النهج الموصوف يجمع بين اختبارات الانبثاث الوريد الذيل التجريبية مع في الجسم الحية التصوير الحيواني للسماح الرصد في الوقت الحقيقي لتكوين ورم خبيث سرطان الثدي والنمو بالاضافه إلى التحديد الكمي للعدد الانبثاث وحجم في الرئتين.
الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان ، وهناك خيارات علاجيه محدوده للمرضي الذين يعانون من مرض منتشر. تحديد واختبار الأهداف العلاجية الجديدة التي من شانها ان تسهل تطوير علاجات أفضل للمرض المنتشر يتطلب السريرية في نماذج الجسم الطبيعي. يظهر هنا نموذج الماوس المتزامن لسلخ سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق. الخلايا السرطانية المنتشرة محوله بشكل ثابت مع ناقلات الفيروسية ترميز لوسيفيراز اليراع و zsgreen البروتينات. ثم يتم التلاعب بالجينات المرشحة بثبات في luciferase/ZsGreen-التعبير عن الخلايا السرطانية ومن ثم يتم حقن الخلايا في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي لفحص الاستعمار المنتشر والنمو. ثم يستخدم جهاز تصوير في الجسم الحي لقياس التلالؤ الإحيائي أو الفلوري للخلايا السرطانية في الاحياء الحيوانية من أجل قياس التغيرات في العبء المنتشر علي مر الزمن. التعبير عن البروتين الفلوري يسمح عدد وحجم الانبثاث في الرئتين ليتم تحديدها كميا في نهاية التجربة دون الحاجة إلى التقطيع أو تلطيخ النسيجية. يوفر هذا النهج طريقه سريعة وسهله نسبيا لاختبار دور الجينات المرشحة في الاستعمار المنتشر والنمو ، ويوفر قدرا كبيرا من المعلومات أكثر من الاختبارات التقليدية لورم خبيث في الوريد الخلفي. باستخدام هذا النهج ، ونحن نظهر ان الضربة القاضية في وقت واحد من نعم البروتين المرتبطة (ياب) والمنشط المشترك مع عزر PDZ ملزمه (تاز) في خلايا سرطان الثدي يؤدي إلى انخفاض عبء المنتشر في الرئتين وان هذا العبء المخفض هو نتيجة لضعف كبير في الاستعمار المنتشر وانخفاض نمو الانبثاث.
السرطان لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفاة في جميع انحاء العالم1 والانبثاث هو المسؤول عن غالبيه هذه الوفاات2,3. ومع ذلك ، فان الفهم المحدود للأليات الجزيئية التي تحكم الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق أعاق تطوير علاجات فعاله للامراض المنتشرة. ويتطلب تحديد الأهداف العلاجية الجديدة فحصا لاختبار مدي تاثير التعبير المضطرب أو وظيفة الجينات المرشحة علي تكوين الأورام الخبيثة ونموها. بينما نماذج الماوس أصلي لها مزاياها ، فهي تستغرق وقتا طويلا ومكلفه لتوليد ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتحقق من صحة الهدف بدلا من اكتشاف الهدف. نظم نموذج زرع فيها الجينات المرشح هو قلق في الخلايا السرطانية في المختبر ومن ثم يتم تقييم الآثار علي الإمكانات المنتشرة في الجسم المصاب ، هي اقل تكلفه واعلي من الانتاجيه من أصلي النماذج. الاضافه إلى ذلك ، النواقل الفيروسية للتسليم مستقره من RNAi ، CRISPR/كاس 9 ، والجينات هي متاحه علي نطاق واسع ، مما يجعل من السهل نسبيا للاضطراب تقريبا اي جين أو جينات الفائدة في خطوط الخلايا السرطانية. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لفحص دور الجينات المرشحة في الاستعمار المنتشر والنمو في خطوط الخلايا السرطانية البشرية عن طريق زرع الخلايا في الفئران المناعية أو أنسنه.
نوعين من المقايسات المستخدمة لاختبار تشكيل الانبثاث بالخلايا السرطانية المزروعة في الجسم الحيوي هي فحوصات الانبثاث العفوية واختبارات الانبثاث التجريبية. في اختبارات الانبثاث العفوية4،5، يتم حقن الخلايا السرطانية في الفئران ، ويسمح لتشكيل الورم الاولي ، وبعد ذلك تشكيل الانبثاث العفوي والنمو اللاحق يتم التهاوي. قوه هذا النموذج هو ان الخلايا يجب ان تكمل جميع خطوات العملية المنتشرة من أجل تشكيل الأورام المنتشرة. ومع ذلك ، فان العديد من خطوط الخلايا السرطانية لا تنتشر بكفاءة في نماذج الانبثاث العفوية ، وأي تلاعب في الخلايا التي تؤثر علي نمو الورم الاولي يمكن ان نخلط نتائج الفحص الانبثاث. يتم استخدام اختبارات الانبثاث التجريبية ، التي يتم حقن الخلايا السرطانية مباشره في الدورة الدموية ، لتجنب هذه المزالق. وتشمل اختبارات الانبثاث التجريبية الشائعة حقن الوريد الذيل6,7,8 (وأظهرت هنا), حقن داخل الشرايين9, والمدخل الوريد حقن10.
والغرض من البروتوكول المعروض هنا هو توفير اختبار الانبثاث التجريبية التي تسمح للباحث لرصد تشكيل الانبثاث والنمو في الوقت الحقيقي ، وكذلك لقياس نقطه نهاية عدد الانبثاث وحجم في الرئتين من نفس الماوس. لتحقيق ذلك ، يتم الجمع بين التجريبية التقليدية ذيل الوريد الانبثاث الاختبارات6،7،8 مع التصوير الحيواني الحية ، وذلك باستخدام جهاز التصوير في فيفو9،11،12،13،14. الخلايا السرطانية التي تعبر عن كل من لوسيفيراز والبروتين الفلوري يتم حقنها في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي ومن ثم يتم استخدام جهاز التصوير في الجسم المجري لقياس التغيرات في العبء المنتشر في الرئتين مع مرور الوقت (الشكل 1). ومع ذلك ، فان الجهاز الحي في الجسم التصوير الحيواني لا يميز أو يقيس حجم النقائل الفردية. التالي ، في نهاية التجربة ، يتم استخدام مجسم الفلورسنت الفلورية لحساب عدد وقياس حجم الانبثاث الفلورسنت في الرئتين دون الحاجة إلى التماس والانسجه أو مناعي (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار كيفيه تغيير التعبير أو وظيفة الجينات مرشح يؤثر علي تكوين الانبثاث والنمو. يمكن أيضا اختبار المركبات العلاجية المحتملة مثل الجزيئات الصغيرة أو وظيفة حجب الأجسام المضادة.
لإظهار هذا النهج ، قمنا أولا باجراء دليل علي تجربه المفهوم الذي عامل النسخ المتماثل الاساسيه ، النسخ المتماثل البروتين A3 (RPA3) هو طرقت أسفل في خلايا سرطان الثدي الماوس المنتشر. ونحن نظهر ان الفئران حقن مع RPA3 الخلايا الضربة القاضية لديها عبء اقل بكثير المنتشر في كل نقطه زمنيه مقارنه مع الفئران حقن مع خلايا التحكم. ويبين تحليل الرئتين التي تحتوي علي الانبثاث ان هذا العبء المنتشر المنخفض هو نتيجة لانخفاض كبير في الاستعمار المنتشر وضعف النمو في النقائل التي تشكل. لمزيد من التدليل علي هذه التقنية ، اختبرنا ما إذا كانت الضربات المتزامنة للبروتين المرتبط بنعم (ياب) والمنشط المشترك مع عزر الربط PDZ (تاز) يضعف الاستعمار المنتشر أو النمو اللاحق. ياب و تاز هما المنشطات المشتركة ذات الصلة التي هي المستجيبين المصب الحرجة من مسار فرس النهر. نحن15,16 والبعض الآخر قد تورط ياب و تاز في الانبثاث (راجعت في17,18,19), مما يوحي بان هذه البروتينات هي الأهداف العلاجية الجيدة. باستمرار ، وجدنا ان الفئران حقن مع ياب/تاز الخلايا الضربة القاضية قد خفضت بشكل كبير العبء المنتشر. واظهر تحليل الرئتين ان الخلايا الضربة القاضية ياب/تاز شكلت العديد من الانبثاث اقل وان الانبثاث التي لم تشكل أصغر. توضح هذه التجارب كيف تسمح اختبارات الانبثاث التجريبية للباحث بان يختبر بسرعة وبطريقه غير مكلفه دور الجينات المرشحة في تكوين ونمو الورم الخبيث. وتبين أيضا كيف ان الاستخدام المشترك للتصوير الحيواني الحي والتحديد الكمي الفلوري للنقائل في الرئتين كلها يسمح للباحث بفهم الخطوات بشكل أفضل اثناء الاستعمار المنتشر.
الخطوات الهامه للأسلوب
من الاهميه بمكان لتحسين عدد الخلايا التي تم حقنها (الخطوة 3) لخط خليه معينه وسلاله الماوس لان هذا يمكن ان تؤثر بشكل كبير علي عدد الانبثاث التي تشكل وطول التجربة. إذا تم حقن خلايا كثيره جدا أو الانبثاث تنمو لفتره طويلة جدا ، قد يكون من الصعب علي الانبثاث العد…
The authors have nothing to disclose.
نشكر اميلي نورتون للمساعدة في العدوى الفيروسية والقراءة النقدية للمخطوطة. كما نشكر رايان كاناي علي المساعدة في الحصول علي صور الرئتين والمساعدة في تحليل الصور للنقائل الخضراء في الرئتين. ونشكر موظفي مرفق البحوث الحيوانية علي دعمهم ومساعدتهم في اعداد هذا الفيديو. وكان هذا العمل مدعوما من قبل سوزان g. Komen منحه الوظيفي محفز التي منحت لj.m.l. (#CCR17477184).
10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
TBST buffer | For western blot | ||
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
Western transfer buffer | For western blot | ||
XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |