Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Une nouvelle boîte à outils pour évaluer les fonctions des gènes à l’aide de la stabilisation cas9 conditionnelle

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/60685
Automatic Translation
1,2, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Nous décrivons ici un outil d’édition du génome basé sur la stabilisation temporelle et conditionnelle de la protéine 9 (Cas9) associée à la répétition palindromique courte (CRISPR-) groupée régulièrement espacée sous la petite molécule Shield-1. La méthode peut être utilisée pour des cellules cultivées et des modèles animaux.

Abstract

La technologie CRISPR/Cas9 (CRISPR/Cas9) associée à la répétition palindromique courte et régulièrement intercalée en grappes est devenue un outil de laboratoire répandu pour introduire des modifications précises et ciblées dans le génome. Son énorme popularité et sa propagation rapide sont attribuées à sa facilité d’utilisation et à sa précision par rapport à ses prédécesseurs. Pourtant, l’activation constitutive du système a des applications limitées. Dans cet article, nous décrivons une nouvelle méthode qui permet un contrôle temporel de l’activité CRISPR/Cas9 basé sur la stabilisation conditionnelle de la protéine Cas9. La fusion d’un mutant artificiel de la protéine de liaison à la rapamycine FKBP12 en Cas9 (DD-Cas9) permet la dégradation rapide de Cas9 qui à son tour peut être stabilisée par la présence d’un ligand synthétique FKBP12 (Shield-1). Contrairement à d’autres méthodes inductibles, ce système peut être facilement adapté pour générer des systèmes bi-cistroniques afin de co-exprimer DD-Cas9 avec un autre gène d’intérêt, sans régulation conditionnelle du second gène. Cette méthode permet la génération de systèmes traçables ainsi que la manipulation parallèle et indépendante d’allèles ciblés par la nucléase Cas9. La plate-forme de cette méthode peut être utilisée pour l’identification et la caractérisation systématiques de gènes essentiels et l’interrogation des interactions fonctionnelles des gènes in vitro et in vivo.

Introduction

CRISPR-Cas9 qui signifie «clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9» a été découvert pour la première fois dans le cadre d’études sur l’immunité adaptative bactérienne1,2. Aujourd’hui, CRISPR/Cas9 est devenu l’outil le plus reconnu pour l’édition programmable de gènes et différentes itérations du système ont été développées pour permettre des modulations transcriptionnelles et épigénétiques3. Cette technologie permet la manipulation génétique très précise de presque toutes les séquences d’ADN4.

Les composants essentiels de toute édition de gène CRISPR sont une séquence d’ARN guide personnalisable et la nucléase Cas95. Le guide de l’ARN se lie à la séquence cible-complémentaire dans l’ADN, dirigeant la nucléase Cas9 pour effectuer une rupture double brin à un point spécifique du génome3,4. Le site de clivage résultant est ensuite réparé par jonction finale non homologue (NHEJ) ou réparation dirigée par homologie (HDR), avec l’introduction conséquente de changements dans la séquence d’ADN ciblée5.

L’édition de gènes basée sur CRISPR / Cas9 est facile à utiliser et relativement peu coûteuse par rapport aux techniques d’édition de gènes précédentes et il a été prouvé qu’elle était à la fois efficace et robuste dans une multiplicité de systèmes2,4,5. Pourtant, le système présente certaines limites. Il a souvent été démontré que l’expression constitutive de Cas9 entraîne une augmentation du nombre de hors-cibles et une toxicité cellulaire élevée4,6,7,8. De plus, le ciblage constitutif des gènes essentiels et de survie cellulaire par Cas9 enlève de sa capacité à effectuer certains types d’études fonctionnelles telles que les études cinétiques de la mort cellulaire7.

Différents outils CRISPR-Cas9 inductibles ou contrôlés conditionnellement ont été développés pour résoudre ces problèmes6,tels que Tet-ON et Tet-Off9; recombinaison spécifique au site10; proximité induite chimiquement11; épissage dépendant de l’intein3; et les systèmes de localisation nucléaire à base de récepteurs d’œstrogènes (ER) à base de 4-hydroxytamoxifènes12. En général, la plupart de ces procédures (épissage des intégrines et systèmes de séparation de proximité induits chimiquement) n’offrent pas de contrôle réversible, présentent une réponse cinétique très lente au traitement médicamenteux (système Tet-On/Off) ou ne se prêtent pas à une manipulation à haut débit6.

Pour remédier à ces limitations, nous avons développé une nouvelle boîte à outils qui fournit non seulement une édition de gènes rapide et robuste contrôlée dans le temps, mais assure également la traçabilité, l’accordabilité et l’adaptabilité à la manipulation de gènes à haut débit. Cette nouvelle technologie peut être utilisée dans les lignées cellulaires, les organoïdes et les modèles animaux. Notre système est basé sur un domaine d’ingénierie, lorsqu’il est fusionné à Cas9, il induit sa dégradation rapide. Cependant, il peut être rapidement stabilisé avec une petite molécule hautement sélective, non toxique et perméable aux cellules. Plus précisément, nous avons conçu le mutant humain FKBP12 « domaine déstabilisant » (DD) à Cas9, marquant Cas9 pour une dégradation rapide et constitutive via le système ubiquitine-protéasome lorsqu’il est exprimé dans des cellules de mammifères13. Le ligand synthétique DD, Shield-1 peut stabiliser la conformation DD, empêchant ainsi la dégradation des protéines fusionnées en DD (telles que Cas9) de manière très efficace, et avec une réponse cinétique rapide14,15. Il est à noter que Shield-1 se lie avec trois ordres de grandeur plus étroitement au mutant FKBP12 qu’à son homologue de type sauvage14.

La paire DD-Cas9/Shield-1 peut être utilisée pour étudier l’identification et la caractérisation systématiques des gènes essentiels dans les cellules cultivées et les modèles animaux, comme nous l’avons montré précédemment en ciblant conditionnellement le gène CypD, qui joue un rôle important dans le métabolisme des mitochondries; EGFR, acteur clé de la transformation oncogénique ; et Tp53, un gène central dans la réponse aux dommages à l’ADN. En plus de l’édition de gènes contrôlée temporellement et conditionnellement, un autre avantage de la méthode est que la stabilisation de DD-Cas9 est indépendante de sa transcription. Cette caractéristique permet la co-expression, sous le même promoteur, de marqueurs traçables ainsi que de recombinases, telles que la recombinase dépendante des récepteurs d’œstrogènes, CREER. Dans ce travail, nous montrons comment notre méthode peut être utilisée avec succès in vitro, pour cibler conditionnellement par exemple, le gène de réplication de l’ADN, RPA3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.Le vecteur DD-Cas9

  1. Obtenir le vecteur DD-Cas9 à partir d’Addgene (DD-Cas9 avec séquence de remplissage et Vénus (EDCPV), Plasmide 90085).
    REMARQUE: Il s’agit d’un plasmide lentiviral DD-Cas9 avec un promoteur U6 qui pilote la transcription de l’ARN guide unique (sgRNA) tandis que le promoteur EFS pilote la transcription DD-Cas9. La séquence DYKDDDDK (flag-tag) est présente au terminal C de Cas9 suivie du peptide auto-clivant 2A (P2A) qui sépare DD-Cas9 et la protéine fluorescente modifiée Venus (mVenus).

2. Conception d’un petit ARN guide (SGRNA)

  1. Concevez un petit ARN guide (sgRNA) qui sera cloné dans le vecteur DD-Cas9 en utilisant l’un des nombreux algorithmes, ciblant une région génomique spécifique.
    REMARQUE: Pour réduire les effets hors cible, sélectionnez les séquences d’ARNg avec le score le plus élevé en utilisant le site Web: http://crispr.mit.edu.
  2. Concevoir et ordonner deux oligonucléotides par séquence d’ARNg pour obtenir un ARNg complet.
    REMARQUE: Puisque le plasmide sera digéré par l’enzyme BsmBI, concevez l’oligonucléotide avant et l’oligonucléotide inverse en ajoutant des surplombs de digestion BsmBI à la séquence d’ARNg. Utilisez le modèle du tableau 1.

3. Clonage de l’ARNg dans le vecteur lentiviral DD-Cas9

  1. Déphosphorylater les 5′ extrémités du plasmide DD-Cas9 en utilisant la phosphatase alcaline (FastAP) dans une réaction de digestion enzymatique de restriction.
    REMARQUE: Les vecteurs peuvent se re-circulariser pendant la ligature, en particulier lorsqu’ils sont linéarisés par une seule enzyme de restriction. Pour s’assurer que le vecteur ne se re-circularise pas, dé-phosphoryler le plasmide en ajoutant de la phosphatase directement dans la réaction de digestion.
    1. Déphosphorylater et digérer le plasmide avec l’enzyme BsmBI en préparant un mélange de 5 μg de plasmide DD-Cas9, 6 μL de tampon de digestion (10x), 0,6 μL de DTT (100 mM), 3 μL de BsmBI, 3 μL de FastAP, ajouter jusqu’à 60 μL d’eau sans nucléase pour faire 60 μL le volume total de réaction.
      REMARQUE: Ajouter l’enzyme BsmBI et FastAP au mélange à la fin.
    2. Incuber le mélange pendant 30 min à 37 °C bloc thermique ou thermocycleur.
  2. Purifier le plasmide DD-Cas9 digéré.
    1. Préparez un gel d’agarose à 0,8% d’ADN pour éliminer le plasmide incomplètement digéré et les traces d’enzymes. Utilisez un peigne de gel plus large pour une meilleure séparation et faites fonctionner le gel à 90 V.
    2. Visualisez les bandes sous une lumière UV de 360 à 365 nm et coupez la plus grande bande plasmidique du gel. Jetez le fragment de 2 ko qui correspond à la charge.
    3. Purifiez la grande bande de gel coupée à l’aide d’un kit de purification de gel commercial et suivez les instructions du fabricant.
  3. Oligos recuits ligaturés avec du plasmide DD-Cas9 digéré.
    1. Phosphoryler et recuit les oligos de l’ARNg.
      1. Préparer le mélange de 1 μL de tampon de ligature T4 (10x), 1 μL d’Oligo 1 (100 μM), 1 μL d’Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL d’eau sans nucléase. Enfin, ajouter 0,5 μL de T4 PNK. Le volume total de cette réaction est de 10 μL.
      2. Ajouter le mélange réactionnel au thermocycleur dans les conditions suivantes : 37 °C pendant 30 min, 95 °C pendant 5 min, puis descendre à 25 °C avec une vitesse de 5 °C/min.
        REMARQUE: Le PNK doit être inactivé par la chaleur avant que les oligonucléotides ne soient mis dans la ligature, sinon le PNK phosphorylera le vecteur. L’étape de phosphorylation et l’étape de recuit sont effectuées ensemble dans un thermocycleur. L’étape de phosphorylation où le phosphate 5' est ajouté aux oligonucléotides de l’ARNg est nécessaire pour que la ligature se produise.
    2. Ligate DD-Cas9 digéré plasmide et oligos sgRNA.
      1. Diluer les oligos recuits à 1:200 dans de l’eau sans nucléase et utiliser 50 ng d’ADN plasmidique dans la réaction de ligature.
        REMARQUE: Utilisez le rapport molaire du vecteur 6 insert: 1, pour favoriser l’intégration de l’insert ou utilisez un calculateur de ligature pour calculer le rapport molaire: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Préparer le mélange de réaction de ligature : 50 ng de vecteur DD-Cas9 digéré et purifié, volume approprié d’oligos recuits dilués, 1 μL de tampon de ligature T4 (10x), 1 μL d’ADN ligase T4, jusqu’à 10 μL d’eau sans nucléase pour obtenir le volume total de la réaction 10 μL.
      3. Si vous utilisez de la ligase « à haute concentration », incuber la réaction à température ambiante pendant 5 min. Sinon, incuber à température ambiante pendant 2 h, ou pour obtenir un rendement de ligature plus élevé, incuber à 16 °C pendant la nuit.
        REMARQUE: Inactivez la chaleur si vous utilisez la ligase d’ADN T4 standard à 65 ° C pendant 20 minutes. Ne pas inactiver la chaleur si vous utilisez des mélanges maîtres de ligase.

4. Transformation bactérienne

  1. Préchauffer les plaques de gélose LB-ampicilline de 10 cm à température ambiante.
  2. Décongeler 50 μL de cellules bactériennes compétentes « One shot Stbl3 » sur la glace.
  3. Ajouter 2-3 μL de mélange de ligature à 50 μL de cellules bactériennes compétentes et mélanger doucement en effleurant le fond du tube avec un doigt 4 fois. Incuber sur de la glace pendant 30 min.
  4. Choquez thermiquement les cellules à exactement 42 °C pendant 40 secondes, à l’aide d’une minuterie. Refroidir les cellules bactériennes sur de la glace pendant 5 min.
  5. Ajouter 500 μL de SOC sans antibiotique aux cellules bactériennes et les faire pousser dans l’incubateur à agitation à 250 tr/min pendant 45 min, à 37 °C.
  6. Étaler 100 μL de bactéries transformées sur des plaques de LB-ampicilline préchauffées et incuber pendant la nuit à 37 °C.

5. Mini/maxi-préparation de plasmide ligaturé

  1. Préparez une culture de démarrage maxi/mini-prep.
    1. Le lendemain, choisissez un seul clone bactérien et inoculez une culture de démarrage avec 8 mL de milieu LB contenant de l’ampicilline.
    2. Cultiver les bactéries dans l’incubateur à agitation à 250 tr / min, 37 ° C pendant 10-12 h.
    3. Utilisez 3 à 5 mL de bactéries pour la mini-préparation ou utilisez-la comme culture de démarrage pour la maxi-préparation. Utilisez le reste de la bactérie comme stock de glycérol bactérien en ajoutant 100% de glycérol dans le rapport de culture bactérienne: le glycérol est de 1: 1.
      REMARQUE: Ici, nous allons décrire la procédure de mini-préparation.
  2. Mini-procédure de préparation
    1. Récolter 3 à 5 mL de cellules bactériennes et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min.
    2. Resuspendez la pastille de cellules bactériennes avec 200 μL de tampon P1, contenant de la RNase A et stockée à 4 °C.
    3. Ajouter 200 μL de tampon P2 et mélanger doucement en inversant le tube 10 fois jusqu’à ce que le liquide se clarifie.
    4. Ajouter 300 μL de tampon P3 et mélanger en inversant le tube 10 fois. Le liquide deviendra trouble. Procéder immédiatement à la centrifugation des échantillons à 12 000 x g pendant 10 min.
    5. Transférer le surnageant clair dans la colonne de spin et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min.
      Jetez le flux.
      REMARQUE: Assurez-vous que le surnageant est clarifié. Les particules peuvent obstruer la colonne de spin et réduire l’efficacité de la colonne.
    6. Ajouter 400 μL de tampon et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux.
    7. Ajouter 600 μL de tampon PW pour laver la colonne de spin et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux.
    8. Centrifuger à nouveau la colonne de rotation à la vitesse maximale pendant 3 min pour éliminer les résidus tampons. Jetez le flux et laissez-le reposer pendant 2 min.
    9. Placez la colonne de spin dans un tube frais et ajoutez 50 μL de tampon d’élution. Incuber pendant 5 min et centrifuger à vitesse maximale pendant 2 min.
    10. Utilisez le dispositif nanodrop pour mesurer la concentration de plasmide DD-Cas9 purifié avec l’insert sgRNA (ng/μL).
  3. Valider le clonage de l’ARNs par séquençage de l’ADN du plasmide DD-Cas9. Utilisez la séquence d’amorces U6 du tableau 2.

6. Préparation lentivirale

  1. Préparer les cellules d’emballage HEK293T pour la transfection.
    1. Utilisez du HEK293T sain jusqu’au passage 10 et ensemencez-les uniformément à une densité de 1-2 x 106 cellules par plaque de culture tissulaire de 10 cm. Utilisez 10 mL de glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) filtré. Incuber des cellules dans l’incubateur de culture tissulaire, à 5% de CO2 et 37 °C pendant 20 h.
    2. Le lendemain, confirmez que les cellules ont atteint 70% de confluence par microscopie à fond clair et qu’elles sont uniformément dispersées sur la plaque. Changer le milieu en cellules 1 h avant la transfection avec le volume final de 10 mL.
      REMARQUE: Les médias doivent être absents des antibiotiques et des antimycotiques.
    3. Préparer le mélange de 2 tubes avec 500 μL de milieu chaud (p. ex. OptiMEM).
      1. Ajouter 25 μL de réactif de transfection dans le tube 1 contenant 500 μL de milieu chaud et incuber à température ambiante pendant 5 min.
      2. Pendant ce temps, préparez un mélange de plasmides dans le tube 2 contenant 3,5 μg de DD-Cas9 contenant de l’ARNg cloné, 6 μg du plasmide d’emballage (psPAX2) et 3 μg du plasmide d’enveloppe (pMD2.G) dans un milieu chaud de 500 μL.
      3. Mélanger le tube 1 avec le tube 2 pour former un mélange de transfection et incuber à température ambiante pendant 20 min.
      4. Goutte à goutte le mélange de transfection vers les cellules HEK293T et la plaque d’incubation dans l’incubateur de culture tissulaire, à 5% de CO2 et 37 °C pendant la nuit.
      5. Après 18 h, changer soigneusement le support à 10 mL de DMEM frais avec 10% de FBS pour retirer le réactif de transfection. Incuber pendant les 48 heures suivantes.
      6. Après 48 h, prélever le surnageant avec une seringue de 10 mL et le faire passer à travers un filtre de 0,45 μm.
      7. Aliquote et conserver le surnageant du virus à -80 °C.

7. Détermination du titre du virus et de l’efficacité de la transduction avec la cytométrie en flux

  1. Ensemencez les cellules HEK293T avec 5 x 105 cellules/ puits dans une plaque de 6 puits. Ensemencez les cellules dans deux plaques de 6 puits. Utilisez une assiette pour compter le lendemain.
  2. Incuber les plaques dans l’incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité, 5 % de CO2 pendant la nuit pour atteindre 50-60 % de confluence le lendemain.
  3. Le lendemain, utilisez l’une des plaques de 6 puits pour compter les cellules dans 6 puits.
  4. Décongeler l’aliquote virale qui sera utilisée pour effectuer la dilution en série et ajouter 8 μg/mL de réactif polybrène.
  5. Préparer le DMEM avec 10 % de FBS pour la dilution en série du virus et ajouter 8 μg/mL de réactif polybrène.
  6. Préparer 2 mL de dilutions série décuplées du lentivirus de 1 x 10-1 à 1 x 10-4 dans un milieu contenant du polybrene.
  7. Retirer le milieu de la plaque de 6 puits et ajouter 1 mL de dilutions virales aux puits. Laissez un puits avec un média seul comme contrôle négatif et un puits avec 100% de virus.
  8. Incuber les cellules avec le virus dans l’incubateur pendant 24 heures.
  9. Le lendemain, retirez le support avec le virus des plaques de 6 puits et remplacez-le par 2 mL de DMEM frais avec 10% de FBS. Incuber des cellules pendant 48-72 h. Observez la GFP à l’aide d’un microscope fluorescent tous les jours.
  10. Après 48-72 h, détachez les cellules et ressuspendez-les dans un tampon MACS.
  11. Utilisez un cytomètre en flux pour déterminer le pourcentage d’expression de GFP.
  12. Calculer le titre du virus à l’aide de la formule suivante : TU/mL = (Nombre de cellules transduisons x Pourcentage de fluorescence x Facteur de dilution)/(Volume de transduction en mL)

8. Transduction lentivirale des cellules cibles

  1. Plaquez la lignée cellulaire d’intérêt sur une plaque de 10 cm et incubez pendant la nuit pour atteindre une confluence de 50 à 60% le lendemain.
    REMARQUE: Nous avons utilisé la lignée cellulaire A549 exprimant DD-Cas9 et deux sgRNA indépendants du gène RPA3. Nous avons également utilisé le vecteur d’expression de la lignée cellulaire A549 avec contrôle Renilla. Nous avons ensemencé ces cellules à la densité de 2 x 103cellules/cm2 et les avons incubées à 37 °C, 95 % d’humidité, 5 % de CO2 pendant la nuit pour atteindre 50-60 % de confluence le lendemain. Nous avons utilisé des supports RPMI avec 10% de FBS filtrés. Nous avons procédé aux étapes suivantes :
  2. Le lendemain, infecter les cellules avec 500-2000 μL de particules virales dans un volume total de 10 mL de milieu de culture. Incuber des milieux viraux pendant 24 h.
  3. Le lendemain, changez le milieu viral en milieu de culture et déterminez le pourcentage de cellules GFP positives en utilisant la cytométrie en flux.
  4. Sélectionnez les cellules GFP positives par tri des cellules FACS ou en utilisant la sélection de bléomycine.
  5. Développez les cellules sélectionnées positivement et congelez un stock.

9. Induction conditionnelle de l’édition de gènes médiée par Cas9

  1. Plaquez les cellules sélectionnées positivement 24 heures après l’infection ainsi que les cellules non transduisons dans la plaque de 12 puits séparément. Attendez que les cellules se fixent et changent le milieu en milieu de culture cellulaire contenant 200 nM de Shield-1. Remplacez le milieu dans les plaques par des cellules transduies et non transduites, en laissant 2 puits par plaque avec des milieux réguliers comme témoin négatif.
  2. Incuber et extraire des protéines de chaque puits à différents moments temporels : temps 0, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h et 72 h après avoir ajouté le Shield-1 aux puits.
  3. Ensuite, retirez le média avec Shield-1 du reste des puits et remplacez-le par un milieu cellulaire ordinaire.
  4. Recueillir les protéines de ces puits 2 h, 6 h et 12 h après avoir changé le milieu.
  5. Visualiser par analyse par transfert de Western la réversibilité et la rapidité de la régulation déstabilisée de la protéine DD-Cas9 après l’ajout et le retrait de son ligand, Shield-1. Utilisez un anticorps dirigé vers DYKDDDDK Tag pour visualiser les protéines et un anticorps de contrôle ciblant par exemple la bêta-tubuline.
  6. Déterminer la dose optimale de Shield-1 par la courbe dose-réponse observée par l’analyse Western Blot.

10. Validation de l’édition de gènes

REMARQUE: Les tests d’expression GFP, tels que l’analyse de cytométrie en flux et le marqueur de sélection de la bléomycine, ne confirment que l’administration réussie du réactif CRISPR, mais ils ne déterminent pas si la séquence souhaitée a été ciblée avec succès. Les tests les plus courants pour confirmer le ciblage réussi des gènes par l’expérience CRISPR sont le séquençage de l’ADN de Sanger, le séquençage de nouvelle génération, le test Surveyor Nuclease, le test TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) ou l’analyse par transfert western16,17,18.

  1. Plaquez les cellules sélectionnées positivement et changez le média à 200 nM de milieu contenant shield-1. Incuber les cellules pendant 5 jours, en changeant de support avec Shield-1 tous les 3 jours.
  2. Utilisez les techniques de validation mentionnées ci-dessus 5 jours après l’induction DD-Cas9 par Shield-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pour permettre l’expression conditionnelle de Cas9, nous avons développé une construction de vecteur lentiviral dual composée d’un promoteur piloté par U6 pour exprimer constitutivement l’ARNg, et d’un promoteur de noyau EF-1α pour conduire l’expression de la protéine de fusion DD-Cas9(Figure 1A)19. Comme paradigme pour illustrer la robustesse et l’efficacité du système, nous avons transduint la lignée cellulaire A549 carcinomateuse pulmonaire avec la construction lentivirale. Les niveaux de Cas9 en présence ou en l’absence du ligand Shield-1 ont été mesurés par réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase (RT-PCR) et analyse par transfert Western à l’aide d’un anticorps spécifique anti-Flag. Nous avons utilisé des cellules non infectées et des cellules infectées par des simulacres (le véhicule) comme témoins. Les cellules ont été traitées avec une concentration de Shield-1 allant de 10 à 1000 nM pour 7 j. Comme montré, le traitement avec Shield-1 a pu réguler l’expression de DD-Cas9 d’une manière fortement dose-dépendante(Figure 1B et Figure 2A). L’analyse RT-PCR avec des amorces spécifiques pour DD-Cas9 et des amorces de contrôle pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a confirmé que les niveaux d’expression de l’ARNm de DD-Cas9 étaient similaires parmi les cellules transduquées et le véhicule malgré la présence ou l’absence de Shield-1(Figure 2B). Cela confirme que l’induction de la protéine Cas9 est un événement post-transcriptionnel.

Ce système permet une stabilisation rapide et réversible de la protéine DD-Cas9. La figure 3 montre une induction suffisante de l’expression de Cas9 dans la lignée cellulaire A549 transduite 2 h après le traitement avec 200 nM de Shield-1 par rapport aux cellules A549 non infectées. Cependant, le retrait de Shield-1 entraîne une diminution rapide de la protéine DD-Cas9, qui devient négligeable en 6 à 12 h(Figure 3).

La protéine RPA3 est un composant de l’hétérotrimère de la protéine de réplication humaine A (RPA). Il s’agit d’un complexe de liaison à l’ADN simple brin qui joue un rôle important dans la réplication, la recombinaison et la réparation de l’ADN. Pour valider l’utilisation du système pour étudier les gènes essentiels, nous avons ciblé le gène RPA3. À cette fin, nous avons utilisé deux ARN à guide unique indépendants spécifiques au locus (guides 25 et 44) ainsi que Renilla comme témoin (guide 208). Les cellules A549 transduies avec la construction lentiviralE DD-Cas9 ont été traitées avec 200 nM de Shield-1 pour 3 d. Une diminution du nombre de cellules dans les cellules A549 transduies traitées par Shield-1 contenant l’ARN guide RPA3 était apparente après 48 h de traitement, et aucun effet n’a été observé sur le nombre de cellules dans l’échantillon de Renilla (Figure 4A). Pour valider l’épuisement de la protéine RPA3, nous avons effectué une analyse immunoblotting à l’aide d’un anticorps contre RPA3 3 d après induction de Sheild-1(Figure 4B). De plus, nous avons confirmé l’inversion de l’édition de gènes ou les mutations d’indel à l’aide des tests de nucléase Surveyor et du séquençage de l’ADN(Figure 4C).

La construction vectorielle lentivirale que nous avons conçue présente une caractéristique unique : la régulation de la stabilité de la protéine DD-Cas9 est indépendante de son expression de l’ARNm. Cela permet à la génération de systèmes bicistroniques d’exprimer un autre gène d’intérêt sous le même promoteur EF-1a sans être modulé par le DD-Cas9 déstabilisé(Figure 5A,5B). Nous avons également ajouté un peptide auto-clivant (P2A) 2A entre DD-Cas9 et mVenus, une protéine fluorescente modifiée qui peut être utilisée pour tracer les cellules infectées (Figure 5A). Comme mVenus est placé après P2A, comme le montrent les résultats de l’analyse Western Blot à la figure 5B,l’expression de la protéine mVenus a été observée dans le véhicule et les cellules transduies A549 indépendamment de l’expression DD-Cas9 et du traitement Shield-1.

Figure 1
Figure 1: Schéma de la construction lentivirale et des différents outils d’édition de gènes. A) L’épine dorsale lentivirale DD-Cas9 contient un promoteur U6, sgRNA, promoteur EF-1a, DD, spCas9, nucléoplasmine NLS et Flag-tag. B) Comparaison entre le système DD-Cas9 (panneau de gauche) et les différents systèmes Tet-On (panneau de droite) utilisés comme outils d’édition de gènes. Lad-ladder, cellules NI-non infectées, Veh-vehicle, -Sh cellules traitées sans Shield-1, + cellules Sh traitées avec 200 nM Shield, - cellules Doxy sans traitement à la doxycycline, + cellules Doxy traitées à la doxycycline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Résultats représentatifs de la stabilisation DD-Cas9 dose-dépendante par Shield-1. A) Analyse Western Blot à l’aide d’un anticorps anti-Flag-tag de l’expression stabilisée de DD-Cas9 dans des cellules traitées avec des concentrations croissantes de Shield-1. Comme témoin, les cellules non infectées (NI) et les cellules simulées (Veh) ont été utilisées. La protéine de fusion DD-Cas9 était indétectable chez les deux témoins. B) Les résultats de la RT-PCR des niveaux d’expression de l’ARNm de DD-Cas9 dans les cellules transduies en l’absence ou les traitements dose-dépendants de Shield-1 étaient similaires parmi les cellules transduisons et les véhicules, en utilisant des amorces GAPDH comme contrôle interne. Ce chiffre a été modifié à partir de Serif et al19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: L’analyse Western Blot illustre la réversibilité et la rapidité de la régulation déstabilisée de la protéine DD-Cas9 après le retrait de son ligand Shield-1. La lignée cellulaire A549 transduite avec DD-Cas9 et A549 non infectée comme témoin a été traitée 24 heures après l’infection par 200 nM de ligand Shield-1 pour les points de temps indiqués. Le niveau de protéines de DD-Cas9 dans les cellules témoins simulées était indétectable. Ce chiffre a été modifié à partir de Serif et al19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Le système DD-Cas9 peut induire une édition génétique robuste dans des contextes « in vitro » et « in vivo ». A) La lignée cellulaire A549 transduite avec un vecteur exprimant l’ARNg pour le gène RPA3 et le DD-Cas9 (RPA3). Comme témoin A549 transduite avec un vecteur exprimant l’ARNs sg pour Renilla (Ren) a été utilisé. Les cellules ont été traitées avec Shield-1 (200 nM) pendant 3 jours, ce qui a entraîné une diminution rapide de la viabilité cellulaire dans les cellules exprimant l’ARNs sgPA3, sans effet sur le nombre de cellules dans l’échantillon témoin Renilla. L’efficacité de l’édition du gène RPA3 dans la lignée cellulaire A549 a été validée par L’analyse B) Western Blot en utilisant l’anticorps contre Flag-tag dans RPA3 A549 et Renilla A549 en présence et en l’absence de traitement Shield-1 (200 nM) de 3 jours et C) par le test de nucléase SURVEYOR. Les flèches du panneau C) montrent les fragments du test de nucléase SURVEYOR. Ce chiffre a été modifié à partir de Serif et al19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Schéma d’une construction lentivirale bicistronique DD-Cas9 pour piloter l’expression de mVenus indépendamment de DD-Cas9. A)La construction se compose du promoteur U6, de l’ARNg, du promoteur EF-1a, du DD-Cas9, du P2A et du mVenus. B)Les cellules A549 transduies avec un plasmide lentiviral contenant DD-Cas9, P2A et mVenus ont été traitées avec le ligand Shield-1 de 50 mM pendant 3 jours. Le troisième jour, l’analyse par transfert western a été effectuée avec du lysate cellulaire, en utilisant séparément l’anticorps contre le GFP et le Flag-tag. La figure 5B a été modifiée à partir de Serif et al19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En avant (Oligo 1) 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
Inverse (Oligo 2) 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'

Tableau 1 :Conception de l’oligonucléotide de l’ARNg avant et arrière. L’oligonucléotide avant (Oligo 1) et l’oligonucléotide inverse (Oligo 2) sont conçus en ajoutant que la digestion enzymatique BsmBI surplombe votre séquence d’ARNg. « N » désigne les différents nucléotides présents dans votre séquence d’ARNg, les autres sont des surplombs pour la digestion du BsmBI.

Séquence d’amorce U6 5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'

Tableau 2 : Séquence du promoteur U6 pour la validation du clonage de l’ARNs sg. Pour valider le succès du clonage de l’ARNs sg, utilisez la séquence promotrice U6 pour le séquençage de l’ADN du plasmide DD-Cas9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La technologie CRISPR/Cas9 a révolutionné la capacité d’interroger fonctionnellement les génomes2. Cependant, l’inactivation des gènes entraîne souvent une létalité cellulaire, des déficits fonctionnels et des défauts de développement, ce qui limite l’utilité de telles approches pour l’étude des fonctions des gènes7. De plus, l’expression constitutive de Cas9 peut entraîner une toxicité et la génération d’effets hors cible6. Différentes approches ont été développées pour contrôler temporellement les technologies d’édition du génome basées sur CRISPR-Cas96. Ces systèmes sont basés soit sur le contrôle transcriptionnel de Cas9 et/ou d’ARNs sg, soit sur l’activation post-transcriptionnelle et post-traductionnelle cas921,22,23. Comme alternative à ces systèmes, nous avons développé une nouvelle boîte à outils basée sur la déstabilisation conditionnelle de Cas9.

L’étape critique de ce protocole est la conception d’au moins deux ou trois ARNg pour un gène spécifique afin d’éviter les effets hors cible et de faciliter l’édition efficace des gènes. Une étape de limitation de débit est une transformation efficace de la lignée cellulaire avec le vecteur DD-Cas9. La qualité des particules de lentivirus (titres élevés) repose sur les cellules HEK-293T. Il est crucial d’utiliser un faible nombre de passage (jusqu’au passage 10) des cellules HEK-293T qui ont été correctement entretenues (divisées lorsqu’elles atteignaient 70% de confluence, généralement deux fois par semaine dans un rapport de 1: 6). Comme alternative, la lignée cellulaire HEK-293 Lenti-X, qui a été sélectionnée clonalement pour produire 30× titres viraux plus élevés que les cellules HEK-293T ordinaires, peut être utilisée24. Une autre étape cruciale est l’optimisation du rapport entre le plasmide DD-Cas9, le plasmide d’emballage psPAX2 et le plasmide d’enveloppe pMD2.G. D’après notre expérience, le volume dans lequel le mélange de transfection avec la lipofectamine est préparé, ainsi que le rapport plasmidique, ont un effet substantiel sur l’efficacité de la transfection. Nous vous recommandons de suivre les étapes de notre protocole pour obtenir les meilleurs résultats. La prochaine étape cruciale pour une édition efficace des gènes est l’optimisation des concentrations de Shield-1. Nous recommandons une concentration finale de 200 nM, mais pour obtenir les meilleurs résultats, la concentration doit être optimisée pour une lignée cellulaire transduite spécifique. Le système DD/Shield-1 a été utilisé avec succès dans différentes cultures cellulaires, cellules germinales, le protozoaire Entamoeba histolytica,le ver plat Caenorhabditis elegans,les xénogreffes transgéniques, les souris transgéniques et medaka25. L’une des plus grandes limites est le coût élevé de la molécule Shield-1, en particulier lorsqu’elle est utilisée dans des environnements in vivo. De plus, il a déjà été démontré que les protéines ciblées sur certains compartiments cellulaires, tels que la matrice mitochondriale ou la lumière du réticulum endoplasmique, peuvent être stabilisées ou accumulées en l’absence de Shield-1. C’est parce que différentes protéines ont des mécanismes locaux de contrôle de la qualité des protéinesdifférentes 26. Alors que les fusions DD dans le cytoplasme ou le noyau peuvent être très efficacement dégradées dans les cellules de mammifères et stabilisées par Shield-1, pour surmonter les limitations mentionnées ci-dessus, nous recommandons d’utiliser un domaine déstabilisateur alternatif dérivé de la dihydrofolate réductase bactérienne27. Ce système utilise le triméthoprime comme molécule de liaison pour stabiliser le domaine de déstabilisation et constitue également une alternative moins coûteuse au Shield-127.

Outre la transcription de DD-Cas9 en tant qu’expression indépendante, les avantages de cette méthode, par rapport à d’autres outils d’édition de gènes CRISPR-Cas9 inductibles ou contrôlés conditionnellement, sont l’édition de gènes contrôlée temporellement et conditionnellement, moins d’effet hors cible et une toxicité cellulaire plus faible4,6,7,8. L’efficacité et la simplicité de la méthode Shield-1/DD-Cas9 permettent la génération d’une variété d’outils qui peuvent être facilement adaptés et utilisés dans une multiplicité d’applications. Le système peut également être facilement utilisé dans des environnements in vivo, et il a été démontré que Shield-1 peut pénétrer efficacement à travers le bary19,25,28,29. Bien que cet article décrive l’utilisation de la technologie CRISPR-Cas9 pour la caractérisation des gènes cellulaires essentiels, la même approche pourrait être facilement mise en œuvre pour l’identification des gènes nécessaires à la survie ou à la progression des tumeurs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions les anciens membres de notre laboratoire et le scientifique Serif Senturk pour leurs travaux antérieurs. Nous remercions Danilo Segovia d’avoir lu ce manuscrit de manière critique. Cette étude a été possible et soutenue par Swim Across America et le programme Cancer Target Discovery and Development Center du National Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100mM DTT Thermosfisher
10X FastDigest buffer Thermosfisher B64
10X T4 Ligation Buffer NEB M0202S
colorimetric BCA kit Pierce 23225
DMEM, high glucose, glutaMax Thermo Fisher 10566024
FastAP Thermosfisher EF0654
FastDigest BsmBI Thermosfisher FD0454
Flag [M2] mouse mAb Sigma F1804-50UG
Genomic DNA extraction kit Macherey Nagel 740952.1
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
oligonucleotides Sigma Aldrich
pMD2.G Addgene 12259
polybrene Sigma Aldrich TR-1003-G
psPAX2 Addgene 12260
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit Qiagen 28506
secondary antibodies LICOR
Shield-1 Cheminpharma
Stbl3 competent bacterial cells Thermofisher C737303
SURVEYOR Mutation Detection Kit Transgenomic/IDT
T4 PNK NEB M0201S
Taq DNA Polymerase NEB M0273S
α-tubulin [DM1A] mouse mAb Millipore CP06-100UG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, New York, N.Y. 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).

Tags

Génétique Numéro 175 Édition de gènes études génomiques fonctionnelles CRISPR Cas9 domaine déstabilisateur inductible
Une nouvelle boîte à outils pour évaluer les fonctions des gènes à l’aide de la stabilisation cas9 conditionnelle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Šafarič Tepeš, P.,… More

Šafarič Tepeš, P., Sordella, R. A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization. J. Vis. Exp. (175), e60685, doi:10.3791/60685 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter