Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

כאן, אנו מתארים כלי לעריכת גנום המבוסס על ייצוב זמני ומותנה של מקובצים באופן קבוע בין-חללים קצרים פלינדרומיים חוזרים- (CRISPR-) חלבון הקשורים 9 (Cas9) תחת המולקולה הקטנה, Shield-1. השיטה יכולה לשמש לתאים בתרבית ומודלים של בעלי חיים.

Abstract

טכנולוגיית החלבון 9 (CRISPR/Cas9) המשויכת באופן קבוע לתחביבים קצרים הפכה לכלי מעבדה נפוץ כדי להציג שינויים מדויקים וממוקדים בגנום. הפופולריות העצומה שלה והתפשטות מהירה מיוחסים לשימושו הקל ודיוק בהשוואה לקודמיו. עם זאת, ההפעלה המכוננת של המערכת מוגבלת. במאמר זה, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת שליטה זמנית של פעילות CRISPR/Cas9 המבוססת על ייצוב מותנה של חלבון Cas9. היתוך מוטציה מהונדסת של חלבון מחייב rapamycin FKBP12 ל- Cas9 (DD-Cas9) מאפשר השפלה מהירה של Cas9 כי בתורו ניתן לייצב על ידי נוכחות של ליגנד סינתטי FKBP12 (מגן-1). שלא כמו שיטות לא מובלות אחרות, ניתן להתאים מערכת זו בקלות כדי ליצור מערכות דו-ציסטרוניות לבטא DD-Cas9 עם גן אחר של עניין, ללא ויסות מותנה של הגן השני. שיטה זו מאפשרת ייצור מערכות הניתנות למעקב, כמו גם מניפולציה מקבילה ועצמאית של אללים הממוקדים על ידי נוקלאז Cas9. הפלטפורמה של שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי ואפיון שיטתיים של גנים חיוניים וחקירת האינטראקציות התפקודיות של הגנים בהגדרות במבחנה וב- vivo.

Introduction

CRISPR-Cas9 אשר מייצג "מקובצים באופן קבוע interspaced קצר פלינדרומי חוזר חלבון הקשורים 9" התגלה לראשונה כחלק ממחקרים עלחסינותאדפטיבית חיידקית 1,2. כיום, CRISPR/ Cas9 הפך לכלי המוכר ביותר לעריכת גנים הניתנת לתכנות ואיטרציות שונות של המערכת פותחו כדי לאפשר אפנון תמלול ואפיגנטי3. טכנולוגיה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת ביותר של כמעט כל רצף של DNA4.

הרכיבים החיוניים של כל עריכת גנים CRISPR הם רצף RNA מדריך להתאמה אישית ואת נוקלאז Cas95. מדריך הרנ"א נקשר לרצף המשלים את המטרה בדנ"א, ומכוון את גרעין Cas9 לבצע שבירה כפולה בנקודה מסוימת בגנום3,4. אתר המחשוף המתקבל מתוקן לאחר מכן על ידי צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מונחה ההומולוגיה (HDR), עם כניסתם של שינויים ברצף ה- DNA הממוקד5.

עריכת גנים מבוססת CRISPR/Cas9 היא קלה לשימוש, וזולה יחסית לטכניקות קודמות לעריכתגניםוהיא הוכחה כיעילה וחזקה בריבוי מערכות 2,4,5. עם זאת, המערכת מציגה כמה מגבלות. הביטוי המכונן של Cas9 הוכח לעתים קרובות כתוצאה של מספר מוגבר של מטרות מחוץ למטרות ורעילות תאים גבוהה4,6,7,8. בנוסף, מיקוד המכונן של גנים חיוניים והישרדות תאים על ידי Cas9 לוקח את יכולתו לבצע סוגים מסוימים של מחקרים פונקציונליים כגון מחקרים קינטיים של מוות תאים7.

כלי CRISPR-Cas9 שונים, שאינם ניתנים לערעור או מבוקרים מותנית, פותחו כדי לטפל בבעיות6, כגון Tet-ON ו-Tet-Off9; רקומבינציה ספציפית לאתר10; קרבה כימית11; intein תלוי splicing3; ו 4-Hydroxytamoxifen אסטרוגן קולטן (ER) מבוסס מערכות לוקליזציה גרעינית12. באופן כללי, רוב ההליכים האלה (חיבור intein ומערכות פיצול קרבה המושרה כימית) אינם מציעים שליטה הפיכה, מציגים תגובה קינטית איטית מאוד לטיפול תרופתי (מערכת Tet-On/Off), או אינם מקובלים על מניפולציה בתפוקה גבוהה6.

כדי להתמודד עם מגבלות אלה פיתחנו ערכת כלים חדשנית שלא רק מספקת עריכת גנים מהירה וחזקה הנשלטת על ידי הזמן, אלא גם מבטיחה עקיבות, יכולת טונה וזמינות למניפולציה גנטית בתפוקה גבוהה. טכנולוגיה חדשנית זו יכולה לשמש קווי תאים, organoids, ומודלים בעלי חיים. המערכת שלנו מבוססת על תחום מהונדס, כאשר מותך Cas9, זה גרים השפלה מהירה שלה. עם זאת, ניתן לייצב אותו במהירות עם מולקולה קטנה סלקטיבית מאוד, לא רעילה, חדירת לתא. ליתר דיוק, הנדסנו את המוטציה האנושית FKBP12 "תחום מערער" (DD) ל- Cas9, מסמנת את Cas9 להשפלה מהירה ומהורכבת באמצעות מערכת אוביקוויטין-פרוטאזום כאשר היא באה לידי ביטוי בתאי יונקים13. ליגנד סינתטי DD, Shield-1 יכול לייצב את התאמת DD, ובכך למנוע את השפלה של חלבונים הותכו DD (כגון Cas9) בצורה יעילה מאוד, ועם תגובה קינטית מהירה14,15. שימו לב, מגן-1 נקשר עם שלושה סדרי גודל הדוקים יותר ל- FKBP12 המוטנטי מאשר למקבילו הפראי14.

ניתן להשתמש בזוג DD-Cas9/Shield-1 כדי לחקור את הזיהוי והאפיון השיטתיים של גנים חיוניים בתאים מתורבתים ומודלים של בעלי חיים כפי שהראנו בעבר על ידי מיקוד מותנה בגן CypD, הממלא תפקיד חשוב בחילוף החומרים של המיטוכונדריה; EGFR, שחקן מפתח בטרנספורמציה אונקוגנית; ו Tp53, גן מרכזי בתגובת נזק DNA. בנוסף לעריכת גנים מבוקרת זמנית ומותנית, יתרון נוסף של השיטה הוא שהתייצבות DD-Cas9 אינה תלויה בתעתיק שלה. תכונה זו מאפשרת ביטוי משותף, תחת אותו מקדם, של סמנים למעקב, כמו גם רקומבינסות, כגון רקומבינאז תלוי קולטן אסטרוגן, CREER. בעבודה זו, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה שלנו בהצלחה במבחנה, כדי למקד באופן מותנה למשל, גן שכפול DNA, RPA3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.וקטור DD-Cas9

  1. להשיג וקטור DD-Cas9 מ Addgene (DD-Cas9 עם רצף מילוי ונוגה (EDCPV), Plasmid 90085).
    הערה: זהו פלסמיד DD-Cas9 lentiviral עם מקדם U6 שמניע את תמלול ה- RNA המדריך היחיד (sgRNA) בעוד מקדם EFS מניע את תמלול DD-Cas9. רצף DYKDDDDK (תג דגל) נמצא בטרמינל C של Cas9 ואחריו פפטיד 2A עם מחשוף עצמי (P2A) המפריד בין DD-Cas9 לבין חלבון פלואורסצנטי שונה ונוס (mVenus).

2. עיצוב RNA מדריך קטן (sgRNA)

  1. עצב RNA מדריך קטן (sgRNA) שישוכפל לווקטור DD-Cas9 באמצעות אחד ממספר אלגוריתמים, המתמקד באזור גנומי מסוים.
    הערה: כדי להפחית את האפקטים מחוץ ליעד, בחר רצפי sgRNA עם הציון הגבוה ביותר באמצעות אתר האינטרנט: http://crispr.mit.edu.
  2. עצב והזמין שני אוליגונוקלאוטידים לכל רצף sgRNA כדי ליצור sgRNA מלא.
    הערה: מאז plasmid יתעוכל על ידי האנזים BsmBI, לעצב את קדימה ואת אוליגונוקלאוטיד הפוך על ידי הוספת עיכול BsmBI overhangs לרצף sgRNA. השתמש בתבנית מתוך טבלה 1.

3. שיבוט של sgRNA לתוך וקטור DD-Cas9 lentiviral

  1. Dephosphorylate 5′-קצוות של DD-Cas9 plasmid באמצעות פוספטאז אלקליין (FastAP) בתגובת עיכול אנזים הגבלה.
    הערה: וקטורים יכולים להסתגר מחדש במהלך קשירה במיוחד כאשר הם ליניאריים על ידי אנזים הגבלה יחיד. כדי להבטיח הווקטור לא להקיף מחדש, דה-זרחן plasmid על ידי הוספת פוספטאז ישירות לתוך תגובת העיכול.
    1. Dephosphorylate לעכל את plasmid עם אנזים BsmBI על ידי הכנת תערובת של 5 מיקרוגרם של DD-Cas9 plasmid, 6 μL של חוצץ עיכול (10x), 0.6 μL של DTT (100 mM), 3 μL של BsmBI, 3 μL של FastAP, להוסיף עד 60 μL מים ללא גרקלאז כדי להפוך 60 μL נפח התגובה הכולל.
      הערה: מוסיפים את האנזים BsmBI ו FastAP לתערובת בסופו של דבר.
    2. לדגור על התערובת במשך 30 דקות ב 37 °C בלוק חום או thermocycler.
  2. לטהר את DD-Cas9 פלסטיד מעוכל.
    1. הכן 0.8% ג'ל אגרוז DNA כדי להסיר plasmid מתעכל חלקית ועקבות של אנזימים. השתמש במסרק ג'ל רחב יותר להפרדה טובה יותר והפעל את הג'ל ב- 90 V.
    2. דמיינו רצועות מתחת לאור UV 360-365 ננומטר וחתכו את רצועת הפלסמיד הגדולה יותר מהג'ל. מחק את קטע 2 kb המתאים למילוי.
    3. טהרו את רצועת הג'ל הגדולה באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרית ובצעו את הוראות היצרן.
  3. ליגת חידשה אוליגוס עם פלסמיד DD-Cas9 מעוכל.
    1. זרחן ואנל אוליגוס sgRNA.
      1. הכן את התערובת של 1 μL של T4 חיץ קשירה (10x), 1 μL של אוליגו 1 (100 מיקרומטר), 1 μL של אוליגו 2 (100 מיקרומטר), 6.5 μL של מים ללא נוקלאז. לבסוף, להוסיף 0.5 μL של T4 PNK. הנפח הכולל של תגובה זו הוא 10 μL.
      2. הוסף את תגובת תערובת התרמוציקלר עם התנאים הבאים: 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות, 95 °C (5 דקות), ולאחר מכן רמפה עד 25 °C (5 °F) עם המהירות של 5 °C /min.
        הערה: PNK חייב להיות מומת בחום לפני oligonucleotides לשים לתוך קשירה אחרת PNK יהיה זרחן הווקטור. שלב הזרחן וצעד החישול מבוצעים יחד בתרמוציקלר. שלב הזרחן שבו 5 ' פוספט מתווסף oligonucleotides sgRNA נדרש עבור קשירה להתרחש.
    2. Ligate DD-Cas9 עיכל פלסמיד ואוליגו sgRNA.
      1. לדלל את אוליגוס מחושל ל 1: 200 במים ללא נוקלאז ולהשתמש 50 ננוגרם של DNA plasmid בתגובת קשירה.
        הערה: השתמש ביחס הטוחנת של 6 להוסיף : וקטור 1, כדי לקדם שילוב הוספה או להשתמש במחשבון קשירה כדי לחשב את יחס הטוחנת: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. הכן את תערובת תגובת הקשירה: 50 ננוגרם של וקטור DD-Cas9 מעוכל ומטוהר, נפח מתאים של אוליגוס מחושל מדולל, 1 μL של חיץ קשירת T4 (10x), 1 μL של T4 DNA Ligase, עד 10 μL מים ללא נוקלאז כדי להשיג את הנפח הכולל של התגובה 10 μL.
      3. אם משתמשים בליגאז "ריכוז גבוה", יש לדגור על התגובה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. אחרת, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות, או כדי להשיג תשואה גבוהה יותר של קשירה, דגירה ב 16 °C (50 °F) לילה.
        הערה: חימום-inactivate אם משתמשים ליגת ה- DNA T4 הסטנדרטית ב 65 °C (65 °F) במשך 20 דקות. אין לנטרל חום אם אתה משתמש בתערובות מאסטר ligase.

4. טרנספורמציה חיידקית

  1. צלחות אגר אמפיצ'ילין 10 ס"מ חמות מראש בטמפרטורת החדר.
  2. להפשיר 50 μL של "ירייה אחת Stbl3" תאי חיידקים מוסמכים על קרח.
  3. הוסף 2-3 μL של תערובת קשירה ל 50 μL של תאים חיידקיים מוסמכים ומערבבים בעדינות על ידי הבהוב תחתית הצינור עם אצבע 4 פעמים. דגירה על קרח במשך 30 דקות.
  4. חום-לזעזע את התאים בדיוק 42 °C (40 °F) במשך 40 שניות, באמצעות שעון זמן. לקרר את תאי החיידקים על קרח במשך 5 דקות.
  5. הוסף 500 μL של מדיה SOC ללא אנטיביוטיקה לתאי החיידקים ולגדל אותם באינקובטור רועד ב 250 סל"ד במשך 45 דקות, ב 37 °C (7 °F).
  6. להפיץ 100 μL של חיידקים שעברו טרנספורמציה על לוחות LB-אמפיצלין חמים מראש ודגורה לילה ב 37 °C (50 °F).

5. מיני/מקסי-הכנה של פלסמיד קשירה

  1. הכן תרבות מקסימום / מיני-הכנה למתחילים.
    1. למחרת לבחור שיבוט חיידקי יחיד ולחסן תרבות המתנע עם 8 מ"ל של מדיה LB המכיל אמפיצ'ין.
    2. לגדל את החיידקים באינקובטור רועד ב 250 סל"ד, 37 °C (55 °F) עבור 10-12 שעות.
    3. השתמש 3-5 מ"ל של חיידקים עבור מיני-הכנה או להשתמש בו כתרבית המתנע עבור maxi-prep. השתמש בשאר החיידקים כגליצריל-מלאי חיידקי על ידי הוספת 100% גליסול ביחס של תרבית חיידקים:גליצלול הוא 1:1.
      הערה: כאן, נתאר את הליך המיני-הכנה.
  2. הליך הכנה מצומצם
    1. קציר 3-5 מ"ל של תאים חיידקיים וצנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 1 דקות.
    2. Resuspend הכדור של תאים חיידקיים עם 200 μL של חוצץ P1, המכיל RNase A ומאוחסן ב 4 °C (50 °F).
    3. מוסיפים 200 μL של חוצץ P2 ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור 10 פעמים עד שהנוזל מבהיר.
    4. הוסף 300 μL של חוצץ P3 ומערבבים על ידי היפוך הצינור 10 פעמים. הנוזל יהיה מעונן. המשך מיד עם centrifuging הדגימות ב 12,000 x g במשך 10 דקות.
    5. העבר supernatant ברור לעמוד ספין צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 1 דקות.
      זרוק את הזרימה דרך.
      הערה: ודא שסופר-נט מובהר. חלקיקים יכולים לסתום את עמודת הסיבוב ולהפחית את יעילות העמודות.
    6. הוסף 400 μL של חוצץ PD וצנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 1 דקות. זרוק את הזרימה דרך.
    7. הוסף 600 μL של חוצץ PW לשטוף את עמוד ספין צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 1 דקות. זרוק את הזרימה דרך.
    8. צנטריפוגה שוב את עמודת הסיבוב במהירות הגבוהה ביותר במשך 3 דקות כדי להסיר את שאריות המאגר. להשליך את הזרימה דרך ולתת לו לשבת במשך 2 דקות.
    9. מקם את עמודת הספין לצינור טרי ולהוסיף 50 μL של חוצץ elution. דגירה במשך 5 דקות וצנטריפוגה במהירות הגבוהה ביותר במשך 2 דקות.
    10. השתמש בהתקן nanodrop כדי למדוד את הריכוז של פלסמיד DD-Cas9 מטוהר עם הכנס sgRNA (ng/μL).
  3. לאמת את שיבוט sgRNA על ידי ריצוף DNA של DD-Cas9 plasmid. השתמש ברצף הפריימר U6 בטבלה 2.

6. הכנה לנטיוויראלית

  1. הכן תאי אריזה HEK293T עבור transfection.
    1. השתמש HEK293T בריא עד מעבר 10 ולזרוע אותם באופן שווה בצפיפות 1-2 x 106 תאים לכל צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. השתמש 10 מ"ל של גלוקוז Dulbecco שונה נשר בינוני (DMEM) עם 10% סרום בקר עובר מסונן (FBS). תאי דגירה באינקובטור תרבית הרקמות, ב 5% CO2 ו 37 °C (20 °F).
    2. למחרת, לאשר כי תאים הגיעו 70% השפעה על ידי מיקרוסקופיה Brightfield וכי הם מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת. שנה מדיה לתאים שעה אחת לפני ההדבקה בנפח הסופי של 10 מ"ל.
      הערה: התקשורת צריכה להיעדר מאנטיביוטיקה ותרופות אנטי ממיקוטיקה.
    3. הכן את התערובת של 2 צינורות עם 500 μL של מדיה חמה (למשל, OptiMEM).
      1. הוסף 25 μL של ריאגנט transfection לצינור 1 המכיל חם 500 μL של מדיה, ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      2. בינתיים להכין תערובת של plasmids לצינור 2 המכיל 3.5 מיקרוגרם של DD-Cas9 המכיל sgRNA משובט, 6 מיקרוגרם של פלסמיד האריזה (psPAX2), ו 3 מיקרוגרם של plasmid המעטפה (pMD2.G) לתוך חם 500 μL של מדיה.
      3. מערבבים צינור 1 עם צינור 2 כדי ליצור תערובת transfection ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
      4. זרוק את תערובת transfection לתאי HEK293T צלחת דגירה באינקובטור תרבית הרקמות, ב 5% CO2 ו 37 °C (5°F) לילה.
      5. לאחר 18 שעות, בזהירות לשנות את המדיה ל 10 מ"ל של DMEM טרי עם 10% FBS כדי להסיר את ריאגנט transfection. דגירה ל-48 השעות הבאות.
      6. לאחר 48 שעות, לאסוף את supernatant עם מזרק 10 מ"ל ולהעביר אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
      7. Aliquot ולאחסן את הנגיף supernatant ב -80 °C (80 °F).

7. קביעת טיטר וירוס ויעילות transduction עם ציטומטריית זרימה

  1. זרע את תאי HEK293T עם 5 x 105 תאים / גם לתוך צלחת 6-טוב. תאי זרעים לשתי צלחות של 6 בארות. השתמש בצלחת אחת לספירה למחרת.
  2. לדגור על הלוחות באינקובטור ב 37 °C (7 °F), 95% לחות, 5% CO2 לילה כדי להגיע 50-60% מפגש למחרת.
  3. למחרת, השתמש באחת מלוחות 6-בארות לספור את התאים ב 6 בארות.
  4. להפשיר את aliquot הווירוס שישמש לביצוע דילול סדרתי ולהוסיף 8 מיקרוגרם / מ"ל של ריאגנט polybrene.
  5. הכן DMEM עם 10% FBS לדילול סדרתי של הנגיף ולהוסיף 8 מיקרוגרם / מ"ל של ריאגנט polybrene.
  6. הכן 2 מ"ל של דילול טורי פי עשרה של הנגיף מ- 1 x 10-1 ל- 1 x 10-4 במדיה המכילה פוליברן.
  7. הסר מדיה מצלחת 6-טוב ולהוסיף 1 מ"ל של דילול ויראלי לבארות. השאירו אחד טוב עם מדיה לבד כמו שליטה שלילית ואחד גם עם וירוס 100%.
  8. דגירה תאים עם הנגיף באינקובטור עבור 24 שעות.
  9. למחרת, להסיר את המדיה עם וירוס מ 6-טוב צלחות ולשנות אותו עבור 2 מ"ל של DMEM טרי עם 10% FBS. תאי דגירה עבור 48-72 שעות. שים לב GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל יום.
  10. לאחר 48-72 שעות, נתק את התאים והגדיל אותם מחדש במאגר MACS.
  11. השתמש בציטומטר זרימה כדי לקבוע את אחוז ביטוי GFP.
  12. חשב טיטר וירוס באמצעות הנוסחה הבאה: TU/mL = (מספר התאים transduced x אחוז פלואורסצנטי x גורם דילול)/(אמצעי אחסון טרנסדוקציה ב- mL)

8. טרנסדוקציה לנטיוויראלית של תאי יעד

  1. צלחת קו התא של עניין צלחת 10 ס"מ ודגרה לילה להגיע למפגש 50-60% למחרת.
    הערה: השתמשנו בקו התא A549 המבטא DD-Cas9 ושני sgRNAs גנים RPA3 עצמאיים. השתמשנו גם בקו התא A549 המבטא וקטור עם בקרת רנילה. זרענו את התאים האלה בצפיפות של 2 x 103תאים / ס"מ2 ודגרנו אותם ב 37 °C (5 °F), 95% לחות, 5% CO2 לילה כדי להגיע 50-60% השפעה למחרת. השתמשנו במדיה RPMI עם 10% FBS מסונן. המשכנו בשלבים הבאים כדלקמנו:
  2. למחרת, להדביק את התאים עם 500-2000 μL של חלקיקי וירוס בנפח הכולל של 10 מ"ל של מדיום תרבות. לדגור מדיה ויראלית עבור 24 שעות.
  3. למחרת, שנה את המדיה הוויראלית למדיית תרבות וקבע את אחוז התאים החיוביים של GFP באמצעות ציטומטריית זרימה.
  4. בחר תאים חיוביים של GFP לפי מיון תאים של FACS או באמצעות בחירת bleomycin.
  5. הרחב תאים שנבחרו באופן חיובי והקפא מניה.

9. אינדוקציה מותנית של עריכת גנים בתיווך Cas9

  1. צלחת בחרה חיובית תאים 24 שעות לאחר זיהום, כמו גם תאים untransduced לצלחת 12-well בנפרד. המתן עד התאים לצרף ולשנות את המדיה למדיה תרבית התא המכיל 200 nM של Shield-1. החלף את המדיה בלוחות עם תאים transduced ו untransduced, משאיר 2 בארות לכל צלחת עם מדיה רגילה כמו שליטה שלילית.
  2. לדגור ולהפיק חלבונים מכל באר בנקודות זמן שונות: זמן 0, 2 שעות, 6 שעות, 12 שעות, 24 שעות, 48 שעות, ו 72 שעות לאחר הוספת מגן-1 לבארות.
  3. לאחר מכן הסר את המדיה עם Shield-1 משאר הבארות ושנה אותה למדיה סלולרית רגילה.
  4. לאסוף את החלבונים מאותם בארות 2 שעות, 6 שעות, ו 12 שעות לאחר שינוי המדיה.
  5. דמיינו על ידי ניתוח כתם מערבי את הפיכות והמהירות של ויסות חלבון DD-Cas9 מעורער לאחר התוספת והנסיגה של הליבנד שלה, Shield-1. השתמש בנוגדן המכוון לתג DYKDDDDK כדי לדמיין חלבונים ונוגדי בקרה המיועדים למשל בטא-טובולין.
  6. לקבוע את המינון האופטימלי של מגן-1 על ידי עקומת תגובת מינון שנצפתה על ידי ניתוח כתם מערבי.

10. אימות עריכת גנים

הערה: ביטוי GFP מנסח, כגון ניתוח ציטומטריית זרימה וסמן בחירת בלומיצין רק לאשר מסירה מוצלחת של ריאגנט CRISPR, אך הם אינם קובעים אם הרצף הרצוי היה ממוקד בהצלחה. הבדיקות הנפוצות ביותר לאישור פילוח גנים מוצלח על ידי ניסוי CRISPR הן ריצוף DNA סנגר, רצף הדור הבא, נוקלאז אסאי המודד, המעקב אחר Indels על ידי פירוק (TIDE) אסאי, או ניתוח כתם מערבי16,17,18.

  1. צלחת תאים שנבחרו באופן חיובי ולשנות מדיה ל 200 nM של מדיה המכילה Shield-1. לדגור תאים במשך 5 ימים, שינוי מדיה עם מגן-1 כל 3 ימים.
  2. השתמש בטכניקות האימות שהוזכרו לעיל 5 ימים לאחר אינדוקציה DD-Cas9 על-ידי Shield-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לאפשר את הביטוי המותנה של Cas9, פיתחנו מבנה וקטורי עדשותי כפול המורכב ממקדם מונחה U6 לבטא באופן מרכיב sgRNA, ומקדם ליבה EF-1α כדי להניע את הביטוי של חלבון ההיתוך DD-Cas9 (איור 1A)19. כפרדיגמה להמחשת החוסן והיעילות של המערכת, הטרנסנו את קו התאים A549 הקרצינומטי של הריאות עם המבנה הלטיוויראלי. רמות ה- Cas9 בנוכחות או בהיעדרו של מגן הליגנד-1 נמדדו על ידי תגובת שרשרת תמלול-פולימראז הפוכה (RT-PCR) וניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן ספציפי נגד דגל. השתמשנו בתאים לא נגועים ובתאים נגועים בדמה (הרכב) כפקדים. התאים טופלו בריכוז של Shield-1 הנע בין 10 ל 1000 ננומטר עבור 7 d. כפי שמוצג, הטיפול ב-Shield-1 הצליח לווסת את הביטוי של DD-Cas9 באופן תלוי מינון חזק(איור 1B ואיור 2A). ניתוח RT-PCR עם פריימרים ספציפיים עבור DD-Cas9 ו פריימרים שליטה עבור גליצרילדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) אישר כי רמות ביטוי mRNA של DD-Cas9 היו דומות בין התאים transduced והרכב למרות נוכחות או היעדר של מגן-1(איור 2B). זה מאשר כי אינדוקציה של חלבון Cas9 הוא אירוע לאחר שעתוק.

מערכת זו מאפשרת ייצוב מהיר וה הפיך של חלבון DD-Cas9. איור 3 מראה אינדוקציה מספקת של ביטוי Cas9 בקו התא A549 שהועבר 2 שעות לאחר הטיפול ב- 200 ננומטר של Shield-1 בהשוואה לתאי A549 שלא נדבקו. עם זאת, נסיגה של Shield-1 גורמת לירידה מהירה של חלבון DD-Cas9, שהופך זניח בתוך 6 עד 12 שעות(איור 3).

חלבון RPA3 הוא מרכיב של הטרוטרימר חלבון שכפול אנושי A (RPA). זהו קומפלקס כריכת DNA חד-גדילי הממלא תפקיד חשוב בשכפול DNA, רקומבינציה ותיקון. כדי לאמת את השימוש במערכת לחקר גנים חיוניים, התמקדנו בגן RPA3. עד כאן, השתמשנו בשני RNAs מדריך יחיד ספציפיים ללוקוס (מדריכים 25 ו -44) כמו גם רנילה כפקד (מדריך 208). תאי A549 שהועברו עם המבנה הלטיוויראלי DD-Cas9 טופלו עם 200 ננומטר של Shield-1 עבור 3 d. ירידה במספר התא בתאי A549 שטופלו ב-Shield-1 המכילים את הרנ"א של מדריך RPA3 ניכרה לאחר 48 שעות של טיפול, ולא נצפתה השפעה על מספר התא בדגימת רנילה (איור 4A). כדי לאמת את הידלדלות חלבון RPA3, ביצענו ניתוח חיסוני באמצעות נוגדן נגד RPA3 3 d לאחר אינדוקציה של Sheild-1 (איור 4B). יתר על כן, אישרנו היפוך עריכת גנים או מוטציות indel באמצעות בדיקות נוקלאז מודד ורצף DNA (איור 4C).

המבנה הווקטורי הלטיוויראלי שעיצבנו נושא תכונה ייחודית: הרגולציה של יציבות חלבון DD-Cas9 אינה תלויה בביטוי ה- mRNA שלו. זה מאפשר לדור של מערכות bicistronic להביע גן אחר של עניין תחת אותו מקדם EF-1a מבלי להיות מווסת על ידי DD-Cas9 המעורער (איור 5A,5B). הוספנו גם פפטיד 2A עצמי (P2A) בין DD-Cas9 ו- mVenus, חלבון פלואורסצנטי שונה שניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תאים נגועים (איור 5A). כפי שמוקם mVenus לאחר P2A, כפי שניתן לראות מתוצאות ניתוח הכתם המערבי באיור 5B, הביטוי של חלבון mVenus נצפה ברכב ותאי A549 transduced ללא תלות בביטוי DD-Cas9 וטיפול מגן-1.

Figure 1
איור 1: סכמטי של המבנה הלטיוויראלי וכלים שונים לעריכת גנים. A) עמוד השדרה הלנטיוויראלי DD-Cas9 מכיל מקדם U6, sgRNA, מקדם EF-1a, DD, spCas9, nucleoplasmin NLS ותג דגל. B) השוואה בין מערכת DD-Cas9 (פאנל שמאלי) לבין מערכת Tet-On שונה (פאנל ימני) המשמשת ככלי לעריכת גנים. סולם Lad, תאים שאינם נגועים NI, Veh-רכב, -Sh תאים שטופלו ללא מגן-1, + תאי Sh שטופלו במגן 200 ננומטר, - תאי דוקסי ללא טיפול דוקסיציקלין, + תאי דוקסי שטופלו בדוקסיציקלין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות מייצגות של ייצוב DD-Cas9 תלוי מינון על ידי מגן-1. A) ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-תג של ביטוי DD-Cas9 מיוצב בתאים שטופלו בריכוזים הולכים וגדלים של Shield-1. כפקד, נעשה שימוש בתאים הלא נגועים (NI) ובתאים שטופלו בדמה (Veh). חלבון ההיתוך DD-Cas9 לא ניתן לגילוי בשני הפקדים. B) תוצאות RT-PCR של רמות ביטוי mRNA של DD-Cas9 בתאים transduced בהיעדר או טיפולים תלויי מינון של Shield-1 היו דומים בקרב תאים transduced ורכב, באמצעות פריימרים GAPDH כמו בקרה פנימית. נתון זה שונה מסריף ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח הכתם המערבי ממחיש את הפיכות והמהירות של ויסות חלבון DD-Cas9 מעורער לאחר נסיגת מגן-1 של הליגנד שלו. קו תא A549 Transduced עם DD-Cas9 ו- A549 לא נגוע כמו בקרה טופלו 24 שעות לאחר זיהום עם 200 ננומטר של ליגנד מגן-1 עבור נקודות הזמן שצוינו. רמת החלבון של DD-Cas9 בתאי בקרה מדומים לא הייתה ניתנת לגילוי. נתון זה שונה מסריף ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מערכת DD-Cas9 יכולה לגרום לעריכת גנים חזקה בהגדרות "אין ויטרו" ו"in-vivo". A) קו התא A549 מועבר עם וקטור המבטא sgRNA עבור הגן RPA3 ו- DD-Cas9 (RPA3). כמו פקד A549 transduced עם וקטור מבטא sgRNA עבור רנילה (רן) שימש. תאים טופלו עם Shield-1 (200 ננומטר) במשך 3 ימים אשר הביא לירידה מהירה בכדאיות התא בתאים המבטאים RPA3 sgRNA, ללא השפעה על מספר התא במדגם בקרת רנילה. היעילות של עריכת גנים RPA3 בקו התא A549 אומתה על ידי B) ניתוח כתם מערבי באמצעות הנוגדן נגד תג דגל ב RPA3 A549 ורנילה A549 בנוכחות והיעדר 3 ימים מגן-1 (200 ננומטר) טיפול ו- C) על ידי נוקלאז SURVEYOR. החצים בלוח C) מראים את שברי נוקליאז הסוקר. נתון זה שונה מסריף ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ערכה של מבנה לנטיוויראלי דו-סטרוני DD-Cas9 כדי להניע את הביטוי של mVenus ללא תלות ב-DD-Cas9. A) המבנה מורכב מקדם U6, sgRNA, מקדם EF-1a, DD-Cas9, P2A ו- mVenus. B) תאי A549 Transduced עם פלסמיד lentiviral המכיל DD-Cas9, P2A, ו mVenus טופלו עם 50 mM ליגנד מגן-1 במשך 3 ימים. ביום השלישי, ניתוח כתם המערבי בוצע עם ליסאט תא, באמצעות נוגדן נגד GFP ותג דגל בנפרד. איור 5B שונה מסריף ואח'19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קדימה (אוליגו 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
הפוך (אוליגו 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNC-3'

טבלה 1:העיצוב של אוליגונוקלאוטיד sgRNA קדימה והפוך. החלוץ (אוליגו 1) והאוליגונוקלאוטיד ההפוך (אוליגו 2) מתוכנן על ידי הוספת עיכול אנזימי BsmBI מעל רצף ה- sgRNA שלך. "N" מציין את הנוקלאוטידים השונים הקיימים ברצף sgRNA שלך, השאר הם overhangs לעיכול BsmBI.

רצף פריימר U6 5'-GACTATATGCTTACCGT-3'

טבלה 2: רצף מקדם U6 לאימות שיבוט sgRNA. כדי לאמת עד כמה מוצלח שיבוט sgRNA, השתמש ברצף מקדם U6 לרצף DNA של פלסמיד DD-Cas9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה ביכולת לחקור באופן פונקציונלי גנומים2. עם זאת, חוסר הפעילות של גנים לעתים קרובות גורם קטלניות התא, ליקויים תפקודיים, פגמים התפתחותיים, הגבלת התועלת של גישות כאלה לחקרפונקציות גנים 7. בנוסף, ביטוי ממהווה את Cas9 עלול לגרום לרעילות וליצירת אפקטים מחוץ למטרה6. גישות שונות פותחו כדי לשלוט זמנית טכנולוגיות עריכת גנום מבוסס CRISPR-Cas96. מערכות אלה מבוססות על בקרת התמלול של Cas9 ו/ או sgRNA, או הפעלה לאחר תמלול והפעלה לאחר תרגוםCas9 21,22,23. כחלופה למערכות אלה, פיתחנו ערכת כלים חדשנית המבוססת על חוסר היציבות המותנה של Cas9.

השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא תכנון של לפחות שניים או שלושה sgRNA עבור גן מסוים כדי למנוע אפקטים מחוץ למטרה ולהקל על עריכת גנים יעילה. שלב הגבלת קצב הוא המרה יעילה של קו התא עם וקטור DD-Cas9. איכות חלקיקי לנטיוירוס (טיטרים גבוהים) מסתמכת על תאי HEK-293T. חשוב להשתמש במספר מעבר נמוך (עד מעבר 10) של תאי HEK-293T שנשמרו כראוי (מפוצלים כשהגיעו ל-70% השפעה, בדרך כלל פעמיים בשבוע ביחס של 1:6). כחלופה, קו התא HEK-293 Lenti-X, שנבחר באופן קלוני להניב 30× טיטרים ויראליים גבוהים יותר מאשר תאי HEK-293T רגילים ניתן להשתמש24. צעד מכריע נוסף הוא אופטימיזציה של היחס של DD-Cas9 plasmid, psPAX2 אריזת plasmid, ו pMD2.G מעטפה plasmid. מניסיוננו, הן הנפח שבו תערובת transfection עם lipofectamine מוכן, כמו גם יחס plasmid, יש השפעה משמעותית על יעילות transfection. אנו ממליצים לעקוב אחר השלבים בפרוטוקול שלנו לקבלת התוצאות הטובות ביותר. השלב המכריע הבא לעריכת גנים יעילה הוא אופטימיזציה של ריכוזי Shield-1. אנו ממליצים על ריכוז סופי של 200 ננומטר אבל כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, הריכוז צריך להיות ממוטב לקו תא מסוים transduced. מערכת DD/Shield-1 שימשה בהצלחה בתרביות תאים שונות, בתאי נבט, בהיסטוליטיקה של פרוטוזואן אנטמואבה, אלגני קנאורגנדיטיסשל התולעים השטוחות , קסנוגרפטים מהונדסים, עכברים מהונדסים ומדאקה25. אחת המגבלות הגדולות ביותר היא העלות הגבוהה של מולקולת מגן-1, במיוחד כאשר נעשה שימוש בהגדרות vivo. בנוסף, הוכח בעבר כי חלבונים המיועדים לתאי תאים מסוימים, כגון מטריצה מיטוכונדריאלית או לומן של רטיקולום אנדופלסמי ניתן לייצב או לצבור בהיעדר מגן-1. הסיבה לכך היא שלחלבונים שונים יש מכונות שונות לבקרת איכות חלבון מקומיות26. בעוד היתוך DD בציטופלסמה או בגרעין יכול להיות מושפל ביעילות רבה בתאי יונקים ומיוצב על ידי Shield-1, כדי להתגבר על המגבלות שהוזכרו לעיל, אנו ממליצים להשתמש בתחום מערער יערות חלופי הנגזר דיהידרופולטחיידקי רדוקטאז 27. מערכת זו משתמשת trimethoprim כמולקולה מחייבת כדי לייצב את תחום היציבות והיא גם חלופה פחות יקרה מגן-127.

מלבד השגת התמלול של DD-Cas9 כביטוי עצמאי שלה, היתרונות של שיטה זו, לעומת כלי עריכת גנים CRISPR-Cas9 אחרים שאינם מובחנים או מבוקרים מותנית, הם עריכת גנים מבוקרת זמנית ומותנית, פחות אפקט מחוץ למטרה, ורעילות תאים נמוכה4,6,7,8. היעילות והפשטות של שיטת Shield-1/DD-Cas9 מאפשרות יצירת מגוון כלים שניתן להתאים ולהשתמש בהם בקלות בריבוי יישומים. המערכת יכולה לשמש בקלות גם בהגדרות vivo, והוכח כי Shield-1 יכול לחדור ביעילות דרך ברייר מוח הדם19,25,28,29. למרות שמאמר זה תיאר את השימוש בטכנולוגיית CRISPR-Cas9 לאפיון גנים חיוניים של תאים, ניתן ליישם את אותה גישה בקלות לזיהוי גנים הנדרשים להישרדות או להתקדמות של גידולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים לחברים קודמים במעבדה שלנו ולמדען שלנו, סריף סנטרק, על עבודה קודמת. אנו מודים לדנילו סגוביה שקרא את כתב היד הזה בביקורתיות. מחקר זה היה אפשרי ונתמך על ידי לשחות ברחבי אמריקה ואת המכון הלאומי לסרטן היעד גילוי ופיתוח תוכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, New York, N.Y. 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).

Tags

גנטיקה גיליון 175 עריכת גנים מחקרים גנומיים פונקציונליים CRISPR Cas9 תחום מערער לא ניתן לערעור
ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Šafarič Tepeš, P.,… More

Šafarič Tepeš, P., Sordella, R. A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization. J. Vis. Exp. (175), e60685, doi:10.3791/60685 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter