Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60676
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Anesthesiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Neurological Sciences, University of Vermont Larner College of Medicine, 3Department of Pharmacology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

כתב היד הנוכחי מפרט כיצד לבודד היפובין ונימים ממוח העכבר וכיצד ללחוץ אותם על מיגרפיה ללחץ, immunofluorescence ביוכימיה, מחקרים מולקולריים.

Abstract

מתוך שינויים התנהגותיים עדינים לדימנציה בשלב מאוחר, ליקוי קוגניטיבי כלי דם מתפתח בדרך כלל בעקבות איסכמיה מוחית. שבץ ודום לב הם מחלות מינית במידה ניכרת, ושניהם לגרום איסכמיה מוחית. עם זאת, ההתקדמות בהבנת ליקוי קוגניטיבי בכלי הדם, ולאחר מכן פיתוח טיפולים ספציפיים למין, כבר מוגבל בחלקו על ידי אתגרים בחקירת מיקרוסירקולציה המוח מדגמי העכבר במחקרים פונקציונליים. כאן, אנו מציגים גישה כדי לבחון את arteriole הקפילר בvivo לשעבר נימי-מarteriole (היקואפה) הכנה מהמוח של העכבר. אנו מתארים כיצד לבודד, צינורית, והלחץ על המיקרוסירקולציה כדי למדוד קוטר arteriolar בתגובה לגירוי נימי. אנו מראים אילו בקרות תפקודית מתאים ניתן להשתמש כדי לאמת את שלמות ההכנה של הסדר ולהציג תוצאות טיפוסיות, כולל בדיקת אשלגן כסוכן צימוד וסקולרית ואת ההשפעה של המעכב שאפיינו לאחרונה של Kir2 פנימה לתקן אשלגן משפחה הערוץ, ML133. יתרה מזאת, אנו נשווה את התגובות בהכנות שהתקבלו מעכברים זכרים ונקבות. בעוד שנתונים אלה משקפים חקירות פונקציונליות, ניתן להשתמש בגישה שלנו גם בביולוגיה מולקולרית, בכימיה חיסונית ובלימודי אלקטרופיזיולוגיה.

Introduction

המחזור הפיטו על פני המוח היה מושא למידה רבה, בחלקו בשל הנגישות הניסיונית שלה. עם זאת, הטופולוגיה של ואצלב המוח יוצרת אזורים נפרדים. בניגוד לרשת הפיטו האיתנה העשירה באנסטוסים עם יכולת משמעותית לניתוב מראש של זרימת הדם, הגרם מהקיצילות (PAs) מהווה אספקה מוגבלת, כל אחד מהם מקיים נפח בדיד של רקמת העצבים1,2. זה יוצר אפקט צוואר בקבוק על זרימת הדם אשר, בשילוב עם תכונות פיזיולוגיות ייחודיות3,4,5,6,7,8, עושה גרם העורקי אתר חיוני עבור זרימת דם מוחין (cbf) תקנה9,10. למרות האתגרים הטכניים הכרוכים בבידוד ובצינורית של PAs, העשור האחרון ראה עניין מוגבר במחקרים לשעבר vivo תפקודית באמצעות כלי הלחץ11,12,13,14,15,16,17. אחת הסיבות לעניין מוגבר זה הוא מאמץ מחקרי ניכר שנערך על הזיווגים נוירוכלי (NVC), המנגנון העומד בראש תפקודי המוח היפראתרמיה18.

מאכלים, CBF יכול להגדיל במהירות בעקבות ההפעלה העצבית המקומית19. המנגנונים הסלולריים ומאפייני האיתות השולטים ב-NVC מובנים לחלוטין. עם זאת, זיהינו תפקיד בלתי צפוי בעבר עבור נימי המוח במהלך nvc בפעילות העצבית הרגישה ומתרגמת אותו לאות חשמלי מהקיטוב כדי להתרחב במעלה עורקי הראש20,21,22. פוטנציאל פעולה23,24 ופתיחה של מוליכות גדולה Ca2 +-מופעל K+ (BK) ערוצים על endcytic לאורך25,26 להגדיל את הריכוז יון האשלגן ביניים [K+]o, אשר תוצאות ההפעלה של חזקה מיישר פנימה מיישרים K+ (קיר) ערוצים של כלי הדם של נימים. ערוץ זה מופעל על-ידי החיצוני K+ אבל גם על ידי hyperpolarization עצמו. מתפשטת באמצעות צמתים הפער, הזרם המיקטריזציה ואז מחדש את התאים הסמוכים של נימי-הדם לarteriole, שם הוא גורם להרפיה מיציט ו-cbf להגדיל20,21. המחקר של מנגנון זה הוביל אותנו לפתח בלחץ קפיצ-מarteriole (קאפה) הכנה למדוד את קוטר arteriolar במהלך גירוי נימי עם סוכני vasoactive. ההכנה של קאפה מורכבת מפלח גרם arteriole קאננולה עם שלמות, מרמידות נימי במורד הזרם. קצות נימי הם דחוסים על קרקעית הזכוכית הקאמרית על ידי מיקרופיפטה, הסגר ומייצב את כל היווצרות כלי הדם20,21.

בעבר עשינו חידושים אינסטרומנטליים על ידי הדמיה של קאפה ההכנות מקליפת העכבר20,21 והעורקי המוח מהאמיגדלה של החולדה13 והיפוקמפוס16,17. כמו ההיפוקמאז ואצלב מקבל יותר תשומת לב בשל הרגישות שלה לתנאים פתולוגיים, כאן אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד עבור הכנה קאפה מן ההיפוקמפוס העכבר (היקופה) כי לא ניתן להשתמש רק במחקרים NVC פונקציונלי אלא גם בביולוגיה מולקולרית, כימיה חיסונית, אלקטרופיזיולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת קולורדו, הקמפוס הרפואי אנוץ ובוצעו בהתאם להנחיות מטעם המכון הלאומי לבריאות.

1. פתרונות

  1. השתמש המלח מאגור באגירה לניתוח ולשמור דגימות ב 4 ° c לפני ניצול שלהם. . אל תדלק את הפתרון להכין מלוחים מאגור באגירה עם הרכב בעקבות: 135 מ"מ, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ KH2PO4, 1 מ"מ mgso4, 2.5 mM cacl2, 5 מ"מ גלוקוז, 3 מ"מ מגבים, 0.02 mm edta, 2 מ"מ פירובט, 10 מ"ג/mL סרום של הפרה, pH 7.3 ב 4 ° c.
  2. השתמש בנוזל שדרתי מלאכותי (aCSF) כפתרון אמבטיה ותמיסת פיפטה. גז הן aCSF ו-Ca2 +-חינם acsf עם 5% CO2, 20% O2, ו N2 איזון. להכין את הפתרון עם ההרכב הבא: 125 mM הנאקל, 3 מ"מ KCl, 26 mM נחקו3, 1.25 mm נה2PO4, 1 מ"מ mgcl2, 4 מ"מ גלוקוז, 2 מ"מ cacl2, pH 7.3 (עם האנטנה 5% CO2, 20% O2, ו N2 איזון).
  3. השג את התארכות המקסימלי ב-Ca בו2 +-חינם acsf (0 מ"מ [Ca2 +]o, 5 מ"מ egta).

2. הכנה לעוגב

  1. הוספת נימים זכוכית בורוסיליקט (בקוטר מחוץ = 1.2 מ"מ; בתוך קוטר = 0.69 מ"מ; אורך = 10 ס מ) לתוך פולר זכוכית. משוך את הנימים כדי לעשות טיפ ארוך, דק בקצה אחד.
  2. לצד אחד של החדר, הוסף צינורית שיכולה להתחבר למשאבת פריסטלטית מוקטנת כדי להזרים את הכלי ללחץ. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, שבור את קצה הצינורית כך שהוא קטן מספיק כדי להתאים את כלי העניין, אך גדול מספיק כדי לאפשר לפתרונות לזרום דרך הקצה. ודא שהקצה הוא בערך 10-15 יקרומטר בקוטר.
  3. ממלאים את הצינורית באמצעות מזרק עם מסנן 0.22 יקרומטר מוצמד עם acsf חמצן. ודא שאין בועות אוויר או פסולת בצינורית.
  4. הוסיפו עוד שתי צינורית לצדו הנגדי של החדר. . אל תשבור את הטיפים שלהם

3. ניתוח ההיפוקמפוס ובידוד

  1. . המתת חסד וערוף את ראשו של עכבר לניסוי זה, השתמש בעכבר C57BL6/J בן 8 שבועות כדי להשוות בין הבדלים בין זכרים לנקבות. הכנס את העכבר עם פנטוברביטל וערוף את ראשו עם מספריים כירורגיים.
  2. באמצעות מספריים לחיתוך קטן, חותכים את העור לאורך קו האמצע בראש הראש. . תזיז את העור לצדדים
  3. מתחיל בצידו השני של הגולגולת, חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע עד שהגיעו לנורות הריח. להסיר חלקים של הגולגולת עד המוח נחשף.
  4. מסירים לאט את המוח, מתחילים. ליד האף של העכבר להפריד את המוח מן הנורות ריח, עצבי הגולגולת, ואת חוט השדרה ידי חיתוך דרך המבנים עם מספריים לחיתוך קטן.
  5. מניחים את המוח בצלחת הניתוח עם מספיק הפתרון של מגבים כדי להטביע אותו לחלוטין. בעזרת מיקרוסקופ לנתיחה, הניחו את המוח במרכז לוחית החיתוך עם הצד הגחוני הפונה כלפי מטה.
  6. חותכים את המוח לשניים. לאורך הקרע האורכי החזק את הלהב כך שהקצה החד יהיה מקביל לתחתית לוחית החיתוך. לחץ על הלהב דרך המוח במכה אחת. תזיז חצי כיתה אחת. לצד הצלחת
  7. בצע את השלבים הבאים עבור כל חצי כיתה בנפרד או במקביל.
    1. הניחו את כדור המחצית במרכז הצלחת כך שהקו המרכזי פונה כלפי מטה. ואז להשתמש להב תער כדי לחתוך לאורך הקרע הרוחבי כדי להסיר את המוח החלק המוח ואת הגזע. . תדחוף את הלהב ישר דרך הרקמה
    2. סובב את חצי הכדור כדי שהצד האמצעי יהיה פונה כלפי מעלה (איור 1א). השתמש במרית אחת. כדי להחזיק את המוח במקומו באמצעות מרית השנייה, הכנס את העצה מתחת למכסה הקורפוס וסקופ מתחת כדי להסיר את התלמוס, המחיצה וההיפותלמוס, כיסוי ההיפוקמפוס (איור 1B).
    3. ודא כי ההיפוקמפוס הוא כעת גלוי כמבנה מעוקל ליד הצד האחורי של המוח. באמצעות מרית אחת להחזיק את המוח במקום, להשתמש במרית השנייה כדי לגרוף את ההיפוקמפוס מתוך המוח (איור 1ג).
  8. העבר את ההיפוקמאני לצלחת הניתוח החדש מלאה בחצי הדרך עם הפתרון של מגבים. . להשליך את שאר המוח

4. היפוקמאל arteriole בידוד

  1. השלם את השלבים הבאים עבור כל ההיפוקמפוס.
    1. הצמד את אחד ההיפוקמאני באמצעות פינים קטנים בכל קצה של המקטע. . עורק ההיפוקמאל פונה כלפי מעלה
    2. באמצעות מלקחיים חדים מאוד, למתוח בעדינות חלקים קטנים של ההיפוקמפוס. זה ישחרר את הרקמה שמסביב לעורקי העורקים ויקל עליהם לבתר אותם.
    3. חיפוש דרך רקמת ההיפוקמאל לזהות את העורק הרוחבי החיצוני (איור 1ג)16,27.
    4. בעדינות לתפוס את העורק הרוחבי החיצוני, לאט למשוך אותו הרחק הרקמה כדי לאסוף את הארטיצילות ונימים מבשם CA3 אזור של ההיפוקמפוס.
    5. ברגע שאין עוד כלי להסרה מן הרקמה, להשליך את ההיפוקמאני. השאר את כלי השיט על קרח בצלחות כאשר לא בשימוש.

5. נימי היפוקמאל-מarteriole

  1. מצא arteriole עם ענף שמסתיים בנימים. . תעביר את זה לתא האיברים ודא שarteriole הוא כ-15-30 יקרומטר כאשר מורחבים במלואו (איור 1D).
  2. לטעון בזהירות את כלי הדם על ידי דוחף את הצינורית הקצה דרך הקיר arteriole מתחת לאזור היעד. החליקו בזהירות את כלי הקיבול אל הצינורית עד שיש מספיק רקמות כדי לשים את העניבה.
  3. בצע קשר רופף עם 12-0 התפרים ניילון, כך שהוא מתאים את כלי הדם ואת צינורית. השתמש בקשר בחצי. התקלות כדי לאבטח קשרים ואז למשוך את הקצוות כדי להדק את הקשר ולאבטח את הarteriole לצינורית. הסר ענפים חיצוניים של כלי קיבול מתחת לעניבה על ידי משיכת אותם בעדינות עם מלקחיים.
  4. הפוך עוד עניבה ולאבטח אותו בקצה השני של arteriole לאטום אותו.
  5. הנמך את הצינורית עם הכלי המצורף עד שהוא שטוח כנגד הכיסויים בתחתית החדר. היזהרו לא להנמיך את הצינורית יותר מדי או שהוא יישבר.
  6. באמצעות צינורית אחת בצד השני של החדר, הורידו אותה כך שהנקודה בה היא מצמידה את העניבה לקצה הarteriole.
  7. השתמש בצינורית השלישית כדי להצמיד את ענף הנימים לכיסויים. מניחים את הקצה קרוב לסוף הסניף תוך כדי יציאה מקצות נימי הנימים החשופים (לא מתחת לצינורית).

6. מיגרפיה ללחץ

  1. הזיזו את החדר מטווח החיתוך למיקרוסקופ עם תוכנת ההקלטה.
  2. חבר את צינורות הזרימה הנכנס והזרימה היוצאת לחדר עבור הפרזיה. הפעל את הפרזיה עם aCSF מחומם (37 ° c) בקצב זרימה של 4 מ"ל/min.
  3. הצמד את צינורית הלחץ למשאבה פריסטטית עם מתמר לחץ והבא את הלחץ הפנימי ל -20 מ"מ כספית.
  4. הפעל את תוכנת ההקלטה. כוונן את המיקרוסקופ ואת הגדרות הדימות כדי להשיג את התמונה הברורה ביותר האפשרית. התחילו את ההקלטה לאחר שההגדרות ממוטבות לתוכנת האיתור.
  5. הגדילו את הלחץ של הכלי עד 40 מ"מ כספית בזמן הקלטת קוטר העורקים באמצעות תוכנת זיהוי קצוות.
  6. אפשר ~ 15-20 דקות כדי לשטוף את הפתרון של מנקה מתוך החדר עם aCSF, ולתת את ההכנה היקופה כדי ליצור ולפתח טון מיוגני.
  7. כדי לבדוק את הכדאיות של כלי קיבול, להחיל 1 μM NS309 פתרון לאמבט היתוך (ראה איור 2א, ב ובסעיף תוצאות הנציג). קטע arteriolar חייב להתרחב, הדגמת כ 30-40% טון מיוגני כפי שמתואר בעבר3,14,20.

7. גירוי ממוקד בקצוות נימי

  1. לאחר הטון הבסיסי של arteriole כבר הוקם הפונקציה אנדותל העריכו, לבדוק את התגובה של גירוי נימי.
  2. באמצעות פולר זכוכית, הפוך את הצינורית כך שתהיה נקודה טובה בקצה אחד. לשבור את הקצה של צינורית כך התרופה נבדק יכול לזרום דרך הקצה בצורה חלקה ב 5 psi.
  3. מלאו את הצינורית עם פתרון התרופות המעניין והוסיפו אותה למיקרומניפולציה של 3 צירים המצורפת למיקרוסקופ. לחבר את אבובים ממערכת הפליטה לחץ לצינורית.
  4. הנמך באיטיות את הצינורית לתוך האמבט שליד הנימים, והיזהר שלא לפגוע בשום חלק מכלי הקיבול או החומרה שבתא. התמרן את קצה הצינורית ליד קצות הנימים מבלי לגעת בהם. שמור את קצה הצינורית בדיוק ליד הכיסויים כדי למנוע גירוי של כלי הקיבול אם הצינורית דולפת.
  5. כאשר מוכנים לעורר את נימי הנימים, הורידו את הצינורית לכיסויים ובצמוד לנימים. הפעל את מערכת הפליטה לחץ עם זמן הפליטה הרצוי (כאן 20 s). לאחר סיום הגירוי, הרימו את הצינורית מעט כדי להימנע מגירוי נוסף.
  6. חזור על הגירוי בהתאם לצורך. שינוי צינורית הלחץ במערכת הפליטה כדי לבדוק תרכובות סמים שונות.
  7. כדי לוודא שרק הנימים ממריצים, ממלאים את הצינורית עם פתרון μM NS309 1 וחוזרים על הצעדים שלעיל.
    הערה: תאי האנדותל של נימי לא מבטאים את ערוצי K+ ערוצים שהופעלו על ידי NS309, כך שarteriole אסור להגיב לגירוי. אם arteriole dilates, הצינורית תצטרך להיות מיקומן או שקוטר החור יצטרך להיות קטן יותר (ראה איור 2א, ב ומקטע תוצאות הנציג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מוליכות אנתל קטנה (SK) ומוליכות ביניים (IK) Ca2 +-תלוי-K+ ערוצים להפעיל השפעה מאוד על הקוטר של PAs. היישום אמבטיה של 1 μM NS309, האגוניסט סינתטי וערוץ SK, שנגרמו ליד התרחבות מקסימלית (איור 2א, ב). עם זאת, תאים של נימי האנדותל חסרים בערוצי ה-IK ו-SK והיא לא היתה היפרקטזה בתגובה ל NS30920. כתוצאה מכך, מעורר מסתיים נימי עם 1 μM NS309 על ידי הוצאה ללחץ מוקד (20 s, 5 psi) לא לגרום התרחבות arteriolarבמעלה הזרם(איור 2a, B). תוצאה זו עולה כי NS309 לא הגיע לarteriole בהכנות היקופה ויכול לשמש כפקד כדי להעריך את ההגבלה המרחבית של התרכובת המוחלת על נימים על ידי הוצאה ללחץ.

הכנה זו תוכננה ביסודה עבור המדידה של איתות חשמלי מבפנים נימים כדי PAs. באמצעות הכנת היאפה, החלת aCSF המכיל 10 mM K+ על קצות נימי ונמדד התרחבות arteriolar המעלה (איור 2A, C) כפי שעשינו בעבר ההכנות קאפה מן הקליפת הקורקובורה20. לאחר מכן חקרנו, בפעם הראשונה לידיעתנו שלנו, איתות חשמלי נימי ל-arteriole בעכברים נקבה באמצעות ההכנות של היקואפה. התרחבות Arteriolar מעורר על ידי גירוי נימי עם 10 מ"מ K+ לא שונה בין ההכנות של עכברים זכר ונקבה (איור 2א, ג).

לבסוף, יתרון בסיסי נוסף של גישה זו הוא האפשרות ליישם כלים תרופתי באמבט לפני גירוי נימי. כאן בדקנו את ההשפעה של ML133, שפותחה לאחרונה Kir2 מעכבי28. תוספת של 10 μm ML133 לאמבט זלוף כמעט ביטלה נימי המושרה arteriolar התרחבות בתגובה 10 mM K+ ההכנות השאר מן עכברים זכר ונקבה (איור 2א, ג). התוצאה האחרונה עולה כי קיר 3.3 הערוץ מדיטים איתות חשמלי בתוך המוח הנשי המוח כפי שתיארנו בעבר את המחזור הקורטיקלית של השכל הגברי.

Figure 1
איור 1: מתודולוגיה לבידוד והלחץ של נימי ההיפוקמאל-הכנת העורקים (היקופה) הכנה מהעכבר. (א) המוח המבודד הטרי נחתך לחצי במישור המשונן בעקבות הקרע הפנימי והניח עם הצד האמצעי פונה כלפי מעלה. (ב) תלמוס, מחיצת, ו ההיפותלמוס מוסרים בעדינות כדי לחשוף את ההיפוקמפוס. (ג) ההיפוקמפוס הוסר בזהירות. (ד) מבודדים מההיפוקמפוס וקצה אחד של הקטע הarteriolar הוא קאננולה עם מיקרופיפטה המחובר למערכת לחץ, והקצה השני מופרד. קצוות נימי חתומים ומתוחזקים כנגד הכיסויים בקצה של פיפטה מזכוכית. קוטר פנימי מנוטר באמצעות מערכת זיהוי קצוות באזור אחד או כמה מarteriole. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: גירוי מוקד של נימים עם 1 μM NS309 אין השפעה על קוטר arteriolar במעלה, בניגוד גירוי עם aCSF המכיל 10 mM K+. (א) הקלטה ייצוגית של הקוטר arteriolar במעלה מראה את ההשפעה של היישום אמבטיה של 1 ΜM NS309 ואחריו גירוי מסתיים נימי (20 s, 5 psi) עם 1 ΜM NS309 עם acsf המכיל 10 mM K+ בהעדר או נוכחות של Kir2 המעכב של ערוץ ML133. יישום של 10 מ"מ K+ על נימים המיוצר התרחבות arteriolar מהירה במעלה כי נחסם על ידי 10 ΜM ML133. . NS309 לא גרם לתרחבות העדר התרחבות arteriolar במעלה הזרם בתגובה לגירוי קפילר עם NS309 ממחיש כי הלחץ נפלט תרכובות לא להגיע arteriole. (ב) נתוני סיכום המראים שינויים בקוטר המושרה על ידי 1 ΜM NS309 שהוחלו באמבט או בקצוות הקפילר (n = 14; * * * *p < 0.0001, לזווג t-test). (ג) נתוני סיכום המראים שינויים בקוטר arteriolar המושרה על ידי 10 mM K+ הוחל ישירות על נימים בהכנות היקופה מן הזכר (n = 6) או נקבה (n = 8) עכברים לפני ואחרי 10 μm ML133 הוחל באמבטיה (* * * * < 0.0005 , נ = לא משמעותי, t-בדיקה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנת הטאפה בלחץ (arteriole) הכנה המתואר בכתב היד הנוכחי היא הרחבה של ההליך הוקמה היטב שלנו כדי לבודד, לחצים, וללמוד העורקי העורקים29. אנו דיווחו לאחרונה כי קיר 2.1 ערוצי המוח בתאי נימי מוחי התחושה מגדילה ב [K+]o הקשורים הפעלה עצבית, וליצור אות היפרקטליזציה עולה כי מרחיב במעלה הצוק המעלה20. חשיפת תפקיד לא צפוי זה בעבר נימים היתה אפשרית בחלק על ידי פיתוח הכנת קאפה מיקרו מחזור הקורטיקלית20,21. כתב יד זה מציג גישה ניסיונית דומה, אבל מתוך מבנה עמוק יותר ומוגבל יותר של מוח העכבר כדי לתאר גישה פשוטה ומוגבלת לחקור הקפילר-to-arteriole איתות במהלך צימוד נוירוכלי.

מחזור המוח הוא שברירי להפליא ושיטות מסוימות, בעיקר מזעור מתיחה וטיפול של כלי הדם, יש להשתמש כדי להבטיח את ההישרדות של העורקים ונימים. ההתפתחות הספונטנית של הטון מיוגני הוא האינדיקטור הראשון לכדאיות של הכנה30. הפונקציה אנדותל ניתן להעריך לאחר מכן על ידי הוספת הערוצים SK ו IK ' אגוניסט NS309 לפתרון אמבטיה, אשר אמור לגרום ליד התרחבות מקסימלית. במקרה של כישלון לפתח טון או תגובה ליישום האמבטיה של NS309, יש להחליף את ההכנה עם אחד אחר. NS309 משמש גם כדי לבדוק את התפשטות של גירוי נימי מוקד. מכיוון תאי האנדותל של נימי מחסור בערוצי SK ו-IK20, משלוח מקומי של NS309 אל נימים על ידי הוצאה לחצים לא צריך להיות השפעה על המעלה arteriolar קוטר כפי שמוצג באיור 2, הממחישות כי תרכובות לא לעורר בטעות את הarteriole. לאחר שלבים אלה מאומתים, ניתן לבדוק arteriole איתות מפני נימי.

כאן בחנו איתות חשמלי על ידי גירוי נימים עם aCSF המכיל 10 מ"מ K+. עם זאת, שיטות איתות שונות ניתן לחקור באמצעות הגישה הנוכחית על ידי מגרה נימים עם סוכני vasoactive ידועים שונים או נוירוטרנסמיטורים. יתרון נוסף של הכנה זו הוא האפשרות לחקור ובסופו של דבר להשוות NVC בין בעלי חיים שונים בין אזורי מוח שונים. זה מעניין במיוחד משום שהמוח אינו ממוקד באופן אחיד על ידי הפתווגיות שדרתי31,32. מגבלה כללית של הגישה המוצגת כאן היא כי על ידי בידוד המיקרו מחזור, רכיבים קריטיים של יחידת נוירונימי, כגון נוירונים ו astrocytes, אבדו. הכנות אחרות, כגון חלון הגולגולת עבור vivo cbf הדמיה, לשמור על המבנה של יחידת נוירונימי שלמים ומתאימים יותר ללמוד nvc במערכת שלמה. עם זאת, בהכנה של חלון הגולגולת, העורקים העורכוניים קשים לתדמית ללא ציוד ספציפי, כמו מיקרוסקופ רב-פוטון, ואזורים עמוקים יותר, כגון ההיפוקמפוס, נשארים קשים לתדמית. בהקשר זה, הגישה שפותחה במעבדה Filosa באמצעות זרימת הלומיאל כדי לגרום לנימה מיוגנית בפרוסות המוח מייצגת קשר אלגנטי בין המוח לבין vivo גישות33. עם זאת, רקמת העצבים שמסביב יכול להגביל את החדירה של תרופה למריחה על העור, הגדלת הפוטנציאל שלה מחוץ ליעד והכנת פרשנויות קשה, כי כמה סוגי תאים חשופים לסמים. בעיקר פיתחנו את הגישה שלנו לשעבר vivo לטפל בנושאים פוטנציאליים אלה. לסיכום, יש להשתמש בגישות מרובות בשילוב עם המחקר המלא של NVC.

לסיכום, הדו ח הנוכחי מתאר הכנה ex vivo לשעבר של היפולויולים ונימים מבוססי ההיפוקמפוס המאפשר את ההשפעות של סוכנים תרופתי וביולוגיים להיבדק על פרמטרים פונקציונליים במיקומים דיסקרטית לאורך הרצף נימי-arteriole.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לז מורין על הערות תובנה על כתב היד. מחקר זה מומן על ידי פרסים מ CADASIL יחד יש לנו תקווה ללא מטרות רווח, המרכז לבריאות נשים ומחקר, ו NHLBI R01HL136636 (FD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22µm Syringe Filters CELLTREAT Scientific Products 229751
12-0 Nylon (12cm) Black Microsurgery Instruments, Inc S12-0 NYLON
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C3881
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Dissection Scope Olympus SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head Ismatec ISM 1090
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14063-09
Inline Water Heater Warner Instruments SH-27B
Integra™ Miltex™Tissue Forceps Fisher Scientific 12-460-117
KCl Sigma-Aldrich P9333
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M8266
Micromanipulator Narishige MN-153
ML 133 hydrochloride Tocris 4549
MOPS Sigma-Aldrich M1254
NaCl Sigma-Aldrich S9625
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S8875
NS309 Tocris 3895
Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel Parker Hannifin 052-0500-900
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P3662
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-20
Surgical Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools 14001-13
Vertical Micropipette Puller Narishige PP-83

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
  2. Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
  3. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  4. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
  5. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
  6. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
  7. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  8. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  9. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
  10. Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
  11. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  12. Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
  13. Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
  14. Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
  15. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
  16. Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
  17. Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
  18. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  19. Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
  20. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  21. Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
  22. Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
  23. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  24. Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
  25. Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
  26. Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  27. Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
  28. Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
  29. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
  30. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
  31. Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
  32. Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
  33. Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).

Tags

מדעי המוח סוגיה 154 ערוץ יונים נימי מוח מוחין העורק העורקי הלחץ myography מיוגניים תגובתיות נימי arteriole חשמל איתות צימוד וסקולרית ההיפוקמפוס הצינורית כלי מיקרו מחזור
Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosehart, A. C., Johnson, A. C.,… More

Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study. J. Vis. Exp. (154), e60676, doi:10.3791/60676 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter