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Genetics

Um novo kit de ferramentas para avaliar funções genéticas usando estabilização condicional cas9

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Aqui, descrevemos uma ferramenta de edição de genomas baseada na estabilização temporal e condicional da re repetição palindômica curta interespaçada regularmente interespaçada ( CRISPR-) (Cas9) sob a pequena molécula, Shield-1. O método pode ser usado para células cultivadas e modelos animais.

Abstract

A tecnologia de retecção palindômica curta interespaçada (CRISPR-) (CRISPR-) se tornou uma ferramenta de laboratório predominante para introduzir modificações precisas e direcionadas no genoma. Sua enorme popularidade e rápida disseminação são atribuídas ao seu fácil uso e precisão em comparação com seus antecessores. No entanto, a ativação constitutiva do sistema tem aplicações limitadas. Neste artigo, descrevemos um novo método que permite o controle temporal da atividade CRISPR/Cas9 com base na estabilização condicional da proteína Cas9. Fundir um mutante projetado da proteína de ligação de rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) permite a rápida degradação do Cas9 que, por sua vez, pode ser estabilizado pela presença de um ligante sintético FKBP12 (Shield-1). Ao contrário de outros métodos induíveis, este sistema pode ser adaptado facilmente para gerar sistemas bi-cistronic para co-expressar DD-Cas9 com outro gene de interesse, sem regulação condicional do segundo gene. Este método permite a geração de sistemas rastreáveis, bem como a manipulação paralela e independente de alelos visados pela nuclease Cas9. A plataforma deste método pode ser utilizada para a identificação sistemática e caracterização de genes essenciais e o interrogatório das interações funcionais de genes em ambientes in vitro e in vivo.

Introduction

CRISPR-Cas9 que significa "agrupada regularmente interespaçada proteína palindômica associada a repetições 9" foi descoberta pela primeira vez como parte de estudos sobre imunidade adaptativa bacteriana1,2. Hoje, o CRISPR/Cas9 tornou-se a ferramenta mais reconhecida para edição de genes programáveis e diferentes iterações do sistema foram desenvolvidas para permitir modulações transcricionais e epigenéticas3. Esta tecnologia permite a manipulação genética altamente precisa de quase qualquer sequência de DNA4.

Os componentes essenciais de qualquer edição de genes CRISPR são uma sequência de RNA guia personalizável e a nuclease Cas95. O guia RNA se liga à sequência alvo-complementar no DNA, direcionando a nuclease Cas9 para realizar uma quebra de dois fios em um ponto específico no genoma3,4. O local de decote resultante é então reparado por nhej (nhej) ou reparo direcionado por esmologia (HDR), com a consequente introdução de alterações na sequência de DNA direcionada5.

A edição de genes baseada em CRISPR/Cas9 é fácil de usar e relativamente barata em comparação com técnicas anteriores de edição de genes e tem sido comprovadamente eficiente e robusta em uma multiplicidade de sistemas2,4,5. No entanto, o sistema apresenta algumas limitações. A expressão constitutiva de Cas9 tem sido frequentemente demonstrada como resultado de um aumento do número de fora dos alvos e alta toxicidade celular4,6,7,8. Além disso, o direcionamento constitutivo de genes essenciais e de sobrevivência celular por Cas9 tira sua capacidade de realizar certos tipos de estudos funcionais, como estudos cinéticos de morte celular7.

Diferentes ferramentas CRISPR-Cas9 controladas condicionalmente ou controladas condicionalmente foram desenvolvidas para resolver essas questões6, como Tet-ON e Tet-Off9; recombinação específica do local10; proximidade quimicamente induzida11; emenda dependente da inteínia3; e 4-Receptor de Estrogênio baseado em Hidroxitamoxifen (ER) sistemas de localização nuclear12. Em geral, a maioria desses procedimentos (splicing de intein e sistemas de divisão de proximidade quimicamente induzidos) não oferecem controle reversível, apresentam uma resposta cinética muito lenta ao tratamento medicamentoso (sistema Tet-On/Off), ou não são favoráveis à manipulação de alta produtividade6.

Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um novo kit de ferramentas que não só fornece edição de genes controlados temporais e rápidos, mas também garante rastreabilidade, sintonia e comodidade à manipulação de genes de alto throughput. Esta nova tecnologia pode ser usada em linhas celulares, organoides e modelos animais. Nosso sistema é baseado em um domínio projetado, quando fundido ao Cas9, induz sua rápida degradação. No entanto, pode ser rapidamente estabilizado com uma molécula pequena altamente seletiva, não tóxica e permeável celular. Mais especificamente, projetamos o mutante FKBP12 humano "domínio desestabilizador" (DD) para Cas9, marcando Cas9 para degradação rápida e constitutiva através do sistema ubiquitin-proteasome quando expresso em células mamíferas13. O ligante sintético DD, Shield-1 pode estabilizar a conformação DD, evitando assim a degradação de proteínas fundidas ao DD (como Cas9) de forma muito eficiente, e com uma resposta cinética rápida14,15. Note-se que o Shield-1 liga-se com três ordens de magnitude mais apertadas ao mutante FKBP12 do que à sua contraparte do tipo selvagem14.

O par DD-Cas9/Shield-1 pode ser usado para estudar a identificação sistemática e caracterização de genes essenciais em células cultivadas e modelos animais, como mostramos anteriormente mirando o gene CypD, que desempenha um papel importante no metabolismo das mitocôndrias; EGFR, um player-chave na transformação oncogênica; e Tp53, um gene central na resposta a danos de DNA. Além da edição de genes temporal e condicionalmente controlada, outra vantagem do método é que a estabilização do DD-Cas9 é independente de sua transcrição. Esse recurso permite a co-expressão, sob o mesmo promotor, de marcadores rastreáveis, bem como recombinases, como a recombinase dependente do receptor de estrogênio, CREER. Neste trabalho, mostramos como nosso método pode ser usado com sucesso in vitro, para atingir condicionalmente, por exemplo, o gene de replicação de DNA, RPA3.

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Protocol

1.O vetor DD-Cas9

  1. Obtenha vetor DD-Cas9 de Addgene (DD-Cas9 com sequência de enchimento e Vênus (EDCPV), Plasmid 90085).
    NOTA: Este é um plasmídeo lentiviral DD-Cas9 com um promotor U6 que conduz a transcrição do RNA de guia único (sgRNA), enquanto o promotor do EFS conduz a transcrição DD-Cas9. A sequência DYKDDDDK (sinalização) está presente no terminal C de Cas9, seguida por 2A peptídeo auto-cleaving (P2A) que separa DD-Cas9 e proteína fluorescente modificada Vênus (mVenus).

2. Design de RNA de guia pequeno (sgRNA)

  1. Projete um pequeno guia RNA (sgRNA) que será clonado no vetor DD-Cas9 usando um dos vários algoritmos, visando uma região genômica específica.
    NOTA: Para reduzir os efeitos fora do alvo, selecione sequências sgRNA com a pontuação mais alta usando o site: http://crispr.mit.edu.
  2. Projete e peça dois oligonucleotídeos por sequência sgRNA para fazer um sgRNA completo.
    NOTA: Uma vez que o plasmídeo será digerido pela enzima BsmBI, projete o oligonucleotídeo para a frente e o oligonucleotídeo reverso adicionando saliências de digestão BsmBI à sequência sgRNA. Use o modelo da Tabela 1.

3. Clonagem de sgRNA no vetor lentiviral DD-Cas9

  1. Desfosforilizar as extremidades de 5′-ends do plasmídeo DD-Cas9 usando fosfattase alcalina (FastAP) em uma reação de digestão enzimática de restrição.
    NOTA: Os vetores podem ressiscirgar durante a ligadura especialmente quando são linearizados por uma única enzima de restrição. Para garantir que o vetor não ress circularize, desfosforilize o plasmídeo adicionando fosfattase diretamente na reação de digestão.
    1. Desfosforila e digerir o plasmídeo com enzima BsmBI preparando uma mistura de 5 μg de plasmídeo DD-Cas9, 6 μL de tampão digestivo (10x), 0,6 μL de DTT (100 mM), 3 μL de BsmBI, 3 μL de FastAP, adicione até 60 μL de água sem nuclease para fazer 60 μL o volume total de reação.
      NOTA: Adicione a enzima BsmBI e o FastAP à mistura no final.
    2. Incubar a mistura por 30 min a 37 °C de bloco de calor ou termciclador.
  2. Purifique o plasmídeo DD-Cas9 digerido.
    1. Prepare um gel de 0,8% de DNA agarose para remover plasmídeos incompletos digeridos e traços de enzimas. Use um pente de gel mais largo para uma melhor separação e execute o gel a 90 V.
    2. Visualize bandas sob luz UV de 360-365 nm e corte a banda plasmida maior do gel. Descarte o fragmento de 2 kb correspondente ao enchimento.
    3. Purifique a grande banda de gel cortada usando um kit comercial de purificação de gel e siga as instruções do fabricante.
  3. Ligate annealed oligos com plasmídeo DD-Cas9 digerido.
    1. Fosforilato e anneal os oligos sgRNA.
      1. Prepare a mistura de 1 μL de Tampão de Ligadura T4 (10x), 1 μL de Oligo 1 (100 μM), 1 μL de Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL de água sem nuclease. Por último, adicione 0,5 μL de T4 PNK. O volume total desta reação é de 10 μL.
      2. Adicione a mistura de reação ao termociclador com as seguintes condições: 37 °C para 30 min, 95 °C por 5 min e, em seguida, aumente até 25 °C com a velocidade de 5 °C/min.
        NOTA: O PNK deve ser inativado pelo calor antes que os oligonucleotídeos sejam colocados na ligadura caso contrário, o PNK irá fosforilar o vetor. A etapa de fosforilação e o passo de ressarcimento são realizados em conjunto em um termociclador. A etapa de fosforilação onde o fosfato de 5' é adicionado aos oligonucleotídeos sgRNA é necessário para que a ligadura ocorra.
    2. Ligate DD-Cas9 digerido plasmídeo e sgRNA oligos.
      1. Diluir os oligos enlatados para 1:200 em água sem nuclease e usar 50 ng de DNA plasmídeo na reação de ligadura.
        NOTA: Utilize a razão molar da inserção 6 : 1 vetor, para promover a integração da inserção ou utilizar uma calculadora de ligadura para calcular a razão molar: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Prepare a mistura de reação de ligadura: 50 ng de vetor DD-Cas9 digerido e purificado, volume apropriado de oligos diluídos, 1 μL de Tampão de Ligação T4 (10x), 1 μL de T4 DNA Ligase, até 10 μL asenucle-free água para obter o volume total da reação 10 μL.
      3. Se usar ligase de "alta concentração", incubar a reação à temperatura ambiente por 5 minutos. Caso contrário, incubar à temperatura ambiente por 2h, ou para obter um rendimento maior de ligadura, incubar a 16 °C durante a noite.
        NOTA: Inativar-se a calor se usar o ligase de DNA T4 padrão a 65 °C por 20 minutos. Não inativar o calor se estiver usando misturas mestres ligase.

4. Transformação bacteriana

  1. Pré-quente 10 cm LB-ampicillin placas de ágar à temperatura ambiente.
  2. Descongele 50 μL de células bacterianas competentes "One shot Stbl3" no gelo.
  3. Adicione 2-3 μL de mistura de ligadura a 50 μL de células bacterianas competentes e misture suavemente apertando a parte inferior do tubo com um dedo 4 vezes. Incubar no gelo por 30 minutos.
  4. Choque térmico das células a exatamente 42 °C durante 40 segundos, usando um temporizador. Esfrie as células bacterianas no gelo por 5 minutos.
  5. Adicione 500 μL de mídia SOC sem antibiótico às células bacterianas e plante-as na incubadora de agitação a 250 rpm por 45 min, a 37 °C.
  6. Espalhe 100 μL de bactérias transformadas em placas pré-quentes lb-ampicillin e incubar durante a noite a 37 °C.

5. Mini/maxi-prep de plasmídeo ligado

  1. Prepare uma cultura de partida maxi/mini-prep.
    1. No dia seguinte, escolha um único clone bacteriano e inocula uma cultura inicial com 8 mL de mídia LB contendo ampicilina.
    2. Cresça as bactérias na incubadora de agitação a 250 rpm, 37 °C para 10-12 h.
    3. Use 3-5 mL de bactérias para mini-preparação ou use-a como uma cultura inicial para maxi-prep. Use o resto da bactéria como um glicerol bacteriano adicionando 100% de glicerol na razão da cultura bacteriana:glicerol é 1:1.
      NOTA: Aqui, descreveremos o procedimento de mini-preparação.
  2. Mini-preparação
    1. Colher 3-5 mL de células bacterianas e centrífuga a 12.000 x g por 1 min.
    2. Resuspenque a pelota de células bacterianas com 200 μL de tampão P1, contendo RNase A e armazenada a 4 °C.
    3. Adicione 200 μL de tampão P2 e misture suavemente invertendo o tubo 10 vezes até que o líquido esclaregue.
    4. Adicione 300 μL de tampão P3 e misture invertendo o tubo 10 vezes. O líquido ficará nublado. Prossiga imediatamente com centrifugação das amostras a 12.000 x g por 10 minutos.
    5. Transfira supernante claro para a coluna de giro e centrífuga a 12.000 x g por 1 min.
      Descarte o fluxo.
      NOTA: Certifique-se de que o supernatante esteja esclarecido. As partículas podem entupir a coluna de giro e reduzir a eficácia da coluna.
    6. Adicione 400 μL de tampão PD e centrífuga a 12.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo.
    7. Adicione 600 μL de tampão PW para lavar a coluna de giro e centrífuga a 12.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo.
    8. Centrifugar novamente a coluna de giro em velocidade máxima por 3 minutos para remover os resíduos do buffer. Descarte o fluxo e deixe descansar por 2 minutos.
    9. Coloque a coluna de giro em um tubo fresco e adicione 50 μL de tampão de eluição. Incubar por 5 min e centrífuga em velocidade máxima por 2 min.
    10. Use o dispositivo nanodrop para medir a concentração de plasmídeo DD-Cas9 purificado com a inserção sgRNA (ng/μL).
  3. Validar a clonagem de sgRNA por sequenciamento de DNA do plasmídeo DD-Cas9. Use a sequência de primer U6 na Tabela 2.

6. Preparação lentiviral

  1. Prepare as células de embalagem HEK293T para transfecção.
    1. Use HEK293T saudável até a passagem 10 e semee-as uniformemente na densidade 1-2 x 106 células por placa de cultura tecidual de 10 cm. Use 10 mL de Glicose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro bovino fetal filtrado (FBS). Incubar células na incubadora de cultura tecidual, a 5% de CO2 e 37 °C por 20 h.
    2. No dia seguinte, confirme que as células atingiram 70% de confluência por microscopia de campo brilhante e que estão uniformemente dispersas pela placa. Mude a mídia para as células 1h antes da transfecção com o volume final de 10 mL.
      NOTA: A mídia deve estar ausente de antibióticos e antimípticos.
    3. Prepare a mistura de 2 tubos com 500 μL de mídia quente (por exemplo, OptiMEM).
      1. Adicione 25 μL de reagente de transfecção ao tubo 1 contendo 500 μL quentes de mídia e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
      2. Enquanto isso, prepare uma mistura de plasmídeos ao tubo 2 contendo 3,5 μg de DD-Cas9 contendo sgRNA clonado, 6 μg do plasmídeo de embalagem (psPAX2) e 3 μg do plasmid envelope (pMD2.G) em 500 μL de mídia quente.
      3. Misture o tubo 1 com o tubo 2 para formar uma mistura de transfecção e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
      4. Dropwise a mistura de transfecção para células HEK293T e placa incubada na incubadora de cultura tecidual, a 5% DE CO2 e 37 °C durante a noite.
      5. Após 18 h, mude cuidadosamente a mídia para 10 mL de DMEM fresco com 10% de FBS para remover o reagente de transfecção. Incubar pelas próximas 48 horas.
      6. Depois de 48 h, colete o supernaspetivo com uma seringa de 10 mL e passe-o através de um filtro de 0,45 μm.
      7. Aliquot e armazene o vírus supernante a -80 °C.

7. Determinando a eficácia do vírus e da transdução com citometria de fluxo

  1. Semente as células HEK293T com 5 x 105 células/bem em uma placa de 6 poços. Células de sementes em duas placas de 6 poços. Use uma placa para contar no dia seguinte.
  2. Incubar as placas na incubadora a 37 °C, 95% de umidade, 5% de CO2 durante a noite para atingir 50-60% de confluência no dia seguinte.
  3. No dia seguinte, use uma das placas de 6 poços para contar as células em 6 poços.
  4. Descongele a alíquota do vírus que será usada para realizar a diluição serial e adicione 8 μg/mL de reagente de polibreno.
  5. Prepare o DMEM com 10% de FBS para diluição serial do vírus e adicione 8 μg/mL de reagente de polibreno.
  6. Prepare 2 mL de diluições de dez vezes mais do que o lentivírus de 1 x 10-1 a 1 x 10-4 em mídia contendo polibrene.
  7. Remova a mídia da placa de 6 poços e adicione 1 mL de diluições virais aos poços. Deixe um bem com a mídia sozinho como controle negativo e um bem com 100% vírus.
  8. Incubar células com o vírus na incubadora por 24 h.
  9. No dia seguinte, remova a mídia com vírus de placas de 6 poços e troque-a por 2 mL de DMEM fresco com 10% de FBS. Incubar células por 48-72 h. Observe gfp usando um microscópio fluorescente todos os dias.
  10. Após 48-72 h, desprender as células e resuspensá-las no buffer MACS.
  11. Use um citômetro de fluxo para determinar a porcentagem de expressão GFP.
  12. Calcular o titr do vírus usando a seguinte fórmula: TU/mL = (Número de células transduzidas x Fator de Diluição por cento fluorescente x diluição)/(Volume de transdução em mL)

8. Transdução lentiviral de células-alvo

  1. Emplaque a linha celular de interesse para uma placa de 10 cm e incubar durante a noite para atingir confluência de 50-60% no dia seguinte.
    NOTA: Usamos a linha celular A549 expressando DD-Cas9 e dois sgRNAs independentes de gene RPA3. Também usamos a linha celular A549 expressando vetor com controle Renilla. Semeamos essas células na densidade de 2 x 103células/cm2 e as incubamos a 37 °C, 95% de umidade, 5% de CO2 durante a noite para atingir 50-60% de confluência no dia seguinte. Usamos mídia RPMI com FBS 10% filtrados. Prosseguimos com os próximos passos:
  2. No dia seguinte, infecte as células com 500-2000 μL de partículas de vírus em 10 mL de volume total de meio de cultura. Incubar mídia viral por 24 h.
  3. No dia seguinte, mude a mídia viral para a mídia cultural e determine a porcentagem de células positivas de GFP usando citometria de fluxo.
  4. Selecione células positivas GFP por classificação celular FACS ou usando seleção de bleomicina.
  5. Expanda células selecionadas positivamente e congele um estoque.

9. Indução condicional da edição de genes mediados cas9

  1. Placa selecionou positivamente células 24 h após a infecção, bem como células não traduzidas para placa de 12 poços separadamente. Aguarde até que as células anexem e alterem a mídia para a mídia de cultura celular contendo 200 nM de Shield-1. Substitua a mídia nas placas por células transduzidas e não traduzidas, deixando 2 poços por placa com mídia regular como um controle negativo.
  2. Incubar e extrair proteínas de cada poço em diferentes pontos de tempo: tempo 0, 2h, 6h, 12h, 24h, 48 h e 72h depois de adicionar o Escudo-1 aos poços.
  3. Em seguida, remova a mídia com shield-1 do resto dos poços e mude-a para mídia celular regular.
  4. Recolhe as proteínas desses poços 2h, 6 h e 12h depois de mudar a mídia.
  5. Visualize pela análise da mancha ocidental a reversibilidade e rapidez da regulação de proteína DD-Cas9 desestabilizada após a adição e a retirada de seu ligante, Shield-1. Use anticorpos direcionados para dykddddk tag para visualizar proteínas e um anticorpo de controle direcionado, por exemplo, beta-tubulin.
  6. Determine a dose ideal de Shield-1 por curva de dose-resposta observada pela análise de Western Blot.

10. Validação da edição de genes

NOTA: Os ensaios de expressão GFP, como análise de citometria de fluxo e marcador de seleção de bleomicina, apenas confirmam a entrega bem sucedida do reagente CRISPR, mas não determinam se a sequência desejada foi alvo com sucesso. Os ensaios mais comuns para confirmar o sucesso do direcionamento genético pelo experimento CRISPR são o sequenciamento de DNA Sanger, o sequenciamento de próxima geração, o Surveyor Nuclease Assay, o Rastreamento de Indels por Ensaio de Decomposição (TIDE) Ou a análise da mancha ocidental16,17,18.

  1. Placa selecionou positivamente células e alterar mídia para 200 nM de Shield-1 contendo mídia. Incubar células por 5 dias, mudando a mídia com shield-1 a cada 3 dias.
  2. Use as técnicas de validação acima mencionadas 5 dias após a indução de DD-Cas9 pelo Shield-1.

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Representative Results

Para permitir a expressão condicional do Cas9, desenvolvemos uma construção vetorial lentiviral dupla composta por um promotor orientado pelo U6 para expressar constitutivamente o sgRNA, e um promotor central EF-1α para conduzir a expressão da proteína de fusão DD-Cas9(Figura 1A)19. Como paradigma para ilustrar a robustez e eficiência do sistema, transduzímos a linha celular carcinomatosa pulmonar A549 com a construção lentiviral. Os níveis de Cas9 na presença ou ausência do ligante Shield-1 foram medidos pela reação de cadeia de transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) e análise de manchas ocidentais usando um anticorpo específico anti-Bandeira. Usamos células não infectadas e células infectadas por simulação (o veículo) como controles. As células foram tratadas com uma concentração de Shield-1 variando de 10 a 1000 nM para 7 d. Como mostrado, o tratamento com Shield-1 foi capaz de regular a expressão de DD-Cas9 de forma forte dependente de dose(Figura 1B e Figura 2A). A análise rt-PCR com primers específicos para DD-Cas9 e primers de controle para gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) confirmou que os níveis de expressão mRNA de DD-Cas9 eram semelhantes entre as células transduzidas e o veículo, apesar da presença ou ausência de Shield-1(Figura 2B). Isso confirma que a indução da proteína Cas9 é um evento pós-transcrição.

Este sistema permite estabilização rápida e reversível da proteína DD-Cas9. A Figura 3 mostra indução suficiente da expressão Cas9 na linha celular A549 transduzida 2 h após o tratamento com 200 nM de Shield-1 em comparação com as células A549 não infectadas. No entanto, a retirada do Shield-1 resulta em uma rápida diminuição da proteína DD-Cas9, que se torna insignificante dentro de 6 a 12 h(Figura 3).

A proteína RPA3 é um componente do heterotrimer da proteína de replicação humana A (RPA). É um complexo de ligação de DNA de uma única vez que desempenha um papel importante na replicação, recombinação e reparo do DNA. Para validar o uso do sistema para estudar genes essenciais, visamos o gene RPA3. Para isso, utilizamos dois RNAs de guia único específico de lócus independente (guias 25 e 44) e Renilla como controle (guia 208). As células A549 transduzidas com a construção lentiviral DD-Cas9 foram tratadas com 200 nM de Shield-1 para 3 d. Uma diminuição no número celular em células A549 transduzidas pelo Shield-1 contendo o RNA guia RPA3 foi aparente após 48 horas de tratamento, e nenhum efeito foi observado no número celular na amostra de Renilla(Figura 4A). Para validar o esgotamento da proteína RPA3, realizamos uma análise de imunobloquetação utilizando um anticorpo contra RPA3 3 d após indução de Sheild-1(Figura 4B). Além disso, confirmamos a inversão de edição de genes ou mutações indel usando ensaios nuclease surveyor e sequenciamento de DNA(Figura 4C).

A construção vetorial lentiviral que projetamos tem uma característica única: a regulação da estabilidade da proteína DD-Cas9 é independente de sua expressão mRNA. Isso permite que a geração de sistemas bicistronics expresse outro gene de interesse sob o mesmo promotor EF-1a sem ser modulada pelo DD-Cas9 desestabilizado (Figura 5A,5B). Também adicionamos um peptídeo auto-cuteting 2A (P2A) entre DD-Cas9 e mVenus, uma proteína fluorescente modificada que pode ser usada para rastrear células infectadas(Figura 5A). Como o mVenus é colocado após P2A, como mostram os resultados da análise de Western Blot na Figura 5B, a expressão da proteína mVenus foi observada no veículo e células transduzidas A549 independentes da expressão DD-Cas9 e do tratamento Shield-1.

Figure 1
Figura 1: Esquema da construção lentiviral e diferentes ferramentas de edição de genes. A) A espinha dorsal lentiviral DD-Cas9 contém um promotor U6, sgRNA, promotor EF-1a, DD, spCas9, nucleoplasmin NLS e Flag-tag. B) Comparação entre o sistema DD-Cas9 (painel esquerdo) e diferente sistema Tet-On (painel direito) usado como ferramentas de edição de genes. Células não infectadas de lad-ladder, NI-não-infectadas, veh-vehicle, -Sh células tratadas sem Shield-1, + Células Sh tratadas com escudo de 200 nM, - células doxiciclinas sem tratamento de doxiciclina, + células doxiciclina tratadas com doxiciclina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos da estabilização DD-Cas9 dependente de dose pelo Shield-1. A) Análise de manchas ocidentais usando um anticorpo anti-bandeira-tag de expressão DD-Cas9 estabilizada em células tratadas com concentrações crescentes de Shield-1. Como controle, foram utilizadas as células não infectadas (NI) e as células tratadas por simulação (Veh). A proteína de fusão DD-Cas9 era indetectável em ambos os controles. B) Os resultados do RT-PCR dos níveis de expressão mRNA de DD-Cas9 em células transduzidas na ausência ou tratamentos dependentes de dose do Shield-1 foram semelhantes entre células transduzidas e veículos, utilizando primers GAPDH como controle interno. Este número foi modificado a partir de Serif et al19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A análise western blot ilustra a reversibilidade e rapidez da regulação de proteína DD-Cas9 desestabilizada após a retirada de seu escudo-1. A linha celular A549 transduzida com DD-Cas9 e A549 não infectados como controle foram tratados 24 h após infecção com 200 nM de ligante Shield-1 para os pontos de tempo indicados. O nível de proteína de DD-Cas9 em células de controle simulada era indetectável. Este número foi modificado a partir de Serif et al19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O sistema DD-Cas9 pode induzir uma edição robusta de genes em configurações "in vitro" e "in-vivo". A) A linha celular A549 transduzida com um vetor expressando sgRNA para gene RPA3 e DD-Cas9 (RPA3). Como controle, foi utilizado um A549 transduzido com um vetor expressando sgRNA para Renilla (Ren). As células foram tratadas com Shield-1 (200 nM) durante 3 dias, o que resultou em uma rápida diminuição da viabilidade celular em células expressando RPA3 sgRNA, sem efeito sobre o número celular na amostra de controle de Renilla. A eficiência da edição de genes RPA3 na linha celular A549 foi validada pela análise B) Western Blot usando o anticorpo contra bandeira-tag em RPA3 A549 e Renilla A549 na presença e ausência de 3 dias de tratamento Shield-1 (200 nM) e C) pelo ensaio nuclease SURVEYOR. As setas do painel C) mostram os fragmentos do ensaio nuclease do SURVEYOR. Este número foi modificado a partir de Serif et al19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Esquema de uma construção lentiviral DD-Cas9 bicistrônica para conduzir a expressão de mVenus independentemente de DD-Cas9. A) A construção é composta por promotor u6, sgRNA, promotor EF-1a, DD-Cas9, P2A e mVenus. B) As células A549 transduzidas com plasmídeo lentiviral contendo DD-Cas9, P2A e mVenus foram tratadas com 50 mM de ligante Shield-1 durante 3 dias. No terceiro dia, a análise da mancha ocidental foi realizada com liseto celular, utilizando o anticorpo contra GFP e Flag-tag separadamente. A Figura 5B foi modificada a partir de Serif et al19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para a frente (Oligo 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
Reverso (Oligo 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Tabela 1:O desenho do oligonucleotídeo sgRNA para frente e invertido. O oligonucleotídeo para a frente (Oligo 1) e o inverso (Oligo 2) é projetado adicionando a digestão da enzima BsmBI paira sobre a sequência sgRNA. "N" denota os diferentes nucleotídeos presentes na sua sequência de sgRNA, o resto são saliências para digestão BsmBI.

Sequência de primer U6 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'

Tabela 2: A sequência de promotores U6 para validação de clonagem sgRNA. Para validar o quão bem sucedida é a clonagem sgRNA, use a sequência de promotores U6 para sequenciamento de DNA do plasmídeo DD-Cas9.

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Discussion

A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a capacidade de interrogar funcionalmente genomas2. No entanto, a inativação de genes muitas vezes resulta em letalidade celular, déficits funcionais e defeitos de desenvolvimento, limitando a utilidade de tais abordagens para o estudo das funções genéticas7. Além disso, a expressão constitutiva do Cas9 pode resultar em toxicidade e na geração de efeitos fora do alvo6. Diferentes abordagens foram desenvolvidas para controlar temporalmente as tecnologias de edição de genoma baseadas em CRISPR-Cas96. Esses sistemas são baseados no controle transcricional do Cas9 e/ou do sgRNA, ou na ativação pós-transcricional e pós-translacionalcas9 21,22,23. Como alternativa a esses sistemas, desenvolvemos um novo kit de ferramentas baseado na desestabilização condicional do Cas9.

O passo crítico neste protocolo é o projeto de pelo menos dois ou três sgRNA para um gene específico para evitar efeitos fora do alvo e facilitar a edição eficiente de genes. Um passo limitante de taxa é uma transformação eficiente da linha celular com o vetor DD-Cas9. A qualidade das partículas de lentivírus (tetas altas) depende das células HEK-293T. É crucial usar um número de passagem baixo (até a passagem 10) das células HEK-293T que foram devidamente mantidas (divididas quando atingiram 70% de confluência, geralmente duas vezes por semana em uma razão de 1:6). Como alternativa, a linha de células HEK-293 Lenti-X, que foi clonalmente selecionada para produzir 30× títulos virais mais altos do que as células HEK-293T normais podem ser usadas24. Outro passo crucial é a otimização da razão do plasmídeo DD-Cas9, plasmídeo de embalagem psPAX2 e plasmídeo de envelope pMD2.G. Em nossa experiência, tanto o volume em que a mistura de transfecção com lipofectamina é preparada, quanto a razão plasmida, têm um efeito substancial sobre a eficiência da transfecção. Recomendamos seguir os passos em nosso protocolo para obter os melhores resultados. O próximo passo crucial para a edição eficiente de genes é a otimização das concentrações do Shield-1. Recomendamos uma concentração final de 200 nM, mas para alcançar os melhores resultados, a concentração deve ser otimizada para uma linha celular transduzida específica. O sistema DD/Shield-1 tem sido usado com sucesso em diferentes culturas celulares, células germinativas, o protozoário Entamoeba histolytica, o flatworm Caenorhabditis elegans,xenoenxertos transgênicos, camundongos transgênicos e medaka25. Uma das maiores limitações é o alto custo da molécula Shield-1, especialmente quando é usada em configurações in vivo. Além disso, já foi demonstrado anteriormente que as proteínas que são direcionadas a certos compartimentos celulares, como a matriz mitocondrial ou lúmen do ânticulo endoplasmático podem ser estabilizadas ou acumuladas na ausência do Escudo-1. Isso porque diferentes proteínas possuem diferentes máquinas locais de controle de qualidade de proteína26. Enquanto as fusões dD no citoplasma ou núcleo podem ser muito eficientemente degradadas em células mamíferas e estabilizadas pelo Shield-1, para superar as limitações mencionadas acima, recomendamos o uso de um domínio alternativo desestabilizador derivado da redução dihidrofola bacteriana27. Este sistema usa trimetoprim como uma molécula de ligação para estabilizar o domínio de desestabilização e também é uma alternativa menos cara ao Shield-127.

Além de alcançar a transcrição do DD-Cas9 como sua expressão independente, as vantagens deste método, em comparação com outras ferramentas de edição de genes CRISPR-Cas9 indutíveis ou controladas condicionalmente, são a edição de genes controlados temporal e condicionalmente, o efeito menos fora do alvo e a menor toxicidade celular4,6,7,8. A eficiência e a simplicidade do método Shield-1/DD-Cas9 permitem a geração de uma variedade de ferramentas que podem ser facilmente adaptadas e utilizadas em uma multiplicidade de aplicações. O sistema também pode ser facilmente utilizado em configurações in vivo, e foi demonstrado que o Shield-1 pode penetrar eficientemente através do barier hemráencefão19,25,28,29. Embora este artigo descreveu o uso da tecnologia CRISPR-Cas9 para a caracterização de genes celulares essenciais, a mesma abordagem poderia ser facilmente implementada para a identificação de genes necessários para a sobrevivência ou progressão de tumores.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Acknowledgments

Agradecemos aos membros anteriores do nosso laboratório e cientista Serif Senturk pelo trabalho anterior. Agradecemos a Danilo Segovia pela leitura crítica deste manuscrito. Este estudo foi possível e apoiado pela Swim Across America e pelo programa National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

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References

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