Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Een nieuwe toolkit voor het evalueren van genfuncties met behulp van voorwaardelijke Cas9-stabilisatie

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Hier beschrijven we een genoombewerkingstool op basis van de temporele en voorwaardelijke stabilisatie van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeat- (CRISPR-) geassocieerd eiwit 9 (Cas9) onder het kleine molecuul, Shield-1. De methode kan worden gebruikt voor gekweekte cellen en diermodellen.

Abstract

De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeat- (CRISPR-) geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) technologie is uitgegroeid tot een veel voorkomend laboratoriuminstrument om nauwkeurige en gerichte modificaties in het genoom te introduceren. De enorme populariteit en snelle verspreiding worden toegeschreven aan het eenvoudige gebruik en de nauwkeurigheid in vergelijking met zijn voorgangers. Toch heeft de constitutieve activering van het systeem beperkte toepassingen. In dit artikel beschrijven we een nieuwe methode die temporele controle van CRISPR/Cas9-activiteit mogelijk maakt op basis van voorwaardelijke stabilisatie van het Cas9-eiwit. Het samensmelten van een gemanipuleerde mutant van het rapamycinebindende eiwit FKBP12 tot Cas9 (DD-Cas9) maakt de snelle afbraak van Cas9 mogelijk die op zijn beurt kan worden gestabiliseerd door de aanwezigheid van een FKBP12 synthetische ligand (Shield-1). In tegenstelling tot andere induceerbare methoden kan dit systeem eenvoudig worden aangepast om bi-cistronic-systemen te genereren om DD-Cas9 samen met een ander interessant gen uit te drukken, zonder voorwaardelijke regulering van het tweede gen. Deze methode maakt het genereren van traceerbare systemen mogelijk, evenals de parallelle, onafhankelijke manipulatie van allelen waarop Cas9 nuclease is gericht. Het platform van deze methode kan worden gebruikt voor de systematische identificatie en karakterisering van essentiële genen en de ondervraging van de functionele interacties van genen in in vitro en in vivo omgevingen.

Introduction

CRISPR-Cas9 , wat staat voor "geclusterd regelmatig interspaced kort palindromisch repeats-geassocieerd eiwit 9" werd voor het eerst ontdekt als onderdeel van studies naar bacteriële adaptieve immuniteit1,2. Tegenwoordig is CRISPR/Cas9 het meest erkende hulpmiddel geworden voor programmeerbare genbewerking en zijn verschillende iteraties van het systeem ontwikkeld om transcriptie- en epigenetische modulaties mogelijk te maken3. Deze technologie maakt de zeer nauwkeurige genetische manipulatie van bijna elke opeenvolging van DNA4 mogelijk.

De essentiële componenten van elke CRISPR-genbewerking zijn een aanpasbare guide RNA-sequentie en de Cas9 nuclease5. De RNA-gids bindt zich aan de doel-complementaire sequentie in het DNA, waardoor de Cas9-nuclease wordt aangedreven om een dubbelstrengsbreuk uit te voeren op een specifiek punt in het genoom3,4. De resulterende decolletésite wordt vervolgens gerepareerd door niet-homologe end-joining (NHEJ) of homologie-gerichte reparatie (HDR), met de daaruit voortvloeiende introductie van veranderingen in de beoogde DNA-sequentie5.

Crispr/Cas9 gebaseerde genbewerking is eenvoudig te gebruiken, en relatief goedkoop in vergelijking met eerdere genbewerkingstechnieken en het is bewezen zowel efficiënt als robuust te zijn in een veelheid van systemen2,4,5. Toch vertoont het systeem enkele beperkingen. Het is vaak aangetoond dat de constitutieve expressie van Cas9 leidt tot een verhoogd aantal off-targets en hoge celtoxiciteit4,6,7,8. Bovendien neemt de constitutieve targeting van essentiële en celoverlevingsgenen door Cas9 afstand van zijn vermogen om bepaalde soorten functionele studies uit te voeren, zoals kinetische studies naar celdood7.

Er zijn verschillende onopleidbare of voorwaardelijk gecontroleerde CRISPR-Cas9-instrumenten ontwikkeld om deze problemen aan te pakken6, zoals Tet-ON en Tet-Off9; locatiespecifieke recombinatie10; chemisch geïnduceerde nabijheid11; inteïneafhankelijke splicing3; en 4-Hydroxytamoxifen Oestrogeen Receptor (ER) gebaseerde nucleaire lokalisatie systemen12. Over het algemeen bieden de meeste van deze procedures (inteine splicing en chemisch geïnduceerde proximity split-systemen) geen omkeerbare controle, vertonen ze een zeer trage kinetische respons op medicamenteuze behandeling (Tet-On/Off-systeem) of zijn ze niet vatbaar voor manipulatie met hoge doorvoer6.

Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een nieuwe toolkit ontwikkeld die niet alleen snelle en robuuste temporele-gecontroleerde genbewerking biedt, maar ook zorgt voor traceerbaarheid, afstemming en ontvankelijkheid voor genmanipulatie met hoge doorvoer. Deze nieuwe technologie kan worden gebruikt in cellijnen, organoïden en diermodellen. Ons systeem is gebaseerd op een ontworpen domein, wanneer het is gesmolten met Cas9, veroorzaakt het zijn snelle afbraak. Het kan echter snel worden gestabiliseerd met een zeer selectief, niet-toxisch, celdoorlatend klein molecuul. Meer specifiek hebben we de menselijke FKBP12 mutant "destabiliserend domein" (DD) naar Cas9 ontworpen, waarbij Cas9 werd gemarkeerd voor snelle en constitutieve afbraak via het ubiquitin-proteasoomsysteem wanneer uitgedrukt in zoogdiercellen13. De DD synthetische ligand, Shield-1 kan DD-conformatie stabiliseren, waardoor de afbraak van eiwitten die zijn gesmolten tot DD (zoals Cas9) op een zeer efficiënte manier wordt voorkomen, en met een snelle kinetische respons14,15. Van belang, Shield-1 bindt met drie ordes van grootte strakker aan de mutant FKBP12 dan aan zijn wild-type tegenhanger14.

Het DD-Cas9/Shield-1-paar kan worden gebruikt om de systematische identificatie en karakterisering van essentiële genen in gekweekte cellen en diermodellen te bestuderen, zoals we eerder hebben laten zien door ons voorwaardelijk te richten op het CypD-gen, dat een belangrijke rol speelt in het metabolisme van mitochondriën; EGFR, een belangrijke speler in oncogene transformatie; en Tp53, een centraal gen in dna-schaderespons. Naast tijdelijk en voorwaardelijk gecontroleerde genbewerking is een ander voordeel van de methode dat de stabilisatie van DD-Cas9 onafhankelijk is van de transcriptie ervan. Deze functie maakt co-expressie, onder dezelfde promotor, van traceerbare markers en recombinases mogelijk, zoals de oestrogeenreceptorafhankelijke recombinase, CREER. In dit werk laten we zien hoe onze methode succesvol in vitro kan worden gebruikt, om bijvoorbeeld dna-replicatiegen RPA3 voorwaardelijk te targeten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.The DD-Cas9 vector

  1. Verkrijg DD-Cas9 vector van Addgene (DD-Cas9 met vulvolgorde en Venus (EDCPV), Plasmid 90085).
    OPMERKING: Dit is een lentivirale DD-Cas9 plasmide met een U6 promotor die de single guide RNA (sgRNA) transcriptie aanstuurt terwijl de EFS promotor de DD-Cas9 transcriptie aanstuurt. De DYKDDDDK-sequentie (vlag-tag) is aanwezig op de C-terminal van Cas9, gevolgd door 2A zelf-splijtend peptide (P2A) dat DD-Cas9 en gemodificeerd fluorescerend eiwit Venus (mVenus) scheidt.

2. Kleine gids RNA (sgRNA) ontwerp

  1. Ontwerp kleine guide RNA (sgRNA) die wordt gekloond in de DD-Cas9-vector met behulp van een van de verschillende algoritmen, gericht op een specifiek genomisch gebied.
    OPMERKING: Om de off-target effecten te verminderen, selecteert u sgRNA-sequenties met de hoogste score met behulp van de website: http://crispr.mit.edu.
  2. Ontwerp en bestel twee oligonucleotiden per sgRNA-sequentie om een complete sgRNA te maken.
    OPMERKING: Aangezien de plasmide wordt verteerd door het BsmBI-enzym, ontwerpt u het voorwaartse en het omgekeerde oligonucleotide door BsmBI-spijsverteringsoverhangen toe te voegen aan de sgRNA-sequentie. Gebruik de sjabloon uit tabel 1.

3. Klonen van sgRNA in de lentivirale DD-Cas9 vector

  1. Defosforylaat de 5′-uiteinden van DD-Cas9 plasmide met behulp van alkalische fosfatase (FastAP) in een beperking enzym spijsverteringsreactie.
    OPMERKING: Vectoren kunnen opnieuw circuleren tijdens de ligatie, vooral wanneer ze worden ge lineariseerd door een enkel restrictie-enzym. Om ervoor te zorgen dat de vector niet opnieuw circuleert, de-fosforylaat de plasmide door fosfatase direct toe te voegen aan de spijsverteringsreactie.
    1. Defosforylaat en verteer de plasmide met BsmBI-enzym door een mix van 5 μg DD-Cas9 plasmide, 6 μL digestbuffer (10x), 0,6 μL DTT (100 mM), 3 μL BsmBI, 3 μL FastAP, voeg tot 60 μL nucleasevrij water toe om 60 μL te maken.
      OPMERKING: Voeg uiteindelijk het BsmBI-enzym en FastAP toe aan het mengsel.
    2. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij een hitteblok of thermocycler van 37 °C.
  2. Zuiver de verteerde DD-Cas9 plasmide.
    1. Bereid een 0,8% DNA-agarosegel voor om onvolledig verteerde plasmide en sporen van enzymen te verwijderen. Gebruik een bredere gelkam voor een betere scheiding en laat de gel op 90 V lopen.
    2. Visualiseer banden onder 360-365 nm UV-licht en snijd de grotere plasmideband uit de gel. Gooi het fragment van 2 kb weg dat overeenkomt met de vulstof.
    3. Zuiver de grote gesneden gelband met behulp van een commerciële gelzuiveringskit en volg de instructies van de fabrikant.
  3. Ligate gegloeide oligo's met verteerde DD-Cas9 plasmide.
    1. Fosforylaat en gloeien de sgRNA oligo's.
      1. Bereid het mengsel van 1 μL T4 Ligatiebuffer (10x), 1 μL Oligo 1 (100 μM), 1 μL Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL nucleasevrij water. Voeg ten slotte 0,5 μL T4 PNK toe. Het totale volume van deze reactie is 10 μL.
      2. Voeg de reactiemix toe aan de thermocycler met de volgende omstandigheden: 37 °C gedurende 30 min, 95 °C gedurende 5 min, en vervolgens afhelling naar 25 °C met een snelheid van 5 °C/min.
        OPMERKING: De PNK moet worden geactiveerd voordat de oligonucleotiden in de ligatie worden gebracht, anders zal de PNK de vector fosforyleren. De fosforyleringsstap en de gloeistap worden samen uitgevoerd in een thermocycler. De fosforyleringsstap waarbij 5'-fosfaat aan het sgRNA-oligonucleotiden wordt toegevoegd, is nodig om de ligatie te laten plaatsvinden.
    2. Ligate DD-Cas9 verteerde plasmide en sgRNA oligo's.
      1. Verdun de gegloeide oligo's tot 1:200 in nucleasevrij water en gebruik 50 ng plasmide-DNA in de ligatiereactie.
        OPMERKING: Gebruik de molaire verhouding van de 6 insert : 1 vector, om de integratie van de insert te bevorderen of gebruik een ligatiecalculator om de molaire verhouding te berekenen: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Bereid de ligatiereactiemix voor: 50 ng verteerde en gezuiverde DD-Cas9 vector, geschikt volume verdunde gegloeide oligo's, 1 μL T4 Ligatiebuffer (10x), 1 μL T4 DNA Ligase, tot 10 μL nucleasevrij water om het totale volume van de reactie 10 μL te verkrijgen.
      3. Als u ligase met een "hoge concentratie" gebruikt, incubeer de reactie dan gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Anders, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, of om een hogere opbrengst van ligatie te bereiken, incubeer 's nachts bij 16 °C.
        OPMERKING: Verwarm inactiveren bij gebruik van de standaard T4 DNA Ligase bij 65 °C gedurende 20 minuten. Niet verwarmen-inactiveren als u ligase master mixen gebruikt.

4. Bacteriële transformatie

  1. Verwarm 10 cm LB-ampicilline agarplaten voor op kamertemperatuur.
  2. Ontdooi 50 μL "One shot Stbl3" competente bacteriële cellen op ijs.
  3. Voeg 2-3 μL ligatiemengsel toe aan 50 μL competente bacteriële cellen en meng voorzichtig door de onderkant van de buis 4 keer met een vinger te laten flikkeren. Incubeer 30 minuten op ijs.
  4. Schok de cellen gedurende 40 seconden bij precies 42 °C met behulp van een timer. Koel de bacteriële cellen gedurende 5 minuten af op ijs.
  5. Voeg 500 μL SOC-media zonder antibioticum toe aan de bacteriële cellen en kweek ze in de schudincubator bij 250 tpm gedurende 45 minuten, bij 37 °C.
  6. Verspreid 100 μL getransformeerde bacteriën op voorverwarmde LB-ampicillineplaten en incubeer 's nachts bij 37 °C.

5. Mini/maxi-prep van ligated plasmide

  1. Bereid een maxi/mini-prep startcultuur voor.
    1. Kies de volgende dag een enkele bacteriële kloon en entel een startcultuur met 8 ml LB-media die ampicilline bevatten.
    2. Kweek de bacteriën in de schudincubator bij 250 tpm, 37 °C gedurende 10-12 uur.
    3. Gebruik 3-5 ml bacteriën voor mini-prep of gebruik het als een starter cultuur voor maxi-prep. Gebruik de rest van de bacteriën als een bacteriële glycerol-voorraad door 100% glycerol toe te voegen in de verhouding van bacteriële cultuur: glycerol is 1:1.
      OPMERKING: Hier beschrijven we de mini-prep procedure.
  2. Mini-prep procedure
    1. Oogst 3-5 ml bacteriële cellen en centrifugeer gedurende 1 minuut op 12.000 x g.
    2. Resuspend de pellet van bacteriële cellen met 200 μL P1-buffer, die RNase A bevat en bij 4 °C wordt opgeslagen.
    3. Voeg 200 μL buffer P2 toe en meng voorzichtig door de buis 10 keer om te keren totdat de vloeistof opheldering geeft.
    4. Voeg 300 μL buffer P3 toe en meng door de buis 10 keer om te keren. De vloeistof wordt troebel. Ga onmiddellijk te werk met het centrifugeren van de monsters op 12.000 x g gedurende 10 minuten.
    5. Breng het heldere supernatant over in de draaikolom en centrifugeer gedurende 1 minuut op 12.000 x g.
      Gooi de doorstroming weg.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het supernatant is opgehelderd. Deeltjes kunnen de spinkolom verstoppen en de kolomeffectiviteit verminderen.
    6. Voeg 400 μL PD-buffer toe en centrifugeer gedurende 1 min. bij 12.000 x g. Gooi de doorstroming weg.
    7. Voeg 600 μL PW-buffer toe om de draaikolom te wassen en centrifugeer gedurende 1 min op 12.000 x g. Gooi de doorstroming weg.
    8. Centrifugeer de draaikolom nogmaals op topsnelheid gedurende 3 minuten om de bufferresten te verwijderen. Gooi de doorstroming weg en laat deze 2 minuten zitten.
    9. Plaats de centrifugekolom op een verse buis en voeg 50 μL elutiebuffer toe. Incubeer gedurende 5 minuten en centrifugeer op topsnelheid gedurende 2 minuten.
    10. Gebruik het nanodruppelapparaat om de concentratie gezuiverde DD-Cas9 plasmide te meten met de sgRNA insert (ng/μL).
  3. Valideer het sgRNA klonen door DNA sequencing van de DD-Cas9 plasmide. Gebruik de U6 primersequentie in tabel 2.

6. Lentiviral voorbereiding

  1. Bereid HEK293T verpakkingscellen voor op transfectie.
    1. Gebruik gezonde HEK293T tot passage 10 en zaai ze gelijkmatig bij dichtheid 1-2 x 106 cellen per 10 cm weefselkweekplaat. Gebruik 10 ml Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% gefilterd Foetale Runderserum (FBS). Incubeer cellen in de weefselkweekincubator, bij 5% CO2 en 37 °C gedurende 20 uur.
    2. Bevestig de volgende dag dat cellen 70% samenvloeiing bereikten door brightfield microscopie en dat ze gelijkmatig over de plaat zijn verspreid. Verander media in cellen 1 uur voor de transfectie met het uiteindelijke volume van 10 ml.
      OPMERKING: De media mogen geen antibiotica en antimycotica gebruiken.
    3. Bereid het mengsel van 2 tubes met 500 μL warme media (bijv. OptiMEM).
      1. Voeg 25 μL transfectiereagens toe aan buis 1 met warme 500 μL media en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Bereid ondertussen een mix van plasmiden voor op buis 2 met 3,5 μg DD-Cas9 met gekloonde sgRNA, 6 μg van de verpakking plasmide (psPAX2) en 3 μg van de envelop plasmide (pMD2.G) in warme 500 μL media.
      3. Meng buis 1 met buis 2 om een transfectiemengsel te vormen en incubeer gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.
      4. Dropwise het transfectiemengsel naar HEK293T cellen en incubeer plaat in de weefselkweek incubator, bij 5% CO2 en 37 °C 's nachts.
      5. Verander na 18 uur de media voorzichtig in 10 ml verse DMEM met 10% FBS om het transfectiereagens te verwijderen. Incubeer voor de volgende 48 uur.
      6. Verzamel na 48 uur het supernatant met een spuit van 10 ml en passeer het door een filter van 0,45 μm.
      7. Aliquot en bewaar het virus supernatant bij -80 °C.

7. Bepalen van de werkzaamheid van virustiter en transductie met flowcytometrie

  1. Zaai de HEK293T cellen met 5 x 105 cellen/goed in een 6-put plaat. Zaadcellen in twee 6-well platen. Gebruik één bord om de volgende dag te tellen.
  2. Incubeer de platen in de incubator bij 37 °C, 95% vochtigheid, 5% CO2 's nachts om de volgende dag 50-60% samenvloeiing te bereiken.
  3. Gebruik de volgende dag een van de 6-putplaten om de cellen in 6 putten te tellen.
  4. Ontdooi het virus aliquot dat zal worden gebruikt om de seriële verdunning uit te voeren en voeg 8 μg/ml polybreenreagens toe.
  5. Bereid DMEM met 10% FBS voor seriële verdunning van het virus en voeg 8 μg/ml polybreenreagens toe.
  6. Bereid 2 ml tienvoudige seriële verdunningen van het lentivirus van 1 x 10-1 tot 1 x 10-4 in polybrene-bevattende media.
  7. Verwijder media van 6-well plaat en voeg 1 ml virale verdunningen toe aan putten. Laat een goed met media alleen als negatieve controle en een goed met 100% virus.
  8. Incubeer cellen met het virus in de incubator gedurende 24 uur.
  9. Verwijder de volgende dag de media met virus van 6-put platen en vervang het voor 2 ml verse DMEM met 10% FBS. Incubeer cellen gedurende 48-72 uur. Observeer GFP door elke dag een fluorescerende microscoop te gebruiken.
  10. Maak na 48-72 uur de cellen los en resuspend ze in macs buffer.
  11. Gebruik een flowcytometer om het percentage GFP-expressie te bepalen.
  12. Bereken virustiter met behulp van de volgende formule: TU/mL = (Aantal cellen getransduceerd x Percentage fluorescerende x Verdunningsfactor)/(Transductievolume in ml)

8. Lentivirale transductie van doelcellen

  1. Plaat de cellijn van belang op een plaat van 10 cm en incubeer 's nachts om de volgende dag samenvloeiing 50-60% te bereiken.
    OPMERKING: We gebruikten de A549-cellijn die DD-Cas9 en twee onafhankelijke RPA3-gen sgRNAs uitdrukt. We gebruikten ook de A549-cellijn die vector uitdrukt met Renilla-controle. We zaaiden die cellen met een dichtheid van 2 x 103cellen/cm2 en bebroedden ze bij 37 °C, 95% vochtigheid, 5% CO2 's nachts om de volgende dag 50-60% samenvloeiing te bereiken. We gebruikten RPMI-media met 10% gefilterde FBS. We gingen als volgt verder met de volgende stappen:
  2. Infecteer de volgende dag de cellen met 500-2000 μL virusdeeltjes in 10 ml totaal volume kweekmedium. Incubeer virale media gedurende 24 uur.
  3. Verander de volgende dag de virale media in kweekmedia en bepaal het percentage GFP-positieve cellen met behulp van flowcytometrie.
  4. Selecteer GFP-positieve cellen door FACS-celsortering of door bleomycineselectie te gebruiken.
  5. Positief geselecteerde cellen uitvouwen en een voorraad bevriezen.

9. Voorwaardelijke inductie van Cas9 gemedieerde genbewerking

  1. Plaat positief geselecteerde cellen 24 uur na infectie evenals niet-vertaalde cellen naar 12-well plaat afzonderlijk. Wacht tot de cellen zijn gekoppeld en wijzig de media in celkweekmedia met 200 nM Shield-1. Vervang de media in de platen door transduceerde en niet-vertaalde cellen, waardoor 2 putten per plaat met gewone media als negatieve controle achterblijven.
  2. Incubeer en haal eiwitten uit elke put op verschillende tijdstippen: tijd 0, 2 uur, 6 uur, 12 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur na het toevoegen van de Shield-1 aan de putten.
  3. Verwijder vervolgens de media met Shield-1 uit de rest van de putten en vervang deze voor gewone celmedia.
  4. Verzamel de eiwitten uit die putten 2 uur, 6 uur en 12 uur na het veranderen van de media.
  5. Visualiseer door westerse vlekanalyse de reversibiliteit en snelheid van gedestabiliseerde DD-Cas9 eiwitregulatie na de toevoeging en de terugtrekking van zijn ligand, Shield-1. Gebruik antilichamen gericht op DYKDDDDK Tag om eiwitten en een controleantilichaam gericht op bijvoorbeeld bèta-tubuline te visualiseren.
  6. Bepaal de optimale dosis Shield-1 door dosis-responscurve waargenomen door Western Blot analyse.

10. Validatie van genbewerking

OPMERKING: De GFP-expressietesten, zoals flowcytometrieanalyse en bleomycineselectiemarker, bevestigen alleen een succesvolle CRISPR-reagensafgifte, maar ze bepalen niet of de gewenste volgorde met succes is gericht. De meest voorkomende test om succesvolle gentargeting door het CRISPR-experiment te bevestigen, zijn Sanger DNA-sequencing, Next-generation sequencing, de Surveyor Nuclease Assay, the Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) Assay, of western blot analysis16,17,18.

  1. Plaat positief geselecteerde cellen en verander media in 200 nM Shield-1 bevattende media. Incubeer cellen gedurende 5 dagen en verander elke 3 dagen van medium met Shield-1.
  2. Gebruik de bovengenoemde validatietechnieken 5 dagen na DD-Cas9 inductie door Shield-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de voorwaardelijke expressie van Cas9 mogelijk te maken, ontwikkelden we een dubbele lentivirale vectorconstructie bestaande uit een U6-aangedreven promotor om sgRNA constitutief uit te drukken, en een EF-1α-kernpromotor om de expressie van het DD-Cas9-fusie-eiwit te stimuleren (Figuur 1A)19. Als een paradigma om de robuustheid en efficiëntie van het systeem te illustreren, transduceerde we de longcarcinomateuze A549-cellijn met de lentivirale constructie. De niveaus van Cas9 in de aan- of afwezigheid van het ligand Shield-1 werden gemeten door middel van reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) en Western blot analysis met behulp van een anti-Flag specifiek antilichaam. We gebruikten niet-geïnfecteerde cellen en nep-geïnfecteerde cellen (het voertuig) als controles. De cellen werden behandeld met een concentratie van Shield-1 variërend van 10 tot 1000 nM gedurende 7 d. Zoals aangetoond, was de behandeling met Shield-1 in staat om de expressie van DD-Cas9 op een sterke dosisafhankelijke manier te reguleren (figuur 1B en figuur 2A). RT-PCR-analyse met specifieke primers voor DD-Cas9 en controleprimers voor glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) bevestigde dat de niveaus van mRNA-expressie van DD-Cas9 vergelijkbaar waren tussen de transduceerde cellen en het voertuig, ondanks de aan- of afwezigheid van Shield-1 (Figuur 2B). Dit bevestigt dat de inductie van Cas9-eiwit een posttranscriptiegebeurtenis is.

Dit systeem maakt een snelle en omkeerbare stabilisatie van het DD-Cas9 eiwit mogelijk. Figuur 3 toont voldoende inductie van Cas9 expressie in de transduceerde A549 cellijn 2 uur na behandeling met 200 nM Shield-1 in vergelijking met de niet-geïnfecteerde A549 cellen. Het terugtrekken van Shield-1 resulteert echter in een snelle afname van het DD-Cas9-eiwit, dat binnen 6 tot 12 uur verwaarloosbaar wordt (figuur 3).

Het RPA3-eiwit is een onderdeel van het menselijke replicatie-eiwit A (RPA) heterotrimeer. Het is een enkelstrengs DNA-bindingscomplex dat een belangrijke rol speelt bij DNA-replicatie, recombinatie en reparatie. Om het gebruik van het systeem te valideren om essentiële genen te bestuderen, richtten we ons op het RPA3-gen. Hiervoor gebruikten we twee onafhankelijke locus-specifieke single guide RNAs (gidsen 25 en 44) en Renilla als controle (gids 208). De A549 cellen getransduceerd met de DD-Cas9 lentiviral construct werden behandeld met 200 nM Shield-1 voor 3 d. Na 48 uur behandeling was een afname van het celaantal in met Shield-1 behandelde getransduceerde A549-cellen met de RPA3-gids RNA zichtbaar en werd geen effect waargenomen op het celnummer in het Renilla-monster (figuur 4A). Om de uitputting van het RPA3-eiwit te valideren, voerden we een immunoblotting-analyse uit met behulp van een antilichaam tegen RPA3 3 d na Sheild-1 inductie (Figuur 4B). Verder bevestigden we genbewerkingsinversie- of indelmutaties met behulp van Surveyor nuclease-assays en DNA-sequencing (figuur 4C).

De door ons ontworpen lentivirale vectorconstructie heeft een uniek kenmerk: de regulatie van DD-Cas9 eiwitstabiliteit is onafhankelijk van de mRNA-expressie. Dit stelt de generatie van bicistronic systemen in staat om een ander gen van belang uit te drukken onder dezelfde EF-1a promotor zonder te worden gemoduleerd door de gedestabiliseerde DD-Cas9 (Figuur 5A, 5B). We hebben ook een 2A zelf-splijtend peptide (P2A) toegevoegd tussen DD-Cas9 en mVenus, een gemodificeerd fluorescerend eiwit dat kan worden gebruikt om geïnfecteerde cellen te traceren (Figuur 5A). Aangezien mVenus na P2A wordt geplaatst, zoals blijkt uit de resultaten van de Western Blot-analyse in figuur 5B, werd de expressie van het mVenus-eiwit waargenomen in het voertuig en A549-transduceerde cellen onafhankelijk van DD-Cas9-expressie en Shield-1-behandeling.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch van de lentivirale constructie en verschillende genbewerkingstools. A) De DD-Cas9 lentiviral backbone bevat een U6 promotor, sgRNA, EF-1a promotor, DD, spCas9, nucleoplasmin NLS en Flag-tag. B) Vergelijking tussen DD-Cas9-systeem (linkerpaneel) en verschillende Tet-On-systeem (rechterpaneel) gebruikt als genbewerkingstools. Lad-ladder, NI-niet-geïnfecteerde cellen, Veh-voertuig, -Sh cellen behandeld zonder Shield-1, + Sh cellen behandeld met 200 nM Shield, - Doxy cellen zonder doxycycline behandeling, + Doxy cellen behandeld met doxycycline. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Representatieve resultaten van dosisafhankelijke DD-Cas9 stabilisatie door Shield-1. A) Western Blot-analyse met behulp van een anti-Flag-tag antilichaam van gestabiliseerde DD-Cas9 expressie in cellen behandeld met toenemende concentraties van Shield-1. Als controle werden de niet-geïnfecteerde cellen (NI) en mock-treated cellen (Veh) gebruikt. Het fusie-eiwit DD-Cas9 was in beide controles niet detecteerbaar. B) De RT-PCR-resultaten van mRNA-expressieniveaus van DD-Cas9 in getransduceerde cellen bij afwezigheid of dosisafhankelijke behandelingen van Shield-1 waren vergelijkbaar tussen transduceerde cellen en voertuigen, met GAPDH-primers als interne controle. Dit cijfer is gewijzigd van Serif et al19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: De Western Blot-analyse illustreert de reversibiliteit en snelheid van gedestabiliseerde DD-Cas9 eiwitregulatie na het terugtrekken van zijn ligand Shield-1. Transduceerde A549 cellijn met DD-Cas9 en niet-geïnfecteerde A549 als controle werden 24 uur na infectie behandeld met 200 nM Shield-1 ligand voor de aangegeven tijdspunten. Het eiwitgehalte van DD-Cas9 in mock control cellen was niet detecteerbaar. Dit cijfer is gewijzigd van Serif et al19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Het DD-Cas9-systeem kan robuuste genbewerking induceren in "in-vitro" en "in-vivo" instellingen. A) De cellijn A549 wordt getransduceerd met een vector die sgRNA uitdrukt voor het RPA3-gen en DD-Cas9 (RPA3). Als controle A549 transduceerde met een vector die sgRNA voor Renilla (Ren) uitdrukt werd gebruikt. Cellen werden gedurende 3 dagen behandeld met Shield-1 (200 nM), wat resulteerde in een snelle afname van de levensvatbaarheid van cellen in cellen die RPA3 sgRNA uitdrukken, zonder effect op het celnummer in het Renilla-controlemonster. De efficiëntie van RPA3 genbewerking in de A549 cellijn werd gevalideerd door B) Western Blot analyse met behulp van het antilichaam tegen Flag-tag in RPA3 A549 en Renilla A549 in aanwezigheid en afwezigheid van 3 dagen Shield-1 (200 nM) behandeling en C) door SURVEYOR nuclease test. De pijlen in paneel C) tonen de fragmenten van de SURVEYOR nuclease assay. Dit cijfer is gewijzigd van Serif et al19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Schema van een bicistronic DD-Cas9 lentiviral construct om de expressie van mVenus onafhankelijk van DD-Cas9 aan te drijven. A) De constructie bestaat uit U6 promotor, sgRNA, EF-1a promotor, DD-Cas9, P2A en mVenus. B) Getransduceerde A549-cellen met een lentivirale plasmide met DD-Cas9, P2A en mVenus werden gedurende 3 dagen behandeld met 50 mM ligand Shield-1. Op de derde dag werd de westelijke vlekanalyse uitgevoerd met celllysaat, waarbij het antilichaam tegen GFP en Flag-tag afzonderlijk werd gebruikt. Figuur 5B is gewijzigd van Serif et al19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Voorwaarts (Oligo 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3
Achteruit (Oligo 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'

Tabel 1:Het ontwerp van het voorwaartse en omgekeerde sgRNA oligonucleotide. Het voorwaartse (Oligo 1) en het omgekeerde (Oligo 2) oligonucleotide is ontworpen door BsmBI enzymvertering toe te voegen overhangt de sgRNA-sequentie. "N" duidt de verschillende nucleotiden aan die aanwezig zijn in uw sgRNA-sequentie, de rest zijn uitsteeksels voor BsmBI-spijsvertering.

U6 primer sequentie 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'

Tabel 2: De U6 promotorsequentie voor sgRNA-kloonvalidatie. Om te valideren hoe succesvol het klonen van sgRNA is, gebruikt u de U6-promotorsequentie voor DNA-sequencing van de DD-Cas9 plasmide.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De CRISPR/Cas9-technologie heeft een revolutie teweeggebracht in het vermogen om genomen functioneel te ondervragen2. De inactivatie van genen resulteert echter vaak in celdoodheid, functionele tekorten en ontwikkelingsstoornissen, waardoor het nut van dergelijke benaderingen voor het bestuderen van genfuncties wordt beperkt7. Bovendien kan constitutieve expressie van Cas9 leiden tot toxiciteit en het genereren van off-target effecten6. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om crispr-cas9 gebaseerde genoombewerkingstechnologieën tijdelijk te controleren6. Deze systemen zijn gebaseerd op de transcriptiecontrole van Cas9 en/of sgRNA, of Cas9 post-transcriptionele en post-translationele activering21,22,23. Als alternatief voor deze systemen ontwikkelden we een nieuwe toolkit gebaseerd op de voorwaardelijke destabilisatie van Cas9.

De cruciale stap in dit protocol is het ontwerp van ten minste twee of drie sgRNA voor een specifiek gen om off-target effecten te voorkomen en efficiënte genbewerking te vergemakkelijken. Een snelheidsbeperkende stap is een efficiënte transformatie van de cellijn met de DD-Cas9-vector. De kwaliteit van lentivirusdeeltjes (hoge titers) is afhankelijk van de HEK-293T cellen. Het is cruciaal om een laag passagegetal (tot passage 10) te gebruiken van de HEK-293T-cellen die goed werden onderhouden (gesplitst wanneer ze 70% samenvloeiing bereikten, meestal twee keer per week in een verhouding van 1:6). Als alternatief kan de HEK-293 Lenti-X cellijn, die clonally werd geselecteerd om 30× hogere virale titers op te leveren dan reguliere HEK-293T cellen24worden gebruikt. Een andere cruciale stap is de optimalisatie van de verhouding van de DD-Cas9 plasmide, psPAX2 verpakking plasmide en pMD2.G envelop plasmide. Onze ervaring is dat zowel het volume waarin de transfectiemix met lipofectamine wordt bereid, als de plasmideverhouding een substantieel effect hebben op de transfectie-efficiëntie. We raden u aan de stappen in ons protocol te volgen voor de beste resultaten. De volgende cruciale stap voor efficiënte genbewerking is de optimalisatie van Shield-1 concentraties. We raden een eindconcentratie van 200 nM aan, maar om de beste resultaten te bereiken, moet de concentratie worden geoptimaliseerd tot een specifieke transduceerde cellijn. Het DD/Shield-1 systeem is met succes gebruikt in verschillende celculturen, kiemcellen, de protozoan Entamoeba histolytica, de platworm Caenorhabditis elegans, transgene xenografts, transgene muizen en medaka25. Een van de grootste beperkingen is de hoge kosten van het Shield-1 molecuul, vooral bij gebruik in in vivo instellingen. Bovendien is eerder aangetoond dat de eiwitten die zijn gericht op bepaalde celcompartimenten, zoals de mitochondriale matrix of lumen van het endoplasmatisch reticulum, kunnen worden gestabiliseerd of geaccumuleerd bij afwezigheid van Shield-1. Dit komt omdat verschillende eiwitten verschillende lokale eiwitkwaliteitscontrolemachines hebben26. Hoewel DD-fusies in het cytoplasma of de kern zeer efficiënt kunnen worden afgebroken in zoogdiercellen en gestabiliseerd door Shield-1, om de hierboven genoemde beperkingen te overwinnen, raden we aan een alternatief destabiliserend domein te gebruiken dat is afgeleid van de bacteriële dihydrofolaatreductase27. Dit systeem gebruikt trimethoprim als een bindend molecuul om het destabilisatiedomein te stabiliseren en is ook een goedkoper alternatief voor Shield-127.

Naast het bereiken van de transcriptie van DD-Cas9 als zijn onafhankelijke expressie, zijn de voordelen van deze methode, in vergelijking met andere induceerbare of voorwaardelijk gecontroleerde CRISPR-Cas9 genbewerkingstools, tijdelijk en voorwaardelijk gecontroleerde genbewerking, minder off-target effect en lagere celtoxiciteit4,6,7,8. De efficiëntie en eenvoud van de Shield-1/DD-Cas9-methode maken het mogelijk om een verscheidenheid aan tools te genereren die gemakkelijk kunnen worden aangepast en gebruikt in een veelheid aan toepassingen. Het systeem kan ook gemakkelijk worden gebruikt in in vivo instellingen, en het is aangetoond dat Shield-1 efficiënt kan doordringen door de bloed-hersenen barier19,25,28,29. Hoewel dit artikel het gebruik van CRISPR-Cas9-technologie beschreef voor de karakterisering van essentiële celgenen, zou dezelfde aanpak gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd voor de identificatie van genen die nodig zijn voor de overleving of progressie van tumoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.

Acknowledgments

We danken eerdere leden van ons laboratorium en wetenschapper Serif Senturk voor eerder werk. Wij danken Danilo Segovia voor het kritisch lezen van dit manuscript. Deze studie was mogelijk en werd ondersteund door Swim Across America en het National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-programma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, New York, N.Y. 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).

Tags

Genetica Genbewerking functionele genomische studies CRISPR Cas9 destabiliserend domein onopleidbaar
Een nieuwe toolkit voor het evalueren van genfuncties met behulp van voorwaardelijke Cas9-stabilisatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Šafarič Tepeš, P.,… More

Šafarič Tepeš, P., Sordella, R. A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization. J. Vis. Exp. (175), e60685, doi:10.3791/60685 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter