kombinert med unike fysiologiske funksjoner3,4,5,6,7,8, gjør intracerebrale arterioler et avgjørende sted for cerebral blodstrøm (CBF) regulering9,10. Til tross for de tekniske utfordringene som ligger i isolasjon og kanyleringen av Pas, har det siste tiåret sett en økt interesse for ex vivo funksjons studier som bruker trykkbeholdere11,12,13,14,15,16,17. En av grunnene til denne økte interessen er betydelig forskningsinnsats utført på nevrovaskulære kopling (NVC), mekanismen opprettholde hjernen funksjonell hyperemia18.
Regionalt kan CBF raskt øke følgende lokale nevrale aktivisering19. Den cellulære mekanismer og signalering egenskaper kontrollerende NVC er ufullstendig forstått. Men vi identifiserte en tidligere uforutsett rolle for hjernen blodkar under NVC i sensing neural aktivitet og oversette den til en hyperpolarizing elektrisk signal til dilate oppstrøms arterioler20,21,22. Action potensialer23,24 og åpning av store konduktans ca2 +-aktivert K+ (BK) kanaler på astrocytic endfeet25,26 øke interstitiell kalium ion konsentrasjon [K+]o, som resulterer i aktivering av sterke innover likeretter K+ (KIR) kanaler i vaskulær endotelet av blodkar. Denne kanalen er aktivert av eksterne K+ men også av hyperpolarization selv. Sprer seg gjennom gap veikryss, hyperpolarizing strøm deretter regenererer i tilstøtende kapillær endothelial celler opp til arteriole, hvor det fører til myocyte avslapping og CBF øke20,21. Studiet av denne mekanismen førte oss til å utvikle en trykk kapillær-parenkymatøs arteriole (CaPA) forberedelse til å måle arterioler diameter under kapillær stimulering med vasoactive midler. Den CaPA preparatet består av et kanylert intracerebrale arteriole segment med en intakt, nedstrøms kapillær forgreninger. Kapillær endene er komprimert mot kammer glass bunnen av en micropipette, som dualcare og stabiliserer hele vaskulær formasjon20,21.
Vi har tidligere gjort instrumental innovasjoner av Imaging CaPA preparater fra musen cortex20,21 og arterioler fra rotte amygdala13 og hippocampus16,17. Som hippocampus blodkar mottar mer oppmerksomhet på grunn av sin mottakelighet for patologiske tilstander, her gir vi en trinnvis metode for CaPA forberedelse fra musen hippocampus (HiCaPA) som ikke bare kan brukes i funksjonelle NVC studier, men også i molekylærbiologi, immunokjemi, og elektrofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Colorado, Anschutz Medical campus og ble utført i henhold til retningslinjene fra National Institutes of Health.
1. løsninger
- Bruk MOPPER-bufret saltvann for disseksjon og for å holde prøvene ved 4 ° c før utnyttelsen. Ikke gass løsningen. Forbered MOPPER bufret saltvann med følgende sammensetning: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mm CaCl2, 5 mM GLUKOSE, 3 mM mopper, 0,02 mm EDTA, 2 mm pyruvat, 10 mg/ml storfe-serum albumin, pH 7,3 ved 4 ° c.
- Bruk kunstig spinalvæske (aCSF) som bade løsning og pipette løsning. Gass både aCSF og ca2 +-gratis aCSF med 5% co2, 20% O2og N2 balanse. Klargjør løsningen med følgende sammensetning: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mm NaH2PO4, 1 mm MgCl2, 4 mm glukose, 2 mm CaCl2, pH 7,3 (med lufting med 5% co2, 20% O2og N2 balanse).
- Oppnå maksimal utvidelse i nominelt ca2 +-gratis aCSF (0 mm [ca2 +]o, 5 mm EGTA).
2. orgel kammer forberedelse
- Sett inn Borosilikatglass glass kar (utvendig diameter = 1,2 mm; innvendig diameter = 0,69 mm; lengde = 10 cm) til et glass avtrekker. Trekk kapillær for å gjøre en lang, tynn spissen i den ene enden.
- Til den ene siden av kammeret, tilsett en kanyle som kan kobles til en miniatyr peristaltisk pumpe for å luminally pressurize fartøyet. Under et disseksjon mikroskop bryter du tuppen av kanyle slik at den er liten nok til å passe til fartøyet av interesse, men stor nok til å tillate løsninger å strømme gjennom spissen. Pass på at spissen er omtrent 10-15 μm i diameter.
- Fyll kanyle ved hjelp av en sprøyte med et vedlagt 0,22 μm filter med oksygenrikt aCSF. Pass på at det ikke er luftbobler eller rusk i kanyle.
- Legg til to flere kanyler på motsatt side av kammeret. Ikke bryte sine tips.
3. hippocampus disseksjon og isolasjon
- Euthanize og halshugge en mus. For dette eksperimentet kan du bruke en 8-ukers-gammel C57BL6/J-mus for å sammenligne forskjellene mellom menn og kvinner. Injiser musen med pentobarbital og halshugge med kirurgisk saks.
- Ved hjelp av små disseksjon saks, kutt huden langs midtlinjen på toppen av hodet. Beveg huden bort til sidene.
- Starter på caudal siden av skallen, kutt skallen langs midtlinjen til olfactory pærer er nådd. Fjern deler av skallen til cerebrum er eksponert.
- Sakte fjerne hjernen, som starter nær nesen på musen. Skill hjernen fra olfactory pærer, skallen nerver, og ryggmargen ved å skjære gjennom strukturer med små disseksjon saks.
- Plasser hjernen i en disseksjon plate med nok MOPPER løsning for å helt senke den. Bruk et disseksjon mikroskop til å plassere hjernen i midten av disseksjon platen med den ventrale siden vendt ned.
- Ved hjelp av et barberblad, kutt hjernen i to langs langsgående sprekken. Hold bladet slik at den skarpe kanten er parallell til bunnen av disseksjon plate. Trykk bladet gjennom hjernen i ett slag. Flytt en halvkule til siden av platen.
- Utfør følgende trinn for hver halvkule separat eller parallelt.
- Plasser en halvkule i midten av platen slik at midtlinjen vender ned. Deretter bruker barberbladet til å skjære langs den tverrgående sprekken for å fjerne lillehjernen og hjernestammen. Skyv bladet rett gjennom vevet.
- Roter halvkule slik at midtre side vender opp (figur 1A). Bruk en slikkepott til å holde hjernen på plass. Ved hjelp av en andre slikkepott, sett spissen under corpus callosum og scoop under for å fjerne thalamus, septum og hypothalamus, som dekker hippocampus (figur 1B).
- Sørg for at hippocampus nå er synlig som en buet struktur nær bakre side av cerebrum. Bruke en slikkepott til å holde cerebrum på plass, bruk den andre spatel til å øse hippocampus ut av cerebrum (figur 1C).
- Overfør hippocampi til en ny disseksjon plate fylt omtrent halvveis med MOPPER-løsning. Kast resten av hjernen.
4. hippocampus arteriole isolasjon
- Fullfør følgende trinn for hver hippocampus.
- Fest en av hippocampi ved hjelp av små pinner i hver ende av seksjonen. Hippocampus arterien vender opp.
- Ved hjelp av veldig skarp tang, forsiktig strekke små deler av hippocampus. Dette vil løsne vevet rundt arterioler, noe som gjør det lettere å analysere dem.
- Søk gjennom rygg hippocampus vev for å identifisere den utvendige tverrgående arterien (figur 1C)16,27.
- Forsiktig grip den eksterne tverrgående arterien og langsomt trekke den bort fra vevet for å samle arterioler og blodkar perfusing den CA3 regionen i hippocampus.
- Når det ikke er flere fartøy som skal fjernes fra vevet, kast hippocampi. Hold skipene på isen i platene mens de ikke er i bruk.
5. hippocampus kapillær-parenkymatøs arteriole kanyleringen
- Finn en arteriole med en gren som ender med blodkar. Overfør den til orgel kammeret. Påse at arteriole er ca. 15-30 μm når det er fullt utvidet (figur 1D).
- Monter blodkaret forsiktig ved å skyve kanyle spissen gjennom arteriole veggen under målområdet. Skyv fartøyet forsiktig inn på kanyle til det er nok vev til å sette på slipset.
- Lag en løs knute med 12-0 nylon sting slik at den passer over blodkaret og kanyle. Bruk en knute i en halv hindring for å sikre bånd. Trekk deretter endene for å stramme knuten og fest arteriole til kanyle. Fjern eventuelle overflødig fartøy grener under slipset ved å trekke dem forsiktig med tang.
- Lag en ny slips og fest den på den andre enden av arteriole for å forsegle den.
- Senk kanyle med det vedlagte fartøyet til det er flatt mot dekkglass på undersiden av kammeret. Være forsiktig ikke for å lavere det kanyle for mye eller den ville brekke.
- Ved hjelp av en kanyle på motsatt side av kammeret, Senk den slik at poenget med det pinner ned tie på slutten av arteriole.
- Bruk den tredje kanyle til å feste kapillær grenen til dekkglass. Plasser tuppen nær enden av grenen og la endene av blodkar eksponert (ikke under kanyle).
6. Trykk myography
- Flytt kammeret fra disseksjon omfang til mikroskopet med opptaksprogramvaren.
- Koble tilsig og utløps slangen til kammeret for å Start med oppvarmet aCSF (37 ° c) med en strømningshastighet på 4 mL/min.
- Fest pressurizing kanyle til en peristaltisk pumpe sammen med en trykk svinger og Bring det innvendige trykket til 20 mm HG.
- Start innspillingen programvare. Juster mikroskopet og bildeinnstillingene for å oppnå det klareste bildet som er mulig. Start opptaket når innstillingene er optimalisert for gjenkjenningsprogramvaren.
- Øke trykket av fartøyet opp til 40 mm HG mens innspillingen av arteriell diameter med en kantdeteksjon programvare.
- Tillat ~ 15-20 min å vaske MOPPER løsning ut av kammeret med aCSF, og å la HiCaPA forberedelse til å likevekt og utvikle myogenic tone.
- For å teste levedyktigheten til et fartøy, Påfør 1 μM NS309-løsning på badekaret (se figur 2a, B og representant resultat seksjonen). Den arterioler segmentet må dilate, demonstrere om 30-40% myogenic tone som tidligere beskrevet3,14,20.
7. fokus stimulering av kapillær ender
- Når grunnlinjen tonen for arteriole er etablert og endothelial funksjonen vurdert, teste responsen av kapillær stimulering.
- Bruk et glass avtrekker, gjør kanyler slik at det er et fint punkt i den ene enden. Bryte spissen av en kanyle slik at stoffet testet kan strømme gjennom spissen jevnt på 5 PSI.
- Fyll kanyle med stoff løsningen av interesse og legg den til en 3-akse micromanipulator som er festet til mikroskopet. Koble slangen fra trykk utløsings systemet til kanyle.
- Langsomt senke kanyle inn i badet i nærheten av blodbad, være forsiktig med å treffe noen del av fartøyet eller maskinvaren i kammeret. Manøvrere spissen av kanyle ved siden av endene av blodkar uten å berøre dem. Hold spissen av kanyle like ved dekkglass for å hindre at fartøyet blir stimulert hvis kanyle lekker.
- Når du er klar til å stimulere blodkar, Senk kanyle til dekkglass og rett ved siden av blodkar. Aktiver trykk utløsings systemet med ønsket utløsings tid (her 20 s). Når stimulering er ferdig, heve kanyle litt for å unngå ytterligere stimulering.
- Gjenta stimulering etter behov. Endre trykk utløsings system kanyle for å teste ulike legemiddel forbindelser.
- For å bekrefte at bare blodkar blir stimulert, fyll kanyle med 1 μM NS309-oppløsning og Gjenta trinnene ovenfor.
Merk: kapillær endothelial celler ikke uttrykke K+ kanaler AKTIVERES av NS309, slik at arteriole må ikke svare på stimulering. Hvis arteriole utvider, vil kanyle må flyttes eller diameteren av hullet må være mindre (se figur 2A, B og representant resultater delen)...
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endothelial små-konduktans (SK) og middels-konduktans (IK) ca2 +-sensitive K+ Channels utøve en Dilatory innflytelse på diameteren av Pas. Bad anvendelse av 1 μM NS309, en syntetisk IK og SK kanal Agonistiske, forårsaket nær maksimal utvidelse (figur 2a, B). Men kapillær endothelial celler mangler IK og SK kanaler og ikke hyperpolarize som svar på NS30920. Som et resultat av stimulerende kapillær ender med 1 μM NS309 av fokal press utstøting (20 s, 5 PSI) ikke forårsake oppstrøms arterioler utvidelse (figur 2a, B). Dette resultatet indikerer at NS309 ikke nådde arteriole i HiCaPA preparater og kan brukes som en kontroll for å vurdere den romlige begrensningen av sammensatte påført blodkar ved trykk utstøting.
Dette preparatet ble fundamentalt designet for måling av innvendig-ut elektriske signalering fra blodkar til PAs. Ved hjelp av HiCaPA-preparatet brukte vi aCSF som inneholdt 10 mM K+ på kapillær endene og målte en oppstrøms arterioler utvidelse (figur 2A, C) som vi tidligere gjorde i CaPA preparater fra kortikale blodkar20. Vi undersøkte deretter, for første gang til vår kunnskap, kapillær-til-arteriole elektriske signalering i kvinnelige mus ved hjelp av HiCaPA preparater. Arterioler utvidelse fremkalt av kapillær stimulering med 10 mM K+ var ikke forskjellig mellom preparater fra mannlige og kvinnelige mus (figur 2A, C).
Til slutt, en annen fundamental fordel med denne tilnærmingen er muligheten til å bruke farmakologiske verktøy i badekaret før kapillær stimulering. Her har vi testet effekten av ML133, en nylig utviklet Kir2 inhibitor28. Tillegg av 10 μM ML133 til badet, nesten avskaffet kapillær-indusert arterioler utvidelse som svar på 10 mM K+ i HiCaPA preparater fra både mannlige og kvinnelige mus (figur 2A, C). Dette siste resultatet antyder at KIR 2.1 kanalen formidler elektrisk signalering i kvinnelige cerebral blodkar som vi tidligere beskrevet i kortikale mikrosirkulasjonen av den mannlige hjernen.
Figur 1: metodikk for isolering og trykksetting av hippocampus kapillær-parenkymatøs arterioler (HiCaPA) forberedelse fra musen. (A) fersk isolert hjernen er halvert i sagittal flyet etter interhemispheric sprekken og plassert med midtre side vendt opp. (B) thalamus, septum, og hypothalamus er forsiktig fjernet for å avdekke hippocampus. (C) hippocampus er forsiktig fjernet. (D) arterioler med kapillær trær er isolert fra hippocampus og den ene enden av arterioler segmentet er kanylert med en micropipette koblet til et pressurizing system, og den andre enden er okkludert. Kapillær endene er forseglet og opprettholdt mot dekkglass med spissen av en glass pipette. Innvendig diameter overvåkes med et kant deteksjons system i én eller flere regioner av arteriole. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fokus stimulering av blodkar med 1 μM NS309 har ingen effekt på oppstrøms arterioler diameter, i motsetning til stimulering med aCSF som inneholder 10 mM K+. (A) representativ innspilling av oppstrøms arterioler diameter som viser effekten av bad anvendelse av 1 μM NS309 etterfulgt av påfølgende kapillær ender stimulering (20 s, 5 PSI) med 1 μM NS309 og med aCSF som inneholder 10 mm K+ i fravær eller nærvær av Kir2 kanal inhibitor ML133. Anvendelse av 10 mM K+ på blodkar produserte en rask oppstrøms arterioler utvidelse som ble blokkert av 10 μM ML133. NS309 forårsaket ikke utvidelse. Fraværet av oppstrøms arterioler utvidelse som svar på kapillær stimulering med NS309 illustrerer at trykk-utløst forbindelser ikke når arteriole. (B) sammendragsdata som viser diameter endringer indusert av 1 μM NS309 anvendt i badekaret eller på kapillær endene (n = 14; * * * *p < 0,0001, sammenkoblet t-test). (C) sammendragsdata som viser arterioler diameter endringer indusert med 10 mm K+ påføres direkte på blodkar i HiCaPA preparater fra hann (n = 6) eller hunn (n = 8) mus før og etter 10 μM ML133 ble påført i badekaret (* * *p < 0,0005, n.s. = nonsignificant, ikke sammenkoblet t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HiCaPA (hippocampus kapillær-parenkymatøs arteriole) som er beskrevet i dagens manuskript, er en forlengelse av vår veletablerte prosedyre for å isolere, pressurize og studere parenkymatøs arterioler29. Vi har nylig rapportert at KIR 2.1 kanaler i hjernen kapillær endothelial celler forstand øker i [K+]o assosiert med nevrale aktivisering, og generere en stigende hyperpolarizing signal som utvider oppstrøms arterioler20. Å avsløre denne tidligere uventede rollen for blodkar har vært mulig delvis ved å utvikle den CaPA forberedelsen fra kortikale mikrosirkulasjonen20,21. Dette manuskriptet presenterer en lignende eksperimentell tilnærming, men fra en dypere og mer begrenset struktur av musen hjernen for å beskrive en enkel og reproduserbar tilnærming for å undersøke kapillær-til-arteriole signalering under nevrovaskulære kopling.
Hjernen mikrosirkulasjonen er utsøkt skjør og visse praksiser, spesielt minimere strekking og håndtering av fartøyene, må brukes for å sikre overlevelse av arterioler og blodkar. Den spontane utviklingen av myogenic tone er den første indikatoren på en forberedelse levedyktighet30. Den endothelial funksjonen kan deretter vurderes ved å legge til SK og IK kanaler ' Agonistiske NS309 til bad løsning, som bør føre til nær maksimal utvidelse. I tilfelle av en unnlatelse av å utvikle tone eller respons på badet anvendelse av NS309, bør preparatet erstattes med en annen. NS309 er også brukt til å teste spredningen av fokal kapillær stimulering. Fordi kapillær endothelial celler mangler SK og IK kanaler20, lokale levering av NS309 på blodkar med trykk utstøting bør ikke ha noen effekt på oppstrøms arterioler diameter som vist i figur 2, illustrerer at forbindelsene ikke tilfeldigvis stimulere arteriole. Når disse trinnene er validert, kan kapillær-til-arteriole signalering testes.
Her har vi undersøkt elektriske signalering ved å stimulere blodkar med aCSF som inneholder 10 mM K+. Men ulike signalering modaliteter kan utforskes ved hjelp av dagens tilnærming ved å stimulere blodkar med ulike kjente vasoactive agenter eller nevrotransmittere. En annen fordel med dette preparatet er muligheten til å undersøke og til slutt sammenligne NVC mellom forskjellige dyr og mellom ulike hjerneregioner. Dette er spesielt interessant fordi hjernen ikke er jevnt målrettet av cerebrovaskulær patologi31,32. En generell begrensning av tilnærmingen som presenteres her er at ved å isolere mikrosirkulasjonen, er viktige komponenter i nevrovaskulære enhet, som neurons og astrocytter, tapt. Andre forberedelser, slik som skallen vinduet for in vivo CBF Imaging, opprettholde strukturen i intakt nevrovaskulære enhet og er mer hensiktsmessig å studere NVC i et intakt system. Men i skallen vinduet forberedelse, parenkymatøs arterioler er vanskelig å image uten spesifikt utstyr, som en multiphoton mikroskop, og dypere regioner, slik som hippocampus, forblir vanskelig å image. I denne forbindelse, tilnærmingen utviklet i Filosa laboratoriet med luminal flyt for å indusere myogenic tone i hjerne skiver representerer en elegant sammenheng mellom hjerne skive og in vivo tilnærminger33. Imidlertid kan de omkringliggende nervøse vevet begrense inntrengning av et medikament påføres lokalt, øke sin off-Target potensial og gjøre tolkninger vanskelig, fordi flere celletyper er eksponert for narkotika. Vi utviklet først og fremst vår ex vivo -tilnærming for å løse disse potensielle problemene. I konklusjonen, bør flere tilnærminger brukes sammen for å fullt ut studere NVC.
Oppsummert beskriver denne rapporten en ex vivo intakt utarbeidelse av trykksatt hippocampus arterioler og blodkar som gjør at virkningene av farmakologiske og biologiske stoffer som skal testes på funksjonelle parametre på diskrete posisjoner langs kapillær-arteriole kontinuum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Jules Morin for innsiktsfulle kommentarer til manuskriptet. Denne forskningen ble finansiert av utmerkelser fra CADASIL sammen vi har Hope non-profit organisasjon, Center for Women ' s Health and Research, og NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
