Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60687
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Summary

النهج الموصوف يجمع بين اختبارات الانبثاث الوريد الذيل التجريبية مع في الجسم الحية التصوير الحيواني للسماح الرصد في الوقت الحقيقي لتكوين ورم خبيث سرطان الثدي والنمو بالاضافه إلى التحديد الكمي للعدد الانبثاث وحجم في الرئتين.

Abstract

الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان ، وهناك خيارات علاجيه محدوده للمرضي الذين يعانون من مرض منتشر. تحديد واختبار الأهداف العلاجية الجديدة التي من شانها ان تسهل تطوير علاجات أفضل للمرض المنتشر يتطلب السريرية في نماذج الجسم الطبيعي. يظهر هنا نموذج الماوس المتزامن لسلخ سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق. الخلايا السرطانية المنتشرة محوله بشكل ثابت مع ناقلات الفيروسية ترميز لوسيفيراز اليراع و zsgreen البروتينات. ثم يتم التلاعب بالجينات المرشحة بثبات في luciferase/ZsGreen-التعبير عن الخلايا السرطانية ومن ثم يتم حقن الخلايا في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي لفحص الاستعمار المنتشر والنمو. ثم يستخدم جهاز تصوير في الجسم الحي لقياس التلالؤ الإحيائي أو الفلوري للخلايا السرطانية في الاحياء الحيوانية من أجل قياس التغيرات في العبء المنتشر علي مر الزمن. التعبير عن البروتين الفلوري يسمح عدد وحجم الانبثاث في الرئتين ليتم تحديدها كميا في نهاية التجربة دون الحاجة إلى التقطيع أو تلطيخ النسيجية. يوفر هذا النهج طريقه سريعة وسهله نسبيا لاختبار دور الجينات المرشحة في الاستعمار المنتشر والنمو ، ويوفر قدرا كبيرا من المعلومات أكثر من الاختبارات التقليدية لورم خبيث في الوريد الخلفي. باستخدام هذا النهج ، ونحن نظهر ان الضربة القاضية في وقت واحد من نعم البروتين المرتبطة (ياب) والمنشط المشترك مع عزر PDZ ملزمه (تاز) في خلايا سرطان الثدي يؤدي إلى انخفاض عبء المنتشر في الرئتين وان هذا العبء المخفض هو نتيجة لضعف كبير في الاستعمار المنتشر وانخفاض نمو الانبثاث.

Introduction

السرطان لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفاة في جميع انحاء العالم1 والانبثاث هو المسؤول عن غالبيه هذه الوفاات2,3. ومع ذلك ، فان الفهم المحدود للأليات الجزيئية التي تحكم الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق أعاق تطوير علاجات فعاله للامراض المنتشرة. ويتطلب تحديد الأهداف العلاجية الجديدة فحصا لاختبار مدي تاثير التعبير المضطرب أو وظيفة الجينات المرشحة علي تكوين الأورام الخبيثة ونموها. بينما نماذج الماوس أصلي لها مزاياها ، فهي تستغرق وقتا طويلا ومكلفه لتوليد ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتحقق من صحة الهدف بدلا من اكتشاف الهدف. نظم نموذج زرع فيها الجينات المرشح هو قلق في الخلايا السرطانية في المختبر ومن ثم يتم تقييم الآثار علي الإمكانات المنتشرة في الجسم المصاب ، هي اقل تكلفه واعلي من الانتاجيه من أصلي النماذج. الاضافه إلى ذلك ، النواقل الفيروسية للتسليم مستقره من RNAi ، CRISPR/كاس 9 ، والجينات هي متاحه علي نطاق واسع ، مما يجعل من السهل نسبيا للاضطراب تقريبا اي جين أو جينات الفائدة في خطوط الخلايا السرطانية. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لفحص دور الجينات المرشحة في الاستعمار المنتشر والنمو في خطوط الخلايا السرطانية البشرية عن طريق زرع الخلايا في الفئران المناعية أو أنسنه.

نوعين من المقايسات المستخدمة لاختبار تشكيل الانبثاث بالخلايا السرطانية المزروعة في الجسم الحيوي هي فحوصات الانبثاث العفوية واختبارات الانبثاث التجريبية. في اختبارات الانبثاث العفوية4،5، يتم حقن الخلايا السرطانية في الفئران ، ويسمح لتشكيل الورم الاولي ، وبعد ذلك تشكيل الانبثاث العفوي والنمو اللاحق يتم التهاوي. قوه هذا النموذج هو ان الخلايا يجب ان تكمل جميع خطوات العملية المنتشرة من أجل تشكيل الأورام المنتشرة. ومع ذلك ، فان العديد من خطوط الخلايا السرطانية لا تنتشر بكفاءة في نماذج الانبثاث العفوية ، وأي تلاعب في الخلايا التي تؤثر علي نمو الورم الاولي يمكن ان نخلط نتائج الفحص الانبثاث. يتم استخدام اختبارات الانبثاث التجريبية ، التي يتم حقن الخلايا السرطانية مباشره في الدورة الدموية ، لتجنب هذه المزالق. وتشمل اختبارات الانبثاث التجريبية الشائعة حقن الوريد الذيل6,7,8 (وأظهرت هنا), حقن داخل الشرايين9, والمدخل الوريد حقن10.

والغرض من البروتوكول المعروض هنا هو توفير اختبار الانبثاث التجريبية التي تسمح للباحث لرصد تشكيل الانبثاث والنمو في الوقت الحقيقي ، وكذلك لقياس نقطه نهاية عدد الانبثاث وحجم في الرئتين من نفس الماوس. لتحقيق ذلك ، يتم الجمع بين التجريبية التقليدية ذيل الوريد الانبثاث الاختبارات6،7،8 مع التصوير الحيواني الحية ، وذلك باستخدام جهاز التصوير في فيفو9،11،12،13،14. الخلايا السرطانية التي تعبر عن كل من لوسيفيراز والبروتين الفلوري يتم حقنها في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي ومن ثم يتم استخدام جهاز التصوير في الجسم المجري لقياس التغيرات في العبء المنتشر في الرئتين مع مرور الوقت (الشكل 1). ومع ذلك ، فان الجهاز الحي في الجسم التصوير الحيواني لا يميز أو يقيس حجم النقائل الفردية. التالي ، في نهاية التجربة ، يتم استخدام مجسم الفلورسنت الفلورية لحساب عدد وقياس حجم الانبثاث الفلورسنت في الرئتين دون الحاجة إلى التماس والانسجه أو مناعي (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار كيفيه تغيير التعبير أو وظيفة الجينات مرشح يؤثر علي تكوين الانبثاث والنمو. يمكن أيضا اختبار المركبات العلاجية المحتملة مثل الجزيئات الصغيرة أو وظيفة حجب الأجسام المضادة.

لإظهار هذا النهج ، قمنا أولا باجراء دليل علي تجربه المفهوم الذي عامل النسخ المتماثل الاساسيه ، النسخ المتماثل البروتين A3 (RPA3) هو طرقت أسفل في خلايا سرطان الثدي الماوس المنتشر. ونحن نظهر ان الفئران حقن مع RPA3 الخلايا الضربة القاضية لديها عبء اقل بكثير المنتشر في كل نقطه زمنيه مقارنه مع الفئران حقن مع خلايا التحكم. ويبين تحليل الرئتين التي تحتوي علي الانبثاث ان هذا العبء المنتشر المنخفض هو نتيجة لانخفاض كبير في الاستعمار المنتشر وضعف النمو في النقائل التي تشكل. لمزيد من التدليل علي هذه التقنية ، اختبرنا ما إذا كانت الضربات المتزامنة للبروتين المرتبط بنعم (ياب) والمنشط المشترك مع عزر الربط PDZ (تاز) يضعف الاستعمار المنتشر أو النمو اللاحق. ياب و تاز هما المنشطات المشتركة ذات الصلة التي هي المستجيبين المصب الحرجة من مسار فرس النهر. نحن15,16 والبعض الآخر قد تورط ياب و تاز في الانبثاث (راجعت في17,18,19), مما يوحي بان هذه البروتينات هي الأهداف العلاجية الجيدة. باستمرار ، وجدنا ان الفئران حقن مع ياب/تاز الخلايا الضربة القاضية قد خفضت بشكل كبير العبء المنتشر. واظهر تحليل الرئتين ان الخلايا الضربة القاضية ياب/تاز شكلت العديد من الانبثاث اقل وان الانبثاث التي لم تشكل أصغر. توضح هذه التجارب كيف تسمح اختبارات الانبثاث التجريبية للباحث بان يختبر بسرعة وبطريقه غير مكلفه دور الجينات المرشحة في تكوين ونمو الورم الخبيث. وتبين أيضا كيف ان الاستخدام المشترك للتصوير الحيواني الحي والتحديد الكمي الفلوري للنقائل في الرئتين كلها يسمح للباحث بفهم الخطوات بشكل أفضل اثناء الاستعمار المنتشر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وينطوي هذا البروتوكول علي استخدام الفئران والمواد البيولوجية الخطرة ويتطلب الموافقة من لجان السلامة المؤسسية المناسبة. وقد تمت الموافقة علي كل من وصفها في العمل الفيفو هنا من قبل كليه الطب الباني المؤسسة الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة (IACUC).

ملاحظه: للحصول علي نظره عامه حول بروتوكول ، راجع التخطيطي في الشكل 1.

1. التعبئة والتغليف جميع الفيروسات الرجعية المطلوبة و لينتيفيروسيس

ملاحظه: يستخدم البروتوكول الموصوف ناقلات لينتيفيرال أو الفيروسات الارتجاعية للتعبير بثبات عن انزيم لوسيفيراز والبروتين الفلوري وكذلك للتلاعب بالتعبير عن جين مرشح. يتم تعبئتها هذه الفيروسات في الخلايا 293FT يشك كما هو موضح أدناه.

  1. اليوم الأول: الخلايا 293FT اللوحة علي 6-بئر لوحات في 2 مل من وسائل الاعلام النمو الكامل (10 ٪ في DMEM مع 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين و 2 مم L-الجلوتامين) بحيث تكون 40-60 ٪ متموج في اليوم 2. احتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشيه وضحيها.
  2. اليوم الثاني: بالنسبة لكل متجه فيروسي ليتم تعبئته ، transfect 40-60 ٪ متموج well من الخلايا يشيك-293FT مع الفيروسات القهقريه أو ناقلات لينتيفيرال والمتجات المناسبة ترميز معطف الفيروسية والبروتينات التعبئة والتغليف.
    ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول VSVG كبروتين معطف ، psPAX2 للتغليف اللينتيفيرال ، وهفوة-pol للتغليف الفيروسات القهقريه (انظر الجدول التكميلي 1 لقائمه ناقلات).
  3. جعل خليط النقل المشترك لكل بئر كما يلي:
    1. الجمع بين 4 μL من محلول الدهون للاستئصال (انظر جدول المواد) و 96 μl من العازلة الفاصلة واحتضان لمده 5 دقائق.
    2. أضافه 1 ميكروغرام من ناقلات الفيروسية, 0.5 ميكروغرام من البروتين معطف ناقلات (VSVG), و 0.5 ميكروغرام من ناقلات البروتين التعبئة والتغليف (psPAX2 أو هفوة-pol) واحتضان لمده 20 دقيقه.
    3. أضيفي الخليط برفق من الخطوة 1-3-2 إلى الخلايا 293FT المطلية في الخطوة 1.1 والمحتضنة في 37 درجه مئوية ، 5% CO2 بين عشيه وضحيها.
  4. اليوم الثالث: قم بازاله الوسائط التي تحتوي علي الازاحه من كل بئر وأضف 2 مل من وسائط النمو الكاملة إلى كل بئر. احتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة تقريبا.
  5. اليوم 4: جمع سوبرناتانت الفيروسية من كل بئر باستخدام حقنه 3 مل وتصفيه من خلال فلتر 0.45 μm في أنبوب الطرد المركزي 2 مل.
  6. اختياري: إذا كان من المرغوب فيه جمع دفعه ثانيه من الفيروس ، أضافه بلطف 2 مل من وسائل الاعلام النمو الكامل لكل بئر واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة تقريبا.
  7. اليوم الخامس (اختياري): جمع الجولة الثانية من سوبرناتانت الفيروسية كما هو الوضع في الخطوة 1.5.
    ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا عن طريق تجميد سوبرناتانت الفيروسية.

2-توليد الخلايا السرطانية التي تعبر بثبات عن لوسيفيراز والبروتين الفلوري

ملاحظه: يصف البروتوكول التالي كيفيه أولا لتسميه بشكل ثابت الخلايا 4t1 مع لوسيفيراز اليراع والبروتين الفلوري (zsgreen) باستخدام اثنين من المتجات مع الجينات اختيار فريدة من نوعها. ثم يتم استخدام ناقلالفيروسية 3 للتلاعب التعبير عن الجينات مرشح. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام النواقل الفيروسية التي تقدم في الوقت نفسه البروتين الفلوري والتلاعب الجيني كبديل (كما هو الحال في التجارب التمثيلية أدناه). يمكن استخدام الخلايا السرطانية الأخرى ، ولكن يجب تحسين أرقام الخلايا للخطوات 2.1 و 2.7.1.

  1. لوحه 4T1 الخلايا في 1.5 × 105 خلايا/جيدا في لوحه 12 بئر في وسائل الاعلام النمو الكامل (10 ٪ في dmem مع 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين و 2 مم L-الجلوتامين) واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشيه وضحيها.
  2. تصيب الخلايا 4t1 مع ماده طافي الفيروسية المتولدة في الخطوة 1 علي النحو التالي.
    1. يستنشق وسائل الاعلام النمو من الخلايا وأضافه 500 μl من لوسيفيراز الفيروسية ماده طافي و 500 μl من البروتين الفلوري ماده طافي الفيروسية لتصيب في وقت واحد الخلايا مع كل من لوسيفيراز والبروتين الفلورية ماده طافي الفيروسية.
    2. أضافه 1 μL من 8 ملغ/مل هيكادييمثريدين بروميد (انظر جدول المواد).
    3. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ حتى 75-90 ٪ متموج (عاده 24-48 ساعة).
  3. تريسينايز الخلايا 4T1 مع 500 μL من التريبسين لمده 2-5 دقيقه (يجب ان الخلايا شطف بحريه قباله الجزء السفلي من البئر). نقل جميع الخلايا إلى طبق 6 سم في 4 مل من وسائل الاعلام الاختيار (النمو الكامل وسائل الاعلام التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة) التالي تبريد التريبسين. طبق صحن 6 سم من خلايا التحكم غير المصابة في نفس وسائط التحديد.
    ملاحظه: يجب تحديد تركيز المضادات الحيوية المناسبة في وقت مبكر من خلال اختبار عده جرعات. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام الفرز الخلوي المنشط لتحديد الخلايا المسمية فلوريسسينتلي بدلا من اختيار المخدرات.
  4. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 في وسائل الاعلام الاختيار وتقسيم الخلايا عند الضرورة حتى جميع خلايا التحكم غير المصابة ميتة (تعتمد علي اختيار الجينات وخط الخلية).
  5. تاكد من ان الخلايا 4T1 المصابة هي التعبير عن ZsGreen بروتين الفلورسنت باستخدام الاثاره الخضراء (450-490 nm)/الانبعاثات (500-550 nm) مرشح تعيين علي المجهر الفلورسنت المقلوب في 50-100x التكبير.
  6. تاكد من ان الخلايا 4t1 المصابة تعبر عن لوسيفيراز باستخدام مجموعه النشاط لوسيفيراز المتاحة تجاريا علي النحو التالي.
    1. استخدام حجم الحد الأدنى من 1x السلبي تحلل العازلة ل lyse luciferase-التعبير عن الخلايا 4T1 والسيطرة علي الخلايا 4T1 التي لا تعبر عن luciferase ، تهتز بلطف لمده 30 دقيقه.
    2. أضافه 20 μl من الخلية محلله إلى لوحه بيضاء القاع 96 ومن ثم 50 μl من كاشف المقايسة لوسيفيراز من مجموعه النشاط لوسيفيراز.
    3. استخدام قارئ لوحه لقياس التلالؤ من الخلايا في جميع الأطوال الموجية في الطيف باستخدام اعداد التلالؤ.
      ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا بتجميد الخلايا المحولة بشكل ثابت.
  7. التلاعب بالتعبير عن الجينات المرشحة علي النحو التالي:
    1. لوحه 6 × 105 المسمية 4t1 الخلايا من الخطوة 2.6 علي طبق 60 مم في 4 مل من وسائل الاعلام النمو الكامل واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشيه وضحيها.
    2. يستنشق وسائل الاعلام النمو من كل بئر وأضافه 2 مل من وسائل الاعلام النمو الكامل التي تحتوي علي 4 μL من 8 ملغ/مل هيكاديميثريدين بروميد.
    3. أضافه 2 مل من سوبرناتانت الفيروسية من الخطوة 1 إلى الخلايا مطلي من الخطوة 2.7.2 واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشيه وضحيها.
    4. تريسينايز الخلايا 4T1 مع 500 μL من التريبسين لمده 2-5 دقيقه (يجب ان الخلايا شطف بحريه قباله الجزء السفلي من البئر). نقل جميع الخلايا إلى طبق 10 سم في 10 مل من وسائل الاعلام الاختيار (النمو الكامل وسائل الاعلام التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة) التالي تبريد التريبسين. لوحه بعض السيطرة غير المصابة المسمي 4T1 الخلايا في نفس وسائط التحديد.
    5. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية ، و 5 ٪ CO2 في وسائل الاعلام الاختيار وتقسيم الخلايا عند الضرورة حتى تكون جميع الخلايا غير المصابة ميتة.
    6. أكدت ان التعبير من المرشح مورثه يكون غيرت يستعمل مقاربه معياريه مثل لطخه غربيه20 أو [قبكر]21.
    7. فحص التلالؤ والفلوري كما هو الحال في الخطوات 2.5-2.6 لتحديد مدي تشابهها في السيطرة والخلايا الضربة القاضية ، وهذا يمكن ان تتغير (انظر المناقشة).
      ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا بتجميد الخلايا المحولة بشكل ثابت.

3. الأمثل للتصميم التجريبي في الجسم الخاص

  1. تحسين عدد الخلايا المناسبة ومده التجربة للعبء المنتشر المطلوب علي النحو التالي.
    1. قم بتوسيع خلايا 4T1 الفلورية والملونة من الخطوة 2.6 في وسائط النمو الكاملة بحيث تتوفر الخلايا الزائدة في اليوم المطلوب من الحقن.
    2. اعداد الخلايا لحقن الوريد الذيل كما هو موضح في الخطوة 4.2. لتحديد رقم الخلية الأمثل للحقن ، أعاده تعليق الخلايا في عده تركيزات مختلفه في 100 μL من 1x تلفزيوني.
      ملاحظه: نوصي باختبار مجموعه من أرقام الخلايا/الماوس من 25,000 حتى 500,000.
    3. إبقاء تعليق الخلية علي الجليد حتى الحقن.
    4. حقن كل التخفيف من الخلايا 4T1 من الخطوة 3-1-2 إلى 3-4 الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي الموصوفة في الخطوة 4.3 (انظر أدناه).
    5. أعاده الماوس إلى قفصها ورصد لمده 15 دقيقه لضمان الشفاء الكامل. وينبغي التحقق من الفئران لعلامات الم أو الاستغاثة 3x أسبوعيا.
    6. رصد الفئران لتشكيل الانبثاث والنمو لمده 3-6 أسابيع (خط الخلية وسلاله الماوس تعتمد) باستخدام جهاز في الجسم الحية التصوير الحيواني (انظر الخطوتين 5 و 6).
      1. موت ببطء الفئران 3-6 أسابيع بعد حقن الوريد الذيل وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية القياسية.
      2. اعداد الرئتين وتقييم حجم الانبثاث وعدد الموصوفة في الخطوة 7.
      3. اختر المدة الزمنيه المناسبة لنمو النقائل للحصول علي العبء المنتشر المطلوب (انظر المناقشة).

4. حقن الوريد الذيل من الخلايا السرطانية المسمية

ملاحظه: تم تحسين الخطوة 4.2.4 للخلايا 4T1 تنمو في الفئران BALB/c synجينه. إذا تم استخدام خطوط الخلايا السرطانية الأخرى وسلالات الماوس ، يجب ان يكون عدد الخلايا التي تم حقنها ، وطول الفحص الأمثل أولا.

  1. قم بتوسيع خطوط الخلايا 4T1 التي تم إنشاؤها في الخطوة 2 علي 2 15 سم الاطباق في وسائل الاعلام النمو الكامل بحيث تتوفر الخلايا الزائدة في يوم الحقن.
  2. اعداد الخلايا لحقن الوريد الذيل علي النحو التالي:
    1. يستنشق وسائل الاعلام وشطف لوحات الخلية مع 1x تلفزيوني.
    2. تريسينايز الخلايا مع 5 مل من التريبسين لكل لوحه 15 سم لمده 2-5 دقيقه (يجب ان الخلايا شطف بحريه قباله الجزء السفلي من البئر). نقل جميع الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل. يغسل الخلايا المتبقية من طبق ثقافة الانسجه مع ما يكفي من وسائل الاعلام النمو الكامل لإرواء التريبسين وأضافه الغسيل إلى نفس الأنبوب المخروطي.
    3. احسب الخلايا باستخدام عداد خليه تلقائي لتحديد رقم الخلية الإجمالي.
    4. الطرد المركزي الخلايا في 122 x g لمده 3 دقائق ، يستنشق supernatant ، وأعاده تعليق الخلايا في 1X تلفزيوني في التركيز المطلوب. هنا ، 2.5 x 10 يتم حقن4 خلايا في كل الماوس في 100 μl من تلفزيوني ، التالي فان أعاده التعليق الخلايا في 2.5 x 105 خلايا/مل. إبقاء تعليق الخلية علي الجليد حتى الحقن.
      ملاحظه: من المهم للحد من مقدار الوقت بين التريسينزيشن من الخلايا وحقن الوريد الذيل إلى ما يقرب من 1 ساعة.
  3. حقن الخلايا 4T1 من الخطوة 4.2.5 إلى الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي علي النحو التالي:
    1. العمل في غطاء محرك السرير في منشاه الحيوانية, بلطف ولكن بشكل جيد خلط الخلايا عن طريق عكس الأنبوب أو باستخدام حقنه 1 مل لضمان ان يتم أعاده تعليقها بانتظام. تاكد دائما من أعاده تعليق الخلايا قبل تحميل الحقنه.
    2. تحميل 1 مل Luer-قفل حقنه مع تعليق الخلية وطرد فقاعات الهواء الزائدة. وضع 1/2 بوصه, 30-مقياس ابره علي حقنه مع شطبه وطرد فقاعات الهواء.
    3. وضع برفق الماوس في القوارض يقيد.
    4. يجب ان تكون الاورده الخلفية الجانبية مرئية ومتوسعة. إذا لم يكن كذلك ، قرصه برفق قاعده الذيل وتراجع الذيل في مياه الصنبور الدافئة لتمدد الاورده.
      ملاحظه: يمكن أيضا ان يتحقق تمدد الاورده عن طريق وضع قفص الماوس تحت مصباح التدفئة و/أو علي راس لوحه التدفئة.
    5. استخدام مسح الكحول لتنظيف الذيل. ادراج الابره في الوريد الذيل ، شطبه الجانب حتى ، وحقن 100 μL من تعليق الخلية.
      ملاحظه: إذا تم ادراج الابره بشكل صحيح في الوريد ، فانه يجب ان تنزلق بسهوله قليلا إلى الامام والخلف ، ويجب ان لا يكون هناك مقاومه عندما يتم دفع المكبس. الحقن الناجحة يجب ان يؤدي أيضا إلى "تدفق" في اللون الأزرق من الوريد يتحول الأبيض لبضع ثوان بعد الحقن.
  4. أزاله الابره ببطء واستخدام الشاش المعقمة ، وتطبيق الضغط علي موقع الحقن لوقف اي نزيف.
  5. أعاده الماوس إلى قفصها ورصد لمده 15 دقيقه لضمان الشفاء الكامل. وينبغي التحقق من الفئران لعلامات الم أو الاستغاثة 3x أسبوعيا.
  6. رصد الفئران لتشكيل الانبثاث والنمو لمده 3-6 أسابيع (خط الخلية وسلاله الماوس تعتمد) باستخدام جهاز في الجسم الحية التصوير الحيواني (انظر الخطوتين 5 و 6).

5. رصد العبء المنتشر من قبل مضان مع الحية في جهاز التصوير الحيواني حيه

ملاحظه: لا صوره الحيوانية لمضان مع اشاره الاناره النشطة.

  1. إذا فقط التصوير التلالؤ ، انتقل إلى الخطوة 6.
  2. قم بتشغيل جهاز تصوير الصور الحيوانية الحية.
  3. قم باعداد نظام التخدير الحي للتصوير الحيواني وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لتقديم ما بين 1.5 ٪ و 2 ٪ ايزوفلونان إلى غرفه التخدير وغرفه التصوير.
  4. تخدير الفئران مع فلوريسسينتلي المسمي الانبثاث من الخطوة 4 عن طريق وضعها في غرفه التخدير وتقديم 1.5-2.5 ٪ ايزوفلوراني.
  5. افتح برنامج الصور (انظر جدول المواد) وتسجيل الدخول.
  6. انقر فوق الزر تهيئه وانتظر الجهاز لتهيئه.
  7. تغيير حقل العرض إلى D.
    ملاحظه: يمكن أيضا استخدام حقل العرض C إذا كانت هناك حاجه إلى عرض أقرب للماوس ، ولكن هذا يحد من عدد الفئران التي يمكن ان تكون في نفس الوقت.
  8. بمجرد ان يشير البرنامج إلى ان الكاميرا قد وصلت إلى درجه الحرارة المناسبة ، انقر فوق زر معالج التصوير ، واختر الفلورية ثم اختر زوج الفلتر المناسب من القائمة المنسدلة.
    ملاحظه: إذا كان فلوكوفيري المستخدمة ليس خيارا ، اختر إدخال EX/EM واكتب الاثاره والانبعاثات المطلوبة.
  9. ضع الماوس في الغرفة كما هو موضح في الخطوة 3-2.
  10. انقر فوق الحصول علي تسلسل.
  11. بعد التصوير ، وأعاده الماوس إلى قفصها ورصد لمده 15 دقيقه لضمان الشفاء الكامل.
  12. كرر الخطوة 5.2 والخطوات 5.7-5.9 مع ماوس واحد علي الأقل لا يحتوي علي الانبثاث. ملاحظه: سيتم استخدام هذا الماوس لقياس وطرح اشاره الخلفية اثناء التحليل (الخطوة 8).
  13. صوره 2-3 مرات أسبوعيا لمده التجربة.

6. رصد العبء المنتشر عن طريق التلالؤ الإحيائي مع الحية في جهاز التصوير الحيواني حيه

  1. قم بتشغيل جهاز التصوير الحيواني الحي في الجسم واعداد البرنامج علي النحو التالي.
    1. افتح برنامج الصور (انظر جدول المواد) وتسجيل الدخول. انقر فوق الزر تهيئه وانتظر الجهاز لتهيئه. تغيير حقل العرض إلى D.
      ملاحظه: يمكن استخدام حقل طريقه العرض C للحصول علي طريقه عرض أقرب إلى صوره الجسم الماوس بالبالكامل; ومع ذلك ، هذا يحد من عدد الفئران التي يمكن ان تكون في وقت واحد.
    2. للاستخدام للمرة الاولي ، يمكنك تحرير إعدادات التعريض الضوئي كما يلي: انقر علي تعديل | التفضيلات | الاستحواذ | التعرض التلقائي وتغيير الحد الأقصى لوقت التعرض من الافتراضي 60 ثانيه إلى 300 ثانيه وانقر فوق OK.
      ملاحظه: لا تقم بتغيير إيه معلمات أخرى في علامة التبويب التعريض التلقائي.
  2. اعداد نظام التخدير وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لتقديم ما بين 1.5 ٪ و 2 ٪ ايزوفلونان إلى غرفه التخدير وغرفه التصوير.
  3. تاكد من ان الكاميرا قد وصلت إلى درجه الحرارة المناسبة قبل الانتقال إلى الخطوة 6.4.
  4. تخدير الفئران التي تحتوي علي الانبثاث من الخطوة 4 عن طريق وضعها في غرفه التخدير وتقديم 1.5-2.5 ٪ ايزوفلوراني.
  5. اعداد الفئران للتصوير التلالؤ الإحيائي علي النحو التالي.
    1. تحميل حقنه 1 مل مع د-luciferin (30 ملغ/مل في مد--بودي) ومن ثم أضافه 1/2 بوصه 30-مقياس ابره إلى حقنه وطرد فقاعات الهواء.
    2. قياس وتسجيل كتله الفاره التخدير.
    3. كبح جماح الماوس عن طريق معسر الرقبة من رقبتهم باستخدام الإبهام ومؤشر الأصابع واستيعاب الذيل بين اصبع الخنصر وقاعده اليد. عكس الماوس في زاوية 45 درجه ، مع راسه وأشار إلى الأسفل.
    4. ادراج الابره ، شطبه الجانب حتى ، في الجانب الأيسر داخل الماوس (IP) الفضاء. تاكيد الإدخال في مساحة IP عن طريق سحب وحده تخزين صغيره. لا ينبغي ان يكون هناك لون في قاعده الابره عند الرسم مره أخرى في الفضاء IP.
    5. حقن الحجم المناسب من D-luciferin لجرعه من 150 ملغ/كغ.
    6. مباشره بعد أداره د-luciferin ، بدء جهاز ضبط الوقت ووضع الماوس شقه علي ظهرها في جهاز التصوير مع انفه في مخروط الأنف والتاكد من ان 1.5-2.5 ٪ ايزوفلوراني تدار. وضع فواصل بين كل الماوس إذا التصوير الفئران متعددة. تاكد من وضع الفئران كمسطحه قدر الإمكان (اي لا يميل إلى جانب واحد).
    7. انقر فوق مربعات الاناره والصور ثم انقر فوق اكتساب في لوحه التحكم الاستحواذ.
  6. الحصول باستمرار علي الصور البيولوجية الهادئة حتى يتم تحقيق اشاره الذروة واستخدام الصورة مع اشاره الذروة البيولوجية للتحليل.
  7. بعد التصوير ، وأعاده الماوس إلى قفصها ورصد لمده 15 دقيقه لضمان الشفاء الكامل.
  8. صوره 2-3 مرات أسبوعيا لمده التجربة.

7. القياس الكمي لعدد وحجم الانبثاث

ملاحظه: يجب تحديد طول الفترة الزمنيه المسموح بها لنمو الانبثاث لكل خط خليه وسلاله الماوس ، وسوف تتاثر بعدد الخلايا التي تم حقنها.

  1. موت ببطء الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية القياسية.
  2. عزل وأزاله الرئتين من كل الماوس وشطف في 1x تلفزيوني لأزاله الدم الزائد.
  3. افصل الرئتين برفق إلى فصوص.
  4. الحصول علي صور من الانبثاث ZsGreen في فصوص في 10x في حقل مشرق والفلورية باستخدام منظار الفلورسنت الفلورية مع فلتر العريضة GFP (الاثاره 470/40x).
    ملاحظه: الحفاظ علي نفس التكبير والسطوع لكافة العينات. قد يختلف التكبير المستخدم تبعا لحجم وعدد وسطوع النقائل بالاضافه إلى مجال الرؤية الخاص بالمجهر المستخدم.
  5. استخدام برنامج تحليل الصور لقياس حجم وعدد الانبثاث من الصور.
    ملاحظه: البروتوكول لتحليل الصور هو البرامج التابعة ويمكن ان يكون الأمثل مع الأورام من خطوه 3. بدلا من ذلك ، عد عدد الانبثاث في كل الرئة يدويا باستخدام المنظار الفراغي الفلورسنت. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ويمكن القيام بالخطوة 8 في اي مرحله بعد جمع جميع الصور في الجسم الفيفو.

8. تجهيز وتحليل البيانات من الصور التي تم الحصول عليها مع الحية في جهاز التصوير الحيواني حيه

  1. فتح جميع ملفات الصور لكل الماوس في برنامج الصورة.
    ملاحظه: استخدام الصورة مع اشاره الذروة بيوكولوميننت للتحليل
  2. تاكد من ان الوحدات في الإشراق للبيانات البيولوجية والكفاءة لبيانات الفلورسنت عن طريق النقر علي السهم في الجانب العلوي الأيسر من نافذه الصورة وتغييره إلى الوحدة المناسبة.
  3. استخدم الصورة من النقطة الزمنيه الاخيره لإنشاء منطقه ذات فائده (ROI) علي النحو التالي.
    1. انقر فوق أدوات ROI في نافذه لوح الاداات . ادراج عائد استثمار واحد بالنقر فوق السهم وتحديد 1.
    2. انقر فوق حدود عائد الاستثمار وحركها فوق صدر الماوس. اضبط حجم عائد الاستثمار بحيث يغطي صدر الماوس ولا يستبعد الاشاره.
  4. انقر فوق قياس ROIs وانسخ أو اكتب الرقم الاولي في ورقه excel.
    ملاحظه: بالنسبة للبيانات البيولوجية الهادئة ، حدد التدفق الكلي (الفوتونات/الثانية) ، وهو مجموع التالق في عائد الاستثمار. وبما ان النقائل لا تنمو بالضرورة بشكل موحد ، فان التدفق الإجمالي يفضل علي الإشراق المتوسط لأنه يقيس مجموع العبء المنتشر. المثل ، بالنسبة لبيانات الفلورسنت ، ينبغي استخدام الكفاءة الاجماليه (الضوء المنبعث (الفوتون/الثاني)/ضوء الاثاره (الفوتونات/الثانية) بدلا من متوسط الكفاءة.
  5. انقر بزر الماوس الأيمن في ملف الصورة لنسخ عائد الاستثمار المستخدم في الخطوة 8.3 ولصقه في كل ملف الصورة.
    ملاحظه: عند التحديد الكمي للصور الفلورية ، يمكنك تحديد المنطقة نفسها علي الماوس الذي تم تصويره بدون ورم خبيث. استخدام هذه الاشاره كاشاره الخلفية وطرحها من كل صوره الماوس التي تحتوي علي الانبثاث الفلورسنت التي تم الحصول عليها.
  6. نقل ROIs التي تم لصقها عبر نفس المنطقة المحددة في الخطوة 8.3.4 لكل صوره وكرر الخطوة 8.4.
  7. ارسم البيانات الاوليه وحللها كما يلي (راجع الجدول التكميلي 2).
    1. قم بتسجيل10 تحويل البيانات الاوليه لكل ماوس باستخدام الصيغة المشار اليها (الجدول التكميلي 2) والمؤامرة كما في الشكل 2د والشكل 4و. التحول سجل10 يجعل منحني النمو الذي يميل إلى ان تكون هندسية ويقلل من هيتيروسسيداستيسيتي.
    2. باستخدام الانحدار الخطي ، حساب المنحدر من الخط المجهز إلى سجل10 تحويل البيانات لكل الماوس رسمها في الخطوة 8.7.1 (الجدول التكميلي 2). الرجوع إلى الصيغة في الجدول التكميلي 2 لتناسب الخط وحساب الميل في خطوه واحده.
    3. رسم القيم العددية للمنحدرات كما في الشكل 2ه والشكل 4ز. استخدم اختبار t للطالب أو ANOVA باتجاه واحد (لأكثر من مجموعتين) علي المنحدرات لتحديد الاهميه الاحصائيه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لإظهار النهج المذكور أعلاه ، قمنا باجراء دليل علي تجربه المفهوم الذي عامل النسخ المتماثل الحرجة ، RPA3 وقد أسقطت في خط خليه سرطان الثدي المنتشرة الفئران (4T122). في حين ان البروتوكول يصف وصف الخلايا مع كل من لوسيفيراز والبروتينات الفلورية قبل التلاعب الوراثية ، استخدمنا نهج معدله لان ناقلات rnai أيضا تسليم zsgreen (الشكل 2ا). أولا ، كانت خلايا 4t1 محوله بشكل ثابت مع لينتيفيرال بناء ترميز اليراع لوسيفيرياس ومقاومه هايجرومايسين (phage-لوسيفيراز-اليرس-hygro). بعد اختيار هيجرومايسين ، تم اجراء فحص لوسيفيراز لتاكيد التعبير المستقر لل لوسيفيراز اليراع (الشكل 2ا). بعد ذلك ، كانت خلايا 4t1-luciferase محوله بشكل ثابت مع ناقلات الفيروسات الارتجاعية التي تعبر عن zsgreen واما السيطرة miR30 القائم عليها ، أو شرينا المستندة إلى miR30 سابقا أظهرت لفعالية الهدف الماوس RPA316،23،24. ثم تم حقن الخلايا في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي وتم قياس الاشاره البيولوجية في الجسم مرتين في الأسبوع لرصد العبء المنتشر (الشكل 2ب ، ج). وتم رسم الاشاره المحولة بالسجل10 لكل فاره علي انها عبء منتشر علي مر الزمن (الشكل 2د) وتم تحديد منحدرات كل قطعه (الشكل 2ه). تظهر هذه البيانات معدل التغير في العبء المنتشر ينخفض بشكل كبير مع RPA3 ضربه قاضيه مقارنه بخلايا التحكم. وعلي الرغم من ان الاختلافات ملفتة للنظر ، فان هذه البيانات وحدها لا تسمح لنا بتحديد ما إذا كان العبء المنخفض المنتشر ناتجا عن اقل الانبثاث أو بسبب تباطؤ نمو النقائل. ولذلك ، تم تحليل الانبثاث المسمي ZsGreen في الرئتين أيضا في نهاية التجربة. الفئران حقن مع RPA3 الخلايا الضربة القاضية كان تقريبا اي الانبثاث في الرئتين ، في حين ان الفئران التحكم كان العديد من الانبثاث الكبيرة (الشكل 3). وعلاوة علي ذلك ، كانت الانبثاث التي لم تشكل من RPA3 الخلايا المطرقة بشكل واضح أصغر من السيطرة الانبثاث 4T1 (الشكل 3ا). وفقا لحساباتنا اليدوية (الشكل 3ب) ، فان برنامج تحليل الصور يحسب الانبثاث اقل بكثير في الفئران RPA3 الضربة القاضية (الشكل 3ج). بالاضافه إلى ذلك ، فان إجمالي العبء المنتشر في الرئتين (مجموع المناطق من كل الانبثاث في ملليمتر) وانخفض أيضا بشكل كبير بواسطة RPA3 ضربه قاضيه (الرقم 3د). وأخيرا ، كان حجم الانبثاث الفردية التي شكلت في الفئران RPA3 ضربه قاضيه عموما أصغر بكثير من تلك الموجودة في الفئران التحكم (الشكل 3ه). بالاضافه إلى الانبثاث الكبيرة في الفئران التحكم ، لاحظنا العديد من الانبثاث الصغيرة كذلك ، ولكن لا يمكن تحديد ما إذا كانت هذه الخلايا السرطانية التي بذرت الرئة ولم تنمو أو إذا كانت الخلايا السرطانية تسلط من واحده من الانبثاث أكبر ان أعاده البذر الرئة في موقع جديد (الشكل 3ه). تظهر هذه البيانات مجتمعه ان RPA3 مطلوبه لتشكيل الانبثاث بواسطة خلايا 4T1. وكان من المتوقع هذه النتائج لان عملنا السابق اظهر ان RPA3 نهدم الخلايا قد خفضت بشكل كبير القدرة علي تشكيل الانبثاث في الرئتين بعد حقن الوريد الذيل16. ومع ذلك ، توضح هذه التجربة كيف يمكن استخدام التصوير الحيواني الحي والكمية الفلورية من عدد الانبثاث وحجمها لتحديد ما إذا كانت التغيرات في العبء المنتشر بسبب الاختلافات في الاستعمار المنتشر أو النمو.

لتوضيح كيف يمكن استخدام هذا النهج للرد علي سؤال أكثر اهميه من الناحية البيولوجية, سالنا إذا ياب و تاز مطلوبه للاستعمار المنتشر والنمو اللاحق في هذا النموذج المتزامن لسرطان الثدي. يتم زيادة التعبير والنشاط من ياب أو تاز في العديد من أنواع السرطان مقارنه مع الانسجه العادية وهذا هو التنبؤيه للنتائج المريض الفقراء25,26,27,28,29. بالاضافه إلى ذلك, وقد تورطت العديد من الدراسات ياب, تاز, أو teads, الحرجة ياب/تاز-ربط الشركاء, في الانبثاث15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43،44،45،46،47،48،49،50،51،52. النظر إلى هذه البيانات استخدمنا نهجنا لاختبار إذا ياب و تاز مطلوبه لتشكيل الانبثاث والنمو. لهذا ، نستخدم ناقلات الفيروسات الارتجاعية التي تعبر عن miR30 القائم علي الموجات التي تستهدف كلا من ياب و تاز. كما هو مبين ، فان هذه الطريقة الترادفية تقلل بشكل فعال من التعبير عن البروتين ياب و تاز والنشاط العابر في خلايا 4T1 (الشكل 4ا ، ب). كانت خلايا 4t1-luciferase محوله بشكل ثابت مع النسخة zsgreen-التعبير عن هذا ترادفية ياب/تاز شرانا المتجات أو السيطرة miR30-القائم علي شرينا (الشكل 4ج) وثم التهاوي بواسطة حقن الوريد الذيل في الفئران balb/C المتزامنة. وكما هو مبين في الشكل 4، فان المعدل الذي زاد فيه العبء المنتشر كان أسرع بكثير في الفئران المحقونة بخلايا التحكم بالمقارنة مع الفئران التي حقنت بخلايا الضربة القاضية ياب/تاز (الشكل 4مد-واو). عدد اقل بكثير من الانبثاث شكلت في الفئران حقن مع ياب/تاز الخلايا الضربة القاضية مقارنه الفئران مع خلايا التحكم سواء عد يدويا (الشكل 5ا ، ب) أو باستخدام برنامج تحليل الصور (الشكل 5ج). لم يقتصر الكثير من الاشكال الانبثاث في الفئران التحكم ، ولكنها كانت أكبر عموما (الشكل 5ه). باستمرار, العبء المنتشر في الرئتين (إجمالي منطقه الانبثاث في مم) كما خفضت بشكل كبير من قبل ياب/تاز الضربة القاضية (الرقم 5د). من المهم ملاحظه انه عندما تكون الانبثاث كبيره وقريبه من بعضها البعض ، قد يكون البرنامج غير قادر علي التفريق بين الانبثاث المتميزة. وكان هذا هو الحال بالنسبة لعدد قليل من الانبثاث في الفئران السيطرة (الماوس 3 والماوس 7). التالي ، من المهم التحقق من إخراج برنامج تحليل الصور للتاكد من انه يقيس بدقه منطقه الأورام المفردة. وهذا أيضا هو السبب في انه من المهم تحسين عدد الخلايا التي يتم حقنها وطول التجربة. وبشكل جماعي ، تظهر هذه البيانات ان ياب و تاز مطلوبان للحفاظ علي المعدل الذي يزيد فيه العبء المنتشر في نموذج murine المتزامن لسرطان الثدي المنتشر وان هذا يرجع إلى عدم قدره النقائل علي تشكيل وانخفاض نمو الانبثاث القليلة التي شكلت.

Figure 1
الشكل 1: تخطيط البروتوكول. يتم تعبئتها جميع الفيروسات اللازمة أولا في الخلايا 293FT يشيك. الخلايا المطلوبة للدراسة ثم المصابين في وقت واحد مع لوسيفيراز والفيروسات الفلورية التي تعبر عن الجينات اختيار المخدرات الثدييات فريدة من نوعها. ثم يتم توسيع الخلايا المصابة في وسائل الاعلام المناسبة التي تحتوي علي كل من المخدرات لتحديد للخلايا محوله بثبات التعبير عن كل من لوسيفيراز والبروتين فلورسنت. يتم تاكيد التعبير عن كل من التسميات كما هو موضح في البروتوكول. ثم يتم توصيل الخلايا المسمية مع فيروس ثالث التلاعب الوراثية التي تحتوي علي (miR30 شرينا) والثالثة فريدة من نوعها الجينات اختيار المخدرات. بعد الاختيار مع الدواء الثالث ، يتم حقن الخلايا في الفئران عن طريق الوريد الذيل الجانبي. يتم رصد العبء المنتشر في الفئران في جميع انحاء التجربة مع نظام التصوير الحيواني الحي في الجسم. في نهاية التجربة ، يتم رحيم الفئران ، وتؤخذ صور الرئتين بأكملها باستخدام مجهر الفلورسنت تشريح ، ومن ثم تستخدم لقياس عدد وحجم الانبثاث. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التي تستند إلى Luciferase في الجسم الحية التصوير الحيواني يظهر ان RPA3 ضربه قاضيه يقلل من العبء المنتشر سرطان الثدي. (ا) مخطط يبين كيف تم توليد الخلايا لهذا في دراسة الجسم المجري. كانت خلايا 4t1 محوله بشكل ثابت مع لينتيفيروس ترميز لوسيفيراز ومقاومه hygromycin. تم اختيار الخلايا المصابة مع 600 ميكروغرام/مل من hygromycin B لمده أسبوع واحد ثم تم قياس النشاط لوسيفيراز في الابويه أو 4t1-لوسيفيراز الخلايا باستخدام مجموعه مراسل لوسيفيراز وقارئ لوحه (ن = 1 تجربه مع تكرار الآبار متوسط). ثم أصيبت الخلايا 4T1-Luciferase مع الفيروسات الرجعية التي تقدم ZsGreen و miR30 شراناس استهداف اما mCherry (السيطرة) أو mRPA3. تم استخدام اختيار بوروميسين (2.5 ميكروغرام/مل) لمده 3 أيام لتحديد للتكامل مستقره من الفيروس. (B-E) 4t1-luciferase الخلايا التي تعبر بثبات ZsGreen والسيطرة (Sh-mcherry) أو mRPA3 (mRPA3-431) تم حقن شراناس في الفئران والشيخوخة للصفاء الإحيائي في الأيام المشار اليها كما هو موضح في البروتوكول. (ب &Amp; ج) الصور البيولوجية للماوس التمثيلي لكل مجموعه علي اليوم المشار اليه بعد الحقن (د) مؤامرة من سجل10 تحولت اشاره لوسيفيراز قياس لكل ماوس علي مدي التجربة. (ه) المؤامرة مبعثر مع متوسط (خط الصلبة) لسفوح كل الماوس في D (n = 6 ل sh-السيطرة و 8 ل mRPA3-431). تم اختبار اهميه الاحصائيه باستخدام اختبار t الطالب; * p ≤ 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: القياس الكمي للنقائل الفلورية يكشف عن ان RPA3 ضربه قاضيه تمنع الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق لخلايا سرطان الثدي. (ا) الفلورسنت (اليسار) والصورة الساطعة (اليمين) من الفصوص التمثيلية من كل الماوس حقن في الشكل 2 21 يوما بعد الحقن. [استروركس] أشار (*) خضراء [اوتونيون] قصبه هوائيه. (جيم-هاء) تم استخدام برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) لتحديد وقياس الكائنات باستخدام عتبه شده من 25 إلى 100 وعتبه حجم 0.01 مم2 إلى ما لا نهاية. (ب &Amp; ج) مخطط مبعثر مع متوسط (شريط الصلبة) من العدد الإجمالي للنقائل في الرئتين من كل ماوس عند احتساب (B) بواسطة برنامج تحليل الصور (C). (د) يتم رسم المساحة الاجماليه (مم) الرئة التي تم قياسها باستخدام برمجيات تحليل الصور كعبء منتشر مع المتوسط المشار اليه بواسطة شريط صلب. (ه) يتم رسم حجم كل الانبثاث لكل ماوس. ويشار الفئران التحكم من قبل النقاط الزرقاء والفئران mRPA3 ضربه قاضيه من النقاط الحمراء. ملاحظه ، يتم فصل شريط مقياس في 1 ملم لجعله أسهل لتصور حجم وعدد الانبثاث الصغيرة (n = 6 sh-السيطرة ، 8 mRPA3-431). تم اختبار اهميه الاحصائيه باستخدام اختبار t الطالب; p = 0.06 ؛ * * p ≤ 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ياب/تاز الضربة القاضية يقلل من العبء المنتشر سرطان الثدي. (ا & ب) خلايا 4t1 تعبر بثبات عن التحكم القائم علي miR30 (mcherry) أو ترادفية ياب/تاز شراناس (mYAP1/mTAZ6) تم تحليلها بواسطة التحاليل الغربية لطخه (ا) أو نقلت مع ياب/تاز-tead لوسيفيراز مراسل بناء والمؤيدة للنشاط ياب/تاز-tead الحركية كما هو موضح سابقا15,16 (B) (n = 5 للسيطرة و 4 لYAP1/TAZ6). (ج) عرض تخطيطي يبين كيفيه توليد الخلايا للدراسة المجرية. وقد أصيبت الخلايا 4T1-Luciferase مع الفيروسات الرجعية التي تقدم ZsGreen واما miR30 شرينا استهداف mCherry (السيطرة) أو جنبا miR30 شراناس استهداف كل من mYAP و mTAZ. تم اختيار الخلايا المصابة في Puromycin (2.5 ميكروغرام/مل) لمده 3 أيام. 4T1-luciferase الخلايا التي تعبر بثبات ZsGreen والسيطرة (sh-mCherry) أو ياب/تاز (mYAP1/mTAZ1) وبعد ذلك تم حقن شراناس في الفئران والاجنه للبريق البيولوجي من قبل في الأيام التي تم حقنها. (د &Amp; ه) الصور البيولوجية للماوس التمثيلي لكل مجموعه علي الحقن بعد اليوم المشار اليه. (و) مؤامرة من السجل10 تحويل الاشاره لوسيفيراز قياس لكل ماوس علي مدي التجربة. (ز) مخطط مبعثر مع متوسط (شريط الصلبة) لسفوح كل الماوس في F (n = 7 ل sh-السيطرة و 8 ل mRPA3-431). يشار إلى الوسط بخط صلب. تم اختبار اهميه الاحصائيه باستخدام اختبار t الطالب; p = 0.06 ؛ # ، p ≤ 0.01 ؛ ***. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: ياب و تاز مطلوبان لخلايا سرطان الثدي المنتشرة لاستعمار الرئتين. (ا) الفلورسنت (اليسار) والصورة الساطعة (اليمين) من الفصوص التمثيلية من كل ماوس حقن في الشكل 4 21 يوما بعد الحقن. (جيم-هاء) تمت معالجه الصور باستخدام برنامج تحليل الصور كما هو موضح في الشكل 3. (ب &Amp; ج) مخطط مبعثر مع متوسط (شريط الصلبة) من العدد الإجمالي للنقائل في الرئتين من كل ماوس عند احتساب يدويا (B) أو عن طريق برنامج تحليل الصور (C). (د) تم قياس المساحة الاجماليه لجميع النقائل (مم) باستخدام برامجيات تحليل الصور ورسمت كعبء منتشر مع المتوسط (شريط صلب). (ه) يتم رسم حجم كل الانبثاث لكل ماوس. يشار إلى الفئران التحكم من قبل النقاط الزرقاء و mYAP1/mTAZ6 الفئران الضربة القاضية بالنقاط الحمراء. ملاحظه ، يتم فصل شريط مقياس في 1 ملم لتصور أفضل حجم وعدد الانبثاث الصغيرة (n = 7 sh-السيطرة ، 8 mYA1/mTAZ6). يشار إلى الوسط بخط صلب. تم اختبار اهميه الاحصائيه باستخدام اختبار t الطالب; * p ≤ 0.05 ، * * ، p ≤ 0.01 ؛ **. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: جدول المتجات. يتم سرد كافة المتجات المستخدمة ويتم وصف المتجات الجديدة. وقد استخدمت تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية لاستنساخ ناقلات جديده ويتم تضمين متواليات لوصفها حديثا 97-مير شرينا. الاستشهادات تشير إلى: [1]53، [2]16، [3]54الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2 التكميلي: مثال لمعالجه بيانات الصور الحيوانية الحية وتحليلها. جدول بيانات يوضح كيف يتم تحويل البيانات الخام من الصور الحيوانية الحية في المجري للتحليل كما هو موضح في الخطوات 6.7 و 6.8. البيانات الخام التي تم الحصول عليها من الجسم الحي في التصوير الحيواني تحولت باستخدام سجل10 التحول. يتم حساب معدل التغيير في العبء المنتشر لكل ماوس عن طريق حساب الميل الذي تم إنشاؤه بواسطة السجل10 تحويل البيانات. وتشمل الامثله تحليل لوسيفيراز من الشكل 2. الاعمده مرمزه بألوان للاشاره إلى البيانات التي تم استخدامها لإنشاء كل قيمه ميل والصيغ التي تم وضعها في الجدول. سيؤدي النقر المزدوج فوق البئر إلى الكشف عن الصيغة المستخدمة لمعالجه البيانات. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الهامه للأسلوب
من الاهميه بمكان لتحسين عدد الخلايا التي تم حقنها (الخطوة 3) لخط خليه معينه وسلاله الماوس لان هذا يمكن ان تؤثر بشكل كبير علي عدد الانبثاث التي تشكل وطول التجربة. إذا تم حقن خلايا كثيره جدا أو الانبثاث تنمو لفتره طويلة جدا ، قد يكون من الصعب علي الانبثاث العد مما يجعل من الصعب تقييم اثار التلاعب الوراثية. ومع ذلك ، إذا تم حقن عدد قليل جدا من الخلايا ، قد تكون قليله أو لا توجد الانبثاث. التالي ، ينبغي اجراء تجربه أوليه باستخدام اعداد مختلفه من الخلايا لتحديد العدد الأمثل وطول الوقت الذي تنمو فيه النقائل. لضمان اعداد ثابته من الانبثاث داخل مجموعه ، فمن المهم حقن اعداد متساوية من الخلايا القابلة للحياة في كل ماوس. وبما ان الخلايا يمكن ان تستقر في كل من الأنبوب والحقنه ، يجب أعاده تعليق الخلايا برفق قبل تحميل الحقنه ، ولا ينبغي ترك تعليق الخلية في الحقنه لفتره طويلة جدا (الخطوة 4.3.2). بقاء الخلية يقلل من فتره أطول الخلايا في التعليق ، التالي فان مقدار الوقت بين التريسينزيشن وحقن الخلايا يجب ان يكون هناك أكثر من ساعة واحده (خطوه 4.2.5). لا ينبغي حقن فقاعات الهواء وكتل كبيره من الخلايا لان هذه يمكن ان يسبب الصمات التي تقتل الماوس. الاضافه إلى ذلك ، يمكن رسم الخلايا من خلال الابره القص لهم ، التالي فان الحقنه يجب ان تكون محمله دون الابره. للتاكد من انه تم حقن عدد متساو نسبيا من الخلايا ، في الجسم الحي يمكن ان تؤخذ الصور الحيوانية مباشره بعد وقت قصير من الحقن (الشكل 2ب، الشكل 4د).

ويعد القياس الدقيق والمتسق للاشاره البيولوجية الهادئة أمرا مهما ويعتمد علي الخلايا التي تتناول واستقلاب ال د-لوسيفيين. وهذا يمكن ان يتاثر بالعديد من المتغيرات بما في ذلك ، جرعه D-luciferin ، توقيت الحقن ، ودرجه حرارة الجسم الماوس ، وكيف تخدير الماوس عند حقن ، وكيف يتم وضع الماوس في غرفه التخدير قبل التصوير. ولذلك ، فمن المهم للحفاظ علي هذه الخطوات متسقة لجميع الفئران وجلسات التصوير. استخدمنا لوحه التدفئة للحفاظ علي درجه حرارة الجسم الماوس متسقة في حين في غرفه التخدير. وبما ان الاشاره يجب ان تخترق الانسجه للكشف عن كل من الكشف الحراري والفلوري ، فمن المهم أيضا الحفاظ علي وضعيه الماوس متناسقة لكل صوره (مسطحه علي ظهرها يعمل بشكل أفضل لتصوير الرئتين). يجب ان يتم القياس الكمي للصور الفلورية من الصور الحية للحيوانات باستخدام وحدات الكفاءة% لان هذا يسمح بالمقارنة المناسبة بين الصور. المثل ، ينبغي دائما استخدام التدفق الكلي (الفوتونات/الثانية) عند القياس الكمي للصور البيولوجية الهادئة. لتحليل العبء المنتشر ، تحويل سجل10 تحويل منحني النمو (قبل الوصول إلى الحد الأقصى للاشاره) إلى مؤامرة خطيه ، والتي كانت ضرورية لتحليل المنحدر.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من الأسلوب
في ال يقدم بروتوكول [ا] الالسكان الخلايا يكون اولي [ستبلي] مع بروتين فلورية و [لوسيفيتاز], بعد ذلك ان السكان يكون محوله مع اما تحكم متجهة أو متجهة يستهدف المورثة الفائدة. وهذا يضمن ان كلا من السكان الخلية لديهم بروتين فلوري مماثله والتعبير لوسيفيراز. ومع ذلك ، وكبديل لذلك ، يمكن استخدام النواقل الفيروسية التي توفر في نفس الوقت اثنين من هذه المكونات. في الواقع ، في التجارب التمثيلية استخدمنا ZsGreen التعبير عن ناقلات الفيروسات العكوسه للتعبير عن شراناس في الخلايا 4T1-luciferase. فمن المستحسن ان التعبير عن لوسيفيراز والبروتين الفلوري يكون التهاوي في جميع مجموعات الخلايا بعد ان يتم تغيير جين الفائدة. مستويات مختلفه من التعبير بين المجموعات يمكن ان تعقد تفسير البيانات ، لذلك فمن الأفضل إذا كانت المجموعات المختلفة لديها تعبير مماثل من كل من البروتين الفلوري و luciferase. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تكون خلايا الدم الحمراء تلقائية الفلورسنت وقد تجعل من الصعب تصور الانبثاث الفلورسنت في الرئتين. إذا كانت هذه هي الحالة ، يمكن مسح خلايا الدم الحمراء من الرئتين عن طريق التطهير الذاتي اثناء القتل الرحيم للحد من خلفيه الفلورسنت (ينبغي اتباع تقنيات القتل الرحيم المناسبة والمبادئ التوجيهية). علي الرغم من ان الاختلافات بين السيطرة والضربات القاضية المجموعات في تجاربنا التمثيلية مثيره ، والكامنة الماوس إلى الماوس التباين التي غالبا ما توجد في في الجسم الحيوي اختبارات الانبثاث هو واضح في الفئران التحكم (الشكل 3ب والشكل 5ب). عندما يكون هذا التباين مرتفعا ، فانه يمكن ان تجعل من الصعب تحديد حجم تاثير ضربه قاضيه. ومن النهج البديلة التي يمكن استخدامها للحد من هذا التباين هو تسميه خلايا التحكم والخلايا الضربة القاضية مع البروتينات الفلورية متميزة والانزيمات لوسيفيراز متميزة ومن ثم تخلط بين السكان اثنين في اعداد متساوية وحقن الخليط. علي سبيل المثال ، يمكن مزج خلايا التحكم التي تعبر بثبات عن الطماطم والتي لا يمكن خلطها مع الخلايا المقلدة التي تعبر عن zsgreen و لوسيفيراز اليراع. في الجسم الحي أجهزه التصوير الحيواني يمكن ان يميز renilla لوسيفيراز من اللوسيفيراز اليراع ، والطماطم من zsgreen ، لذلك اما مضان أو التلالؤ يمكن استخدامها لقياس كل السكان الخلية بشكل مستقل. في الواقع ، تم التدليل علي التصوير المزدوج لوسيفيراز من خلايا 4t1 المتزايدة كاورام الاوليه في الكائنات الحية باستخدام الحية في جهاز التصوير الحيواني حيه4. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ انه قد يكون هناك تداخل في اشاره الفلورسنت ، التالي ينبغي ان تدرج في هذا النهج خطوه الخلط الطيفي (انظر المبادئ التوجيهية للمصنعين). بالاضافه إلى ذلك ، يجب ان يكون المصابون بالنقاء الضوئي والنبات القابل للكشف بشكل منفصل مع التاخير الزمني الكافي الذي يسمح للاشاره الاولي لوسيفيراز لم يعد يمكن كشفها قبل التصوير في الثانية. استخدام الفلوروبيورس متميزة لا يزال يتيح عدد وحجم الانبثاث في الرئتين إلى ان كمي16. لاختبار الاستعمار المنتشر والنمو في الاجهزه الأخرى إلى جانب الرئتين يمكن تعديل هذا البروتوكول واستخدامه لحقن الوريد الوريدي والمدخل9,10.

قيود الأسلوب
باستخدام الحية في جهاز التصوير الحيواني حيه للحصول علي الوقت الحقيقي العبء المنتشر بالاقتران مع الخلايا السرطانية فلوريسسينتلي المسمي يوفر وسيله قويه لفحص الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق. ومع ذلك ، هناك قيود علي هذا النهج. قد تكون هناك حاجه إلى بعض الجينات لتكاثر الخلايا الفطرية بدلا من ادوار محدده في الانبثاث. في المختبر يمكن ان يتم اختبارات انتشار الخلايا قبل التجربة في الجسم المجري لتحديد ما إذا كان الجين يعطل النمو في المختبر. عند تصوير الحيوانية الحية ، يجب ان تكون الاشاره الحرارية أو الفلورية من النقائل قويه بما يكفي للمرور عبر الانسجه. بالاضافه إلى ذلك ، فان الخواص البصرية (اي الامتصاص والتشتت) للانسجه تؤثر أيضا علي الكشف55. مصدر الضوء الاثاره يجب ان تكون قادره علي تمرير من خلال الانسجه لتثير فلوريسسينتلي الخلايا السرطانية المسمية والتلالؤ الإحيائي لديه مجموعه ديناميكية أكبر من فلوري. التالي ، علي الرغم من انه يمكن استخدام الفلورية للتصوير الحيواني الحي ، يفضل التلالؤ الإحيائي للكشف عن الاشاره في الأعضاء الداخلية. بالاضافه إلى ذلك ، قد ترفض بعض سلالات الماوس المناعية الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية. في الواقع ، وجدنا ان الخلايا التي تعبر عن الطماطم ، GFP ، أو mCherry رفضت أو انخفضت تنظيم فلوكوفيري عند النمو في الفئران BALB/c (البيانات لم تظهر و15). ومع ذلك ، كما هو موضح هنا (الشكل 3 والشكل 5) وسابقا15،16، zsgreen المسمي الخلايا هي قابله للكشف في هذه الفئران. في الحالات التي يصبح فيها تعبير البروتين الفلوري غير قابل للكشف ، هناك طريقه أخرى لقياس الاستعمار النسبي المنتشر هي استخدام qPCR لقياس الجينات الفلورية أو جين آخر في المتجه الفيروسي المتكامل15. علي الرغم من ان الحية في جهاز التصوير الحيواني يعيش يسمح لك للكشف عن التغيرات في العبء المنتشر ، فانه لا يسمح لأحد لتحديد ما إذا كانت هذه التغييرات بسبب تغيير حجم أو عدد من الانبثاث. كما انه لا يوفر معلومات مكانيه حول موقع الانبثاث. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان تتاثر قوه الاشاره بمدي عمق الانسجه.

اهميه الأسلوب والتطبيقات المستقبلية المحتملة
هناك العديد من الطرق التي يمكن من خلالها تعديل هذا النهج للحصول علي معلومات أكثر أو مختلفه. ويمكن استخدام مجموعه متنوعة من خطوط الخلايا السرطانية بما في ذلك خطوط الخلايا السرطانية البشرية أو المرضي xenografts المستمدة في هذا الفحص. ويمكن أيضا ان تستخدم نماذج الماوس الأخرى ، بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية المصممة لاختبار كيفيه استهداف البروتينات التي تقدمها الخلايا اللحمية يؤثر علي الاستعمار المنتشر ونمو الخلايا السرطانية المحقونة. إذا كان هناك العديد من الجينات المرشحة للاختبار ، وهذا النهج يمكن ان يكون متعدد الإرسال لأنه في الجسم الحي أجهزه التصوير الحيواني يمكن الكشف عن والتمييز بين مجموعه واسعه من الفلوروبيورس. وهذا من شانه ان يقلل من عدد الفئران المطلوبة وزيادة عدد الأهداف التي يمكن اختبارها. في الجسم الحي يمكن أيضا ان يقترن التصوير الحيواني مع الاشعه السينية أو CT9 التصوير لتوفير قدر كبير من المعلومات المكانية حول موقع الانبثاث. وأخيرا ، يمكن تعديل هذا النهج لفحص خطوات أكثر تحديدا داخل سلسله الاستعمار المنتشر. علي سبيل المثال ، يمكن تمييز الخطوات المتضمنة في بذر الخلايا السرطانية (أوعيه البقاء علي قيد الحياة ، تسرب ، وبعد البقاء علي قيد الحياة تسرب) عن طريق تحديد عدد الخلايا السرطانية في الرئتين في عده نقاط زمنيه خلال الأيام الثلاثة الاولي بعد الحقن (مثل القيام به هنا16). في هذه الحالة ، يمكن أيضا ان تكون ملطخه الرئتين مع علامات الاوعيه الدموية و تصوير ex السابقة لتحديد النسبة المئوية للخلايا السرطانية التي خارج في كل وقت نقطه56،57.

وباختصار ، فان استخدام في الوقت الحقيقي في الجسم الحية التصوير الحيواني للخلايا السرطانية الفلورسنت والاناره بعد حقن الوريد الذيل يتيح تحليل أكثر تفصيلا لكيفيه الجينات المرشح أو الجينات تؤثر علي الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق. هذا النهج هو أسرع واقل تكلفه من نماذج الماوس أصلي ويتجنب بعض المحاذير من نماذج الانبثاث العفوية. ان استخدام كل من الفلورية والتلالؤ كوسيلة للكشف عن النقائل وقياسها يعطي الباحثين امكانيه القراءة المستقلة التي تحسن الثقة في النتائج وتسمح بالمرونة في التصميم التجريبي. استخدام فلوري لقياس حجم الانبثاث وعدد يتجنب الحاجة للوقت المستهلكة والمعالجة النسيجية المكلفة وتحليل ، ويسمح لاستخدام إضافي للانسجه كلها. يمكن استخدام البروتوكول مع عدد من التقنيات المختلفة للتلاعب في التعبير أو وظيفة الجينات المرشحة ، مثل RNAi ، التعبير عبر الجينات ، أو التحرير بوساطة كريبر/Cas ، ويمكن أيضا ان تستخدم لاختبار جزيئات صغيره ، وظيفة حجب الأجسام المضادة ، أو غيرها من المركبات العلاجية المحتملة. وكما ذكر أعلاه ، يمكن اجراء العديد من التعديلات البسيطة لتعزيز الفحص وتقديم معلومات اضافيه. هذا النهج هو وسيله مثاليه لتحديد واختبار الجينات الموالية لل المنتشرة التي لديها القدرة العلاجية لعلاج السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

نشكر اميلي نورتون للمساعدة في العدوى الفيروسية والقراءة النقدية للمخطوطة. كما نشكر رايان كاناي علي المساعدة في الحصول علي صور الرئتين والمساعدة في تحليل الصور للنقائل الخضراء في الرئتين. ونشكر موظفي مرفق البحوث الحيوانية علي دعمهم ومساعدتهم في اعداد هذا الفيديو. وكان هذا العمل مدعوما من قبل سوزان g. Komen منحه الوظيفي محفز التي منحت لj.m.l. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

Tags

أبحاث السرطان إصدار 154 4T1 الخلايا نموذج الماوس synجينه الانبثاث الاستعمار المنتشر سرطان الثدي الماوس التصوير الحيواني الحي ذيل الوريد الانبثاث ياب تاز
الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, J. S. A., Feustel, P. J.,… More

Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter