Summary

Um novo kit de ferramentas para avaliar funções genéticas usando estabilização condicional cas9

Published: September 02, 2021
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Summary

Aqui, descrevemos uma ferramenta de edição de genomas baseada na estabilização temporal e condicional da re repetição palindômica curta interespaçada regularmente interespaçada ( CRISPR-) (Cas9) sob a pequena molécula, Shield-1. O método pode ser usado para células cultivadas e modelos animais.

Abstract

A tecnologia de retecção palindômica curta interespaçada (CRISPR-) (CRISPR-) se tornou uma ferramenta de laboratório predominante para introduzir modificações precisas e direcionadas no genoma. Sua enorme popularidade e rápida disseminação são atribuídas ao seu fácil uso e precisão em comparação com seus antecessores. No entanto, a ativação constitutiva do sistema tem aplicações limitadas. Neste artigo, descrevemos um novo método que permite o controle temporal da atividade CRISPR/Cas9 com base na estabilização condicional da proteína Cas9. Fundir um mutante projetado da proteína de ligação de rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) permite a rápida degradação do Cas9 que, por sua vez, pode ser estabilizado pela presença de um ligante sintético FKBP12 (Shield-1). Ao contrário de outros métodos induíveis, este sistema pode ser adaptado facilmente para gerar sistemas bi-cistronic para co-expressar DD-Cas9 com outro gene de interesse, sem regulação condicional do segundo gene. Este método permite a geração de sistemas rastreáveis, bem como a manipulação paralela e independente de alelos visados pela nuclease Cas9. A plataforma deste método pode ser utilizada para a identificação sistemática e caracterização de genes essenciais e o interrogatório das interações funcionais de genes em ambientes in vitro e in vivo.

Introduction

CRISPR-Cas9 que significa “agrupada regularmente interespaçada proteína palindômica associada a repetições 9” foi descoberta pela primeira vez como parte de estudos sobre imunidade adaptativa bacteriana1,2. Hoje, o CRISPR/Cas9 tornou-se a ferramenta mais reconhecida para edição de genes programáveis e diferentes iterações do sistema foram desenvolvidas para permitir modulações transcricionais e epigenéticas3. Esta tecnologia permite a manipulação genética altamente precisa de quase qualquer sequência de DNA4.

Os componentes essenciais de qualquer edição de genes CRISPR são uma sequência de RNA guia personalizável e a nuclease Cas95. O guia RNA se liga à sequência alvo-complementar no DNA, direcionando a nuclease Cas9 para realizar uma quebra de dois fios em um ponto específico no genoma3,4. O local de decote resultante é então reparado por nhej (nhej) ou reparo direcionado por esmologia (HDR), com a consequente introdução de alterações na sequência de DNA direcionada5.

A edição de genes baseada em CRISPR/Cas9 é fácil de usar e relativamente barata em comparação com técnicas anteriores de edição de genes e tem sido comprovadamente eficiente e robusta em uma multiplicidade de sistemas2,4,5. No entanto, o sistema apresenta algumas limitações. A expressão constitutiva de Cas9 tem sido frequentemente demonstrada como resultado de um aumento do número de fora dos alvos e alta toxicidade celular4,6,7,8. Além disso, o direcionamento constitutivo de genes essenciais e de sobrevivência celular por Cas9 tira sua capacidade de realizar certos tipos de estudos funcionais, como estudos cinéticos de morte celular7.

Diferentes ferramentas CRISPR-Cas9 controladas condicionalmente ou controladas condicionalmente foram desenvolvidas para resolver essas questões6, como Tet-ON e Tet-Off9; recombinação específica do local10; proximidade quimicamente induzida11; emenda dependente da inteínia3; e 4-Receptor de Estrogênio baseado em Hidroxitamoxifen (ER) sistemas de localização nuclear12. Em geral, a maioria desses procedimentos (splicing de intein e sistemas de divisão de proximidade quimicamente induzidos) não oferecem controle reversível, apresentam uma resposta cinética muito lenta ao tratamento medicamentoso (sistema Tet-On/Off), ou não são favoráveis à manipulação de alta produtividade6.

Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um novo kit de ferramentas que não só fornece edição de genes controlados temporais e rápidos, mas também garante rastreabilidade, sintonia e comodidade à manipulação de genes de alto throughput. Esta nova tecnologia pode ser usada em linhas celulares, organoides e modelos animais. Nosso sistema é baseado em um domínio projetado, quando fundido ao Cas9, induz sua rápida degradação. No entanto, pode ser rapidamente estabilizado com uma molécula pequena altamente seletiva, não tóxica e permeável celular. Mais especificamente, projetamos o mutante FKBP12 humano “domínio desestabilizador” (DD) para Cas9, marcando Cas9 para degradação rápida e constitutiva através do sistema ubiquitin-proteasome quando expresso em células mamíferas13. O ligante sintético DD, Shield-1 pode estabilizar a conformação DD, evitando assim a degradação de proteínas fundidas ao DD (como Cas9) de forma muito eficiente, e com uma resposta cinética rápida14,15. Note-se que o Shield-1 liga-se com três ordens de magnitude mais apertadas ao mutante FKBP12 do que à sua contraparte do tipo selvagem14.

O par DD-Cas9/Shield-1 pode ser usado para estudar a identificação sistemática e caracterização de genes essenciais em células cultivadas e modelos animais, como mostramos anteriormente mirando o gene CypD, que desempenha um papel importante no metabolismo das mitocôndrias; EGFR, um player-chave na transformação oncogênica; e Tp53, um gene central na resposta a danos de DNA. Além da edição de genes temporal e condicionalmente controlada, outra vantagem do método é que a estabilização do DD-Cas9 é independente de sua transcrição. Esse recurso permite a co-expressão, sob o mesmo promotor, de marcadores rastreáveis, bem como recombinases, como a recombinase dependente do receptor de estrogênio, CREER. Neste trabalho, mostramos como nosso método pode ser usado com sucesso in vitro, para atingir condicionalmente, por exemplo, o gene de replicação de DNA, RPA3.

Protocol

1.O vetor DD-Cas9 Obtenha vetor DD-Cas9 de Addgene (DD-Cas9 com sequência de enchimento e Vênus (EDCPV), Plasmid 90085).NOTA: Este é um plasmídeo lentiviral DD-Cas9 com um promotor U6 que conduz a transcrição do RNA de guia único (sgRNA), enquanto o promotor do EFS conduz a transcrição DD-Cas9. A sequência DYKDDDDK (sinalização) está presente no terminal C de Cas9, seguida por 2A peptídeo auto-cleaving (P2A) que separa DD-Cas9 e proteína fluorescente modificada Vênus (mVenus). <p c…

Representative Results

Para permitir a expressão condicional do Cas9, desenvolvemos uma construção vetorial lentiviral dupla composta por um promotor orientado pelo U6 para expressar constitutivamente o sgRNA, e um promotor central EF-1α para conduzir a expressão da proteína de fusão DD-Cas9(Figura 1A)19. Como paradigma para ilustrar a robustez e eficiência do sistema, transduzímos a linha celular carcinomatosa pulmonar A549 com a construção lenti…

Discussion

A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a capacidade de interrogar funcionalmente genomas2. No entanto, a inativação de genes muitas vezes resulta em letalidade celular, déficits funcionais e defeitos de desenvolvimento, limitando a utilidade de tais abordagens para o estudo das funções genéticas7. Além disso, a expressão constitutiva do Cas9 pode resultar em toxicidade e na geração de efeitos fora do alvo6. Diferentes abordagens foram desenv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos membros anteriores do nosso laboratório e cientista Serif Senturk pelo trabalho anterior. Agradecemos a Danilo Segovia pela leitura crítica deste manuscrito. Este estudo foi possível e apoiado pela Swim Across America e pelo programa National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center.

Materials

100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).

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Cite This Article
Šafarič Tepeš, P., Sordella, R. A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization. J. Vis. Exp. (175), e60685, doi:10.3791/60685 (2021).

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