Summary
הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.
Abstract
גרורות הוא הגורם העיקרי של מקרי מוות הקשורים לסרטן, יש אפשרויות טיפוליות מוגבלות עבור חולים עם מחלה גרורתית. זיהוי ובדיקה של מטרות טיפוליות הרומן שיאפשרו פיתוח של טיפולים טובים יותר עבור מחלה גרורתית דורש פרה במודלים vivo. הפגינו כאן הוא מודל העכבר הסינגנטי עבור assaying סרטן השד מושבת גרורות והצמיחה הבאים. תאים סרטניים גרורות הם התמרה באופן בלתי נשכח עם נגיפי וקטורים קידוד גחלילית לוציפראז ו-ZsGreen חלבונים. המועמדים הגנים הם לאחר מכן מניפולציות באופן שולי ב לוציפראז/ZsGreen-ביטוי תאים סרטניים ולאחר מכן התאים מוזרק לתוך עכברים באמצעות וריד זנב לרוחב לתוך מושבת גרורתית וצמיחה. במכשיר הדמיה vivo משמש מכן כדי למדוד את הביולומינציה או הזריחה של תאי הגידול בבעלי חיים לכמת שינויים בנטל גרורתי לאורך זמן. הביטוי של חלבון פלורסנט מאפשר את מספר וגודל גרורות בריאות כדי להיות כמותית בסוף הניסוי ללא צורך במתן הסבר או כתמים היסטולוגית. גישה זו מציעה דרך מהירה וקלה יחסית כדי לבדוק את התפקיד של גנים המועמדים בקולוניזציה גרורתית וצמיחה, ומספק הרבה יותר מידע מאשר מסורתית הזנב גרורות גרואסאומר. באמצעות גישה זו, אנו מראים כי הסתרה בו זמנית של החלבון המשויך כן (לצ) ו הטרנססקריפט שיתוף activator עם מוטיב PDZ-מחייב (TAZ) בתאי סרטן השד מוביל נטל גרורתי מופחת בריאות וכי נטל זה מופחת הוא תוצאה של מושבת גרורתית באופן משמעותי וצמיחה מופחתת של גרורות.
Introduction
הסרטן נשאר הגורם המוביל השני של המוות ברחבי העולם1 גרורות הוא אחראי על רוב מקרי המוות האלה2,3. עם זאת, הבנה מוגבלת של המנגנונים המולקולריים השולטים בקולוניזציה גרורתית והצמיחה הבאה מעכבת את התפתחות הטיפולים האפקטיביים למחלות גרורתית. הזיהוי של מטרות טיפוליות הרומן דורש מבחן כדי לבחון עד כמה מודאג הביטוי או התפקוד של גן מועמד משפיע גרורות היווצרות וצמיחה. בעוד שלדגמי העכבר האוטומטיים יש את היתרונות שלהם, הם צורכים זמן ויקרים להפקת, מה שהופך אותם למתאימים יותר לאימות היעד ולא לגילוי המטרה. מערכות מודל להשתלות שבו הגן המועמד הוא מודאג בתאי הסרטן בתחום החוץ ולאחר מכן השפעות על פוטנציאל גרורתי מוערך ב vivo, הם פחות יקר והתפוקה גבוהה יותר מאשר מודלים autochthonous. בנוסף, וקטורים ויראליות עבור משלוח יציב של RNAi, CRISPR/CAS9, ו transgenes זמינים באופן נרחב, מה שהופך אותו קל יחסית לperturb כמעט כל גן או גנים של עניין קווי תאים סרטניים. גישה זו יכולה לשמש גם כדי לייחס את התפקיד של הגנים המועמדים בקולוניזציה גרורתית וצמיחה בתאי סרטן האנושי על ידי שתילת התאים לתוך מושפע חיסוני או עכברים הומניזציה.
שני סוגים של בחני המשמש לבדיקת גרורות על-ידי תאים סרטניים מושתלים ב vivo הם גרורה ספונטנית וגרורה ניסיוני. ב גרורות ספונטנית אומר4,5, התאים הסרטניים מוזרק לתוך עכברים, מותר ליצור גידול ראשוני, ולאחר מכן היווצרות גרורות ספונטנית הצמיחה הבאה הם החוצה. החוזק של המודל הזה הוא כי התאים חייבים להשלים את כל השלבים של תהליך גרורתי כדי ליצור גידולים גרורתי. עם זאת, הרבה קווי התאים של סרטן אינם גרורות ביעילות במודלים גרורות ספונטנית, וכל מניפולציה של התאים ההשפעות על גידול ראשוני הגידול יכול לבלבל את התוצאות של שיטת גרורות. גרורות ניסיוני, שבו תאים סרטניים מוזרק ישירות לתוך המחזור, משמשים כדי למנוע מלכודות אלה. גרורות נסיוניות נפוצות כוללות את הזרקת וריד הזנב6,7,8 (והפגינו כאן), הזרקת תאיים9, ו הזרקת וריד השער10.
מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לספק vivo גרורות ניסיוני המאפשר חוקר לפקח גרורות היווצרות וצמיחה בזמן אמת, כמו גם לכמת את נקודת הסיום מספר וגודל בריאות של אותו עכבר. כדי להשיג את זה, הניסוי המסורתי וריד הזנב גרורות שאומר6,7,8 משולבים עם הדמיה חיה בעלי חיים, באמצעות מכשיר vivo הדמיה9,11,12,13,14. תאים סרטניים באופן בלתי נשכח הן לוציפראז ו חלבון פלורסנט מוזרק לתוך עכברים דרך הווריד זנב לרוחב ולאחר מכן במכשיר הדמיה vivo משמש למדוד שינויים נטל גרורתי בריאות לאורך זמן (איור 1). עם זאת, המכשיר vivo live הדמיה בעלי חיים לא יכול להבחין או למדוד את הגודל של גרורות בודדות. כך, בסוף הניסוי, stereomicroscope פלורסנט משמש כדי לספור את המספר ולמדוד את הגודל של גרורות פלורסנט בריאות ללא צורך בהענשת היסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה (איור 1). פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבדוק כיצד לשנות את הביטוי או הפונקציה של מועמד גן משפיע גרורות היווצרות וצמיחה. תרכובות טיפוליות פוטנציאליות כגון מולקולות קטנות או נוגדנים לחסימת פונקציות ניתן גם לבדוק.
כדי להדגים גישה זו, ביצעת תחילה הוכחה של ניסוי המושג שבו גורם שכפול חיוני, חלבון שכפול A3 (RPA3) הוא הופל בתאים גרורות בסרטן השד העכבר. אנו מראים כי עכברים שהוחדרו עם RPA3 למטה התאים יש נטל משמעותי פחות גרורתי בכל נקודת זמן לעומת עכברים שהוחדרו עם תאי בקרה. ניתוח של הריאות גרורות מכיל מראה כי זה נטל גרורתי מופחתת היא תוצאה של מושבת גרורתית משמעותית וצמיחה לקויה של גרורות כי הטופס. כדי להמחיש עוד טכניקה זו, בדקנו אם בו להפיל את החלבון המשויך כן (יאפ) ו transcript co-activator עם מוטיב מחייב PDZ (TAZ) פוגע מושבת גרורתית או הצמיחה הבאה. לאחר מכן ו TAZ הם שני הקשורים הטרנססקריפט שיתוף מפעילים כי הם המטה הקריטי של מסלול היפו. אנו15,16 ואחרים יש מעורבים לנבוח ו TAZ ב גרורות (נבדקו17,18,19), הרומז כי חלבונים אלה הם מטרות טיפוליות טוב. באופן עקבי, מצאנו כי עכברים מוזרק עם מיקוד למטה לתאי הנוק/טאז הופחת משמעותית נטל גרורתי. ניתוח של הריאות הראו כי מיקוד למטה את התאים של מלנוק/טאז יצרו הרבה פחות גרורות ושגרורות שעשו צורה היו קטנות יותר. ניסויים אלה מדגימים כיצד גרורות נסיוניות לאפשר לחוקר במהירות ובזול לבדוק את התפקיד של גן מועמד במערך גרורות וצמיחה. הם עוד מראים כיצד השימוש המשולב של הדמיה חיה בעלי חיים וקוונפיקציה פלורסנט של גרורות בריאות שלמות מאפשר לחוקר להבין טוב יותר את השלבים במהלך הקולוניזציה גרורתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כרוך בשימוש בעכברים ובחומרים ביו-מסוכנים ומחייב אישור מוועדות הבטיחות המוסדיים המתאימות. כל המתואר בעבודה vivo כאן הוא אישר על ידי מכללת אולבני המכללה הרפואית בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש (IACUC).
הערה: למבט כולל על פרוטוקול, ראה סכמטי באיור 1.
1. אריזת כל הווירוסים הנדרשים ווירוסים
הערה: הפרוטוקול המתואר משתמש בוקטורים מונגיפיים או בוויראליות לבטא אנזים לוציפראז וחלבון פלורסנט, כמו גם לתמרן את הביטוי של גן מועמד. וירוסים אלה ארוזים בתאי HEK-293FT כמתואר להלן.
- יום 1: צלחת HEK-293FT תאים על 6-צלחות היטב ב 2 מ ל של מדיה צמיחה מלאה (10% FBS ב DMEM זיכרון עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין) כך שהם 40-60% confluent ביום 2. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 לילה.
- יום 2: עבור כל וקטור ויראלי להיות ארוזים, transfect a 40-60% confluent היטב של HEK-293FT תאים עם וקטור retroviral יעיל או הווקטורים המתאימים קידוד המעיל הנגיפי אריזות חלבונים.
הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-VSVG כחלבון הפרווה, psPAX2 עבור אריזות מסיביות ויראליות, ומלא מחסום לאריזה רטרונגיפית (ראה טבלה משלימה 1 עבור רשימה וקטורית). - הפוך תערובת משותפת לכל הטוב כדלקמן:
- לשלב 4 μL של פתרון השומנים עבור הטרנספיטים (ראה טבלת חומרים) ו-96 μl של מאגר הזיהום והדגירה עבור 5 דקות.
- הוסף 1 μg של וקטור ויראלי, 0.5 μg של חלבון מעיל וקטור (VSVG), ו 0.5 μg של אריזות חלבון וקטור (psPAX2 או מחסום-פול) ו דגירה עבור 20 דקות.
- להוסיף בעדינות את תערובת שיתוף החצייה משלב 1.3.2 לתאים HEK-293FT מצופה בשלב 1.1 ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 לילה.
- יום 3: הסר את המדיה המכילה מדיה מתוך כל באר להוסיף בעדינות 2 מ ל של מדיית גדילה מלאה לכל טוב. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור כ 24 שעות.
- יום 4: לאסוף את supernatant ויראלי מכל טוב באמצעות מזרק 3 מ ל ולסנן דרך מסנן 0.45 יקרומטר לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 ml.
- אופציונלי: אם האוסף של אצווה שנייה של וירוס רצוי, להוסיף בעדינות 2 מ ל של מדיית צמיחה מלאה לכל טוב ומודב 37 ° c, 5% CO2 עבור כ 24 שעות.
- יום 5 (אופציונאלי): לאסוף סיבוב שני של סופר ויראלי כמו בשלב 1.5.
הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה על ידי הקפאת הסופרנטאנט הנגיפי.
2. הדור של תאים סרטניים ביטוי לוציפראז וחלבון פלורסנט
הערה: הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לתייג באופן ראשון תאים 4T1 בצורה בלתי ניתנת לשימוש עם גחלילית לוציו חלבון פלורסנט (ZsGreen) באמצעות שני וקטורים עם גנים בחירה ייחודית. ואז וקטורנגיפי 3 משמש כדי לתמרן את הביטוי של גן מועמד. עם זאת, וקטורים ויראליות אשר בו מספקים חלבון פלורסנט ומניפולציה גנטית יכול לשמש גם כחלופה (כמו בניסויים הנציג להלן). תאים סרטניים אחרים ניתן להשתמש, אבל מספרי התאים צריך להיות ממוטב עבור שלבים 2.1 ו 2.7.1.
- צלחת 4T1 תאים בשעה 1.5 x 105 תאים/גם בצלחת 12-היטב במדיה צמיחה מלאה (10% FBS ב dmem עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו 2 מ"מ L-גלוטמין) ו דגירה ב 37 ° צ', 5% CO2 לילה.
- להדביק את התאים 4T1 עם supernatant נגיפי שנוצר בשלב 1 כדלקמן.
- מוחלק את מדיית הגדילה מהתאים ומוסיפים 500 μl של ללוציפראז נגיפי supernatant ו 500 μl של חלבון פלורסנט ויראלי supernatant במקביל להדביק את התאים עם הלוציפראז וגם חלבון פלורסנט ויראלי סופר.
- הוסף 1 μL של 8 מ"ג/מ"ל הקסאדימין ברומיד (ראה טבלת חומרים).
- מודסות את התאים ב 37 ° c, 5% עד 75-90% confluent (בדרך כלל 24-48 שעות).
- טריזיסיזציה של תאים 4T1 עם 500 μL של טריפסין עבור 2-5 דקות (התאים צריכים לשטוף בחופשיות את החלק התחתון של הבאר). להעביר את כל התאים לצלחת 6 ס"מ ב 4 מ ל של מדיה בחירה (הצמיחה המלאה מדיה המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה) ובכך לאשר את הטריפסין. צלחת 6 ס מ של תאי שליטה לא נגועים באותו מדיה בחירה.
הערה: ריכוז אנטיביוטי מתאים יש לקבוע מראש בזמן על ידי בדיקת מספר מינונים. בנוסף, מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית יכול לשמש גם כדי לבחור את התאים בעלי תוויות פלואורוסקופים במקום בחירת סמים. - מודטת התאים ב 37 ° צ', 5% CO2 במדיה בחירה לפצל את התאים בעת הצורך עד כל תאי שליטה שאינם נגועים מתים (תלוי בגנים הבחירה קו התאים).
- ודא כי התאים 4T1 נגועים מבטאים את חלבון הפלורסנט ZsGreen באמצעות עירור ירוק (450-490 ננומטר)/פליטה (500-550 nm) מסנן להגדיר על מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה ב 50-100x הגדלה.
- ודא כי התאים 4T1 נגועים מבטאים לוציפראז באמצעות ערכת פעילות לוציפראז זמין מסחרית כדלקמן.
- השתמש בנפח מינימלי של מאגר לפירוק פסיבי 1x כדי lyse לוציפראז-ביטוי תאים 4T1 ובקרה 4T1 תאים שאינם מבטאים לוציפראז, רועד בעדינות עבור 30 דקות.
- הוסף 20 μl של תא לפני התחתית 96-באר לוחית ולאחר מכן 50 μl של שיטת ללוציפראז מגיב מערכת הפעילות לוציפראז.
- השתמש בקורא לוחית כדי למדוד את האור מן התאים בכל אורכי הגל בספקטרום באמצעות הסביבה הלומינסבית.
הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה על-ידי הקפאת התאים שעברו התמרה באופן בלתי נשכח.
- לטפל בביטוי של הגן המועמד כדלקמן:
- צלחת 6 x 105 מתויג תאים 4T1 משלב 2.6 על הצלחת 60 מ"מ ב 4 מ ל של מדיה צמיחה מלאה דגירה ב 37 ° צ', 5% CO2 לילה.
- מנושף את מדיית הגדילה מכל באר ומוסיפה 2 מ ל של מדיית צמיחה מלאה המכילה 4 μL של 8 מ"ג/mL הקסאדימין ברומיד.
- הוסף 2 מ ל של supernatant ויראלי משלב 1 אל התאים מצופה משלב 2.7.2 ו דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 לילה.
- טריזיסיזציה של תאים 4T1 עם 500 μL של טריפסין עבור 2-5 דקות (התאים צריכים לשטוף בחופשיות את החלק התחתון של הבאר). העבר את כל התאים לצלחת 10 ס מ ב -10 מ ל של מדיית בחירה (מדיית צמיחה מלאה המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה) ובכך מועלת את הטריפסין. צלחת מסוימים שליטה לא נגועה בתווית תאים 4T1 באותו מדיה בחירה.
- מודטת התאים ב 37 ° צ', 5% CO2 במדיה בחירה לפצל את התאים בעת הצורך עד כל התאים שאינם נגועים מתים.
- ודא כי הביטוי של הגן המועמד משתנה באמצעות גישה סטנדרטית כגון כתמי מערבי20 או qpcr21.
- שיטת לומינציה וזריחה כמו בשלבים 2.5-2.6 כדי לקבוע כיצד הם דומים בשליטה ומנוק תאים, כמו זה יכול לשנות (ראה דיון).
הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה על-ידי הקפאת התאים שעברו התמרה באופן בלתי נשכח.
3. אופטימיזציה של העיצוב vivo ניסיוני
- מטב את מספר התא המתאים ומשך הניסוי עבור הנטל הגרורתי הרצוי כדלקמן.
- הרחיבו את התאים הפלואורסצנטי ותאי 4T1 משלב 2.6 במדיית הצמיחה המלאה כך שתאים עודפים זמינים ביום הרצוי של ההזרקה.
- הכינו את התאים לזריקות וריד כמתואר בשלב 4.2. כדי לקבוע את מספר התאים האופטימלי לזריקות, השהה מחדש את התאים בריכוזים שונים במספר 100 μL של 1x PBS.
הערה: אנו ממליצים לבדוק מגוון של מספרי תאים/עכבר מ 25,000 עד 500,000. - השאר את השפני התאים. על הקרח עד הזריקה
- הכנס כל דילול של תאים 4T1 משלב 3.1.2 לתוך 3-4 עכברים דרך הווריד זנב לרוחב תיאר בשלב 4.3 (ראה להלן).
- החזר את העכבר לכלוב שלו ונטר במשך 15 דקות כדי להבטיח החלמה מלאה. עכברים יש לבדוק סימנים של כאב או מצוקה 3 x שבועי.
- עכבר הצג עבור גרורות היווצרות וצמיחה עבור 3-6 שבועות (קו תא ומתח העכבר תלוי) באמצעות vivo חי הדמיה בעלי חיים המכשיר (ראה שלבים 5 ו 6).
- המתת חסד 3-6 שבועות לאחר הזרקת וריד הזנב בהתאם להנחיות מוסדיים סטנדרטיים.
- הכינו את הריאות והערכת גרורות בגודל ובמספר המתואר בשלב 7.
- לבחור את אורך הזמן המתאים עבור גרורות לצמוח על הנטל הגרורתי הרצוי (ראה דיון).
4. הזרקת וריד זנב של תאים סרטניים המסומנים
הערה: שלב 4.2.4 ממוטב עבור תאים 4T1 הגדלים בעכברי באלבי/c syngeneic. אם קווי תאים אחרים של סרטן וזנים העכבר משמשים, מספר התאים הוזרק, ואת אורך השיטת צריך תחילה להיות ממוטבת.
- הרחיבו את קווי התא 4T1 שנוצרו בשלב 2 על 2 15 ס"מ מנות במדיית גדילה מלאה, כך שתאים עודפים זמינים ביום ההזרקה.
- הכן את התאים עבור הזרקת וריד הזנב כדלקמן:
- ולשטוף את לוחיות התאים. עם הערוץ הראשון
- טריזילזציה של התאים עם 5 מ ל של טריפסין לצלחת 15 ס מ עבור 2-5 דקות (תאים צריכים לשטוף בחופשיות את החלק התחתון של הבאר). העבר את כל התאים לשפופרת חרוט. לשטוף את התאים הנותרים מתוך התבשיל תרבות הרקמה עם מדיה צמיחה מלאה מספיק כדי להרוות את טריפסין ולהוסיף את השטיפה לצינור חרוט זהה.
- ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את מספר התאים הכולל.
- צנטריפוגה את התאים ב 122 x g עבור 3 דקות, לנפח את הסופרנטאנט, ולהשעות מחדש את התאים ב-1X PBS בריכוז הרצוי. כאן, 2.5 x 104 תאים מוזרק לתוך כל עכבר 100 μl של PBS, כך את התאים להשעות מחדש ב 2.5 x 105 תאים/mL. השאר את השפני התאים. על הקרח עד הזריקה
הערה: חשוב להגביל את כמות הזמן בין טריסיזציה של התאים לבין הזרקת הזנב בערך שעה אחת.
- הכנס תאים 4T1 משלב 4.2.5 לתוך עכברים דרך וריד הזנב לרוחב כדלקמן:
- עבודה בשכונה במתקן החי, בעדינות אבל לערבב ביסודיות את התאים על ידי היפוך הצינור או באמצעות מזרק 1 mL כדי לוודא שהם מושעה אחיד. ודא תמיד שהתאים מושעים מחדש לפני טעינת המזרק.
- טען 1 mL-מזרק מנעול עם ההשעיה התא ולגרש בועות אוויר עודפים. מקום של 1/2 אינץ ', 30-מד מחט על המזרק עם שיקוע למעלה ולגרש בועות אוויר.
- מניחים בעדינות את העכבר בתוך הרסן מכרסם.
- הורידים הצדדיים צריכים להיות גלויים ומורחבים. אם לא, לצבוט בעדינות את בסיס הזנב ולטבול את הזנב במי ברז חמים להתרחב ורידים.
הערה: התרחבות הורידים עשויה להיות מושגת גם על ידי הצבת כלוב העכבר תחת מנורת חימום ו/או על גבי כרית חימום. - השתמש במחיקה של אלכוהול כדי לנקות את הזנב. הכנס את המחט לתוך הווריד הזנב, צד משופע למעלה, ולהזריק 100 μL של השעיית תא.
הערה: אם המחט מוכנס כראוי לתוך הווריד, זה צריך בקלות להחליק מעט קדימה ואחורה, ולא צריך להיות התנגדות כאשר הבוכנה נלחץ. זריקות מוצלחות צריך גם לגרום "סומק" שבו הצבע הכחול של הווריד הופך לבן במשך כמה שניות לאחר הזריקה.
- לאט להסיר את המחט באמצעות גזה סטרילי, להחיל לחץ על האתר ההזרקה כדי לעצור דימום.
- החזר את העכבר לכלוב שלו ונטר במשך 15 דקות כדי להבטיח החלמה מלאה. עכברים יש לבדוק סימנים של כאב או מצוקה 3 x שבועי.
- עכבר הצג עבור גרורות היווצרות וצמיחה עבור 3-6 שבועות (קו תא ומתח העכבר תלוי) באמצעות vivo חי הדמיה בעלי חיים המכשיר (ראה שלבים 5 ו 6).
5. ניטור הנטל גרורתי על ידי קרינה פלואורסצנטית עם vivo חי הדמיה חיה המכשיר
הערה: אל תמונה של בעל חיים עבור זריחה עם איתות פעיל זורח.
- אם רק הדמיה ביולומינסנציה, דלג לשלב 6.
- הפעל את המכשיר בvivo חיים הדמיה חיה.
- הגדר את מערכת vivo live הרדמה בעלי חיים על פי הנחיות היצרן לספק בין 1.5% ו 2% isof, לחדר ההרדמה ולחדר ההדמיה.
- העכברים מורדם בעזרת פלואורוסקופים שכותרתו גרורות משלב 4 על ידי הצבת אותם בחדר הרדמה ואספקת 1.5-2.5% isofלאנה.
- פתח את תוכנת התמונה (ראה טבלת חומרים) וכניסה.
- לחץ על לחצן אתחול והמתן לאתחול המחשב.
- שנה את שדה התצוגה ל -D.
הערה: שדה של View C יכול לשמש גם אם יש צורך בתצוגה מקרוב של עכבר, אך פעולה זו מגבילה את מספר העכברים שניתן להציג בו. - לאחר שהתוכנה ציינה שהמצלמה הגיעה לטמפרטורה המתאימה, לחץ על לחצן אשף ההדמיה , בחר באפשרות ' קרינה פלואורסצנטית ' ולאחר מכן בחר את זוג המסננים המתאים מהתפריט הנפתח.
הערה: אם השימוש fluorophore הוא לא אופציה, לבחור קלט EX/EM ו סוג עירור ופליטה נדרש. - מניחים את העכבר בתא כמתואר בשלב 3.2.4.
- לחץ על רכישת רצף.
- לאחר הדמיה, להחזיר את העכבר לכלוב שלו ולנטר במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה.
- חזור על שלב 5.2 ושלבים 5.7-5.9 עם עכבר אחד לפחות שאינו מכיל גרורות. הערה: עכבר זה ישמש לכמת ולהחסיר אות הרקע במהלך ניתוח (שלב 8).
- תמונה 2-3 פעמים בשבוע למשך הניסוי.
6. ניטור הנטל הגרורתי על ידי ביולומינסנציה עם מכשיר הדמיה בעלי חיים vivo חיים
- הפעל את המכשיר vivo live הדמיה בעלי חיים ולהגדיר את התוכנית כדלקמן.
- פתח את תוכנת התמונה (ראה טבלת חומרים) וכניסה. לחץ על לחצן אתחול והמתן לאתחול המחשב. שנה את שדה התצוגה ל -D.
הערה: שדה של View C ניתן להשתמש לתצוגה מקרוב לתמונה גוף העכבר המלא; עם זאת, פעולה זו מגבילה את מספר העכברים שניתן לתמונה בו. - לשימוש בפעם הראשונה, ערוך הגדרות חשיפה כדלקמן: לחץ על עריכה | העדפות | רכישה | חשיפה אוטומטית ולשנות את זמן החשיפה המקסימלי מתוך ברירת המחדל 60 שניות ל 300 שניות ולחץ על OK.
הערה: אל תשנה פרמטרים אחרים בכרטיסיה חשיפה אוטומטית.
- פתח את תוכנת התמונה (ראה טבלת חומרים) וכניסה. לחץ על לחצן אתחול והמתן לאתחול המחשב. שנה את שדה התצוגה ל -D.
- הגדרת מערכת ההרדמה על פי הנחיות היצרן כדי לספק בין 1.5% ו 2% isofלפני חדר ההרדמה ואת חדר ההדמיה.
- ודא שהמצלמה הגיעה לטמפרטורה המתאימה לפני שתמשיך בשלב 6.4.
- גרופי גרורות-המכילות עכברים משלב 4 על-ידי הצבת אותם בחדר הרדמה ואספקת 1.5-2.5% isofלאנה.
- הכינו עכברים לדימות ביולומינסנציה כדלקמן.
- טען a 1 מזרק mL עם D-לluciferin (30 מ"ג/mL ב D-PBS) ולאחר מכן להוסיף 1/2 אינץ ' 30-מד מחט למזרק ולגרש בועות אוויר.
- למדוד ולהקליט את המסה של העכבר מורדם.
- רסן את העכבר על ידי צובט את העורף של הצוואר שלהם באמצעות האגודל ואת האצבעות המצביע ואוחז את הזנב בין אצבע הזרת לבין בסיס היד. היפוך העכבר בזווית 45 מעלות, כאשר ראשו מופנה כלפי מטה.
- הכנס את המחט, הצד המשופעת כלפי מעלה, לחלל השמאלי של העכבר בתוך הצפק (IP). אשר כניסה למרחב ה-IP על-ידי ציור בחזרה של אמצעי אחסון קטן. לא צריך להיות צבע בבסיס של המחט כאשר הציור חזרה במרחב ה-IP.
- הכנס את הנפח המתאים של D-לluciferin עבור מנה של 150 מ"ג/ק"ג.
- מיד לאחר הממשל D-לluciferin, להתחיל טיימר ולמקם את העכבר שטוח על גבו במכשיר הדמיה עם אפו בקונוס האף ולהבטיח כי 1.5-2.5% isofלהיות מנוהל. הציבו חוצצים בין כל עכבר אם הדמיה של עכברים מרובים. ודא שעכברים ממוקמים בשטח שטוח ככל האפשר (כלומר לא נוטה לצד אחד).
- לחץ על תיבות מאיר וצילום ולאחר מכן לחץ על לרכוש בלוח הבקרה של הרכישה.
- לרכוש ברציפות תמונות ביולומינטיות עד שאות השיא מושגת ולהשתמש בתמונה עם האות הביולולומיאלי לניתוח.
- לאחר הדמיה, להחזיר את העכבר לכלוב שלו ולנטר במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה.
- תמונה 2-3 פעמים בשבוע למשך הניסוי.
7. קוונפיקציה של מספר וגודל של גרורות
הערה: משך הזמן שגרורות מורשות לגדול צריך להיקבע עבור כל קו תא ומתח העכבר, והוא יושפעו ממספר התאים שהוזרקו.
- המתת חסד העכברים לפי הנחיות מוסדיים סטנדרטיים.
- לבודד ולהסיר את הריאות מכל עכבר ולשטוף ב-1x PBS כדי להסיר עודף דם.
- הפרד בעדינות את הריאות לאונות.
- לרכוש תמונות של גרורות ZsGreen באונות ב 10x בשדה בהיר וקרינה פלואורסצנטית באמצעות פלורסנט סטריאוסקופ עם מסנן הלהקה GFP (עירור 470/40x).
הערה: שמור על אותה הגדלה ובהירות עבור כל הדגימות. ההגדלה הנמצאת בשימוש עשוי להשתנות בהתאם לגודל, למספר ולבהירות של גרורות, כמו גם לשדה התצוגה המשמש למיקרוסקופ. - השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לכמת את הגודל והמספר של גרורות מן התמונות.
הערה: הפרוטוקול לניתוח תמונה הוא תלוי תוכנה והוא יכול להיות ממוטב עם גידולים מ step3. לחלופין, לספור את מספר גרורות בכל ריאה באופן ידני באמצעות הפלורסנט סטריאוסקופ. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולשלב 8 ניתן לבצע בכל נקודה לאחר שנאספו כל התמונות הvivo.
8. עיבוד וניתוח נתונים מתוך התמונות שנרכשו באמצעות התקן הדמיה בעלי חיים vivo חיים
- פתח את כל קבצי התמונה עבור כל עכבר בתוכנת התמונה.
הערה: השתמש בתמונה עם אות הביולומילוסמלי לניתוח - ודא כי היחידות הן בזוהר עבור נתונים ביולואולונטי ויעילות עבור נתוני פלורסנט על-ידי לחיצה על החץ בקצה השמאלי העליון של חלון התמונה ושינויו ליחידה המתאימה.
- השתמש בתמונה מנקודת הזמן האחרונה כדי ליצור אזור מעניין (ROI) כדלקמן.
- לחץ על רועי כלים בחלון לוח הכלים . הוסף ROI אחד על-ידי לחיצה על החץ ובחירה באפשרות 1.
- לחץ על הגבול של ROI ולהעביר אותו על החזה של העכבר. להתאים את גודל ה-ROI כך שהוא מכסה את החזה של העכבר אינו מוצא את האות.
- לחץ על מדידה של ROIs והעתק או הקלד את המספר הגולמי בגיליון של excel.
הערה: עבור נתונים ביולומסתיים בחר את השטף הכולל (פוטונים/שנייה), שהוא סכום של כל הזוהר ב-ROI. מאז גרורות לא בהכרח לצמוח אחיד, שטף הכולל מועדף על הזוהר הממוצע כי זה מודד את הסכום של הנטל גרורתי. באופן דומה, עבור נתוני פלורסנט, היעילות הכוללת% (פליטת האור (בפוטונים/שנייה)/באור הריגוש (פוטונים/שנייה)) יש להשתמש במקום יעילות ממוצעת. - קליק ימני בקובץ התמונה כדי להעתיק את ROI בשימוש בשלב 8.3 ולהדביק אותו לכל קובץ תמונה.
הערה: כאשר מכמת תמונות פלורסנט, לכמת את אותו אזור על העכבר שהיה בתמונה ללא גרורות. השתמש באות זה כאות הרקע והפחת אותו מכל גרורות פלורסנט המכילות תמונת עכבר שנרכשה. - הזזת ROIs מודבק מעל אותו אזור שנבחר בשלב 8.3.4 עבור כל תמונה וחזור על שלב 8.4.
- התווה ונתח את הנתונים הגולמיים כדלקמן (ראה טבלה משלימה 2).
- בצע יומן רישום10 המרה של הנתונים הגולמיים עבור כל עכבר באמצעות הנוסחה המצוינת (טבלה משלימה 2) והתוויה כמו באיור 2D ואיור 4F. יומן הרישום10 שינוי הטרנספורמציה של עקומת הצמיחה אשר נוטה להיות גיאומטרי וממזער הטרוסטיות.
- באמצעות רגרסיה ליניארית, חשב את השיפוע של הקו המצויד ליומן הרישום10 נתונים שעברו שינוי עבור כל עכבר המותוות בשלב 8.7.1 (טבלה משלימה 2). עיין בנוסחה בטבלה משלימה 2 כדי להתאים לשורה ולחשב את השיפוע בשלב אחד.
- מתווה את הערכים המספריים של המדרונות כמו באיור 2E ואיור 4G. השתמש ב-מבחן t או בכיוון אחד של הסטודנט (עבור יותר מ -2 קבוצות) על המדרונות כדי לקבוע משמעות סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את הגישה הנ ל, ביצעת הוכחת הרעיון של ניסוי שבו גורם שכפול קריטי, RPA3 הופל בתוך מיכל של קרצינומה של הפטמות של העכבר גרורות (4T122). בעוד הפרוטוקול מתאר תיוג התאים עם לוציפראז וחלבונים פלורסנט לפני מניפולציה גנטית, השתמשנו בגישה שונה כי וקטורים RNAi גם לספק ZsGreen (איור 2א). ראשון, התאים 4t1 היו מותמרים באופן בלתי נשכח עם בניית ויראלי לבנות קידוד גחלילית ללוציפראז ו hygromycin ההתנגדות (phage-ללוציפראז-IRES-hygro). לאחר hygromycin בחירה, שיטת לוציפראז בוצעה כדי לאשר ביטוי יציב של גחלילית לוציפראז (איור 2א). בשלב הבא, התאים 4t1-לluciferase היו מותמרים באופן בלתי נשכח עם וקטורים retroviral יעיל כי לבטא zsgreen או שליטה miR30 מבוססת על השליטה, או שרין miR30 מבוסס בעבר הראו ביעילות עכבר היעד RPA316,23,24. התאים הוזרק לאחר מכן לתוך העכברים באמצעות הווריד הזנב לרוחב ו באות vivo bi, נמדד פעמיים בשבוע כדי לפקח על נטל גרורתי (איור 2B, C). יומן הרישום10 האות השתנה עבור כל עכבר הותווה כנטל גרורתי לאורך זמן (איור 2ד) והמדרונות של כל עלילה נקבעו (איור 2E). נתונים אלה מראים את שיעור השינוי בנטל גרורתי מופחת באופן משמעותי עם RPA3 בהשוואה לתאי הבקרה. למרות ההבדלים הם מרשימים, נתונים אלה בלבד אינם מאפשרים לנו לקבוע אם נטל גרורתי מופחת הוא תוצאה של גרורות פחות או עקב צמיחה איטית יותר של גרורות. לכן, הגרורות שכותרתו ZsGreen בריאות נותחו גם בסוף הניסוי. עכברים הזריקו עם RPA3 למטה התאים היו כמעט גרורות בריאות, בעוד עכברים שליטה היו גרורות גדולות רבות (איור 3). יתר על כן, גרורות שעשו הטופס מ RPA3 למטה התאים היו קטנים בבירור מאשר שליטה 4T1 גרורות (איור 3א). תואם את הספירות הידניים שלנו (איור 3ב), ניתוח תמונה התוכנה שנספרו פחות גרורות בתוך RPA3 למטה עכברים (איור 3ג). בנוסף, הנטל הגרורתי הכולל בריאות (סכום האזורים של גרורות במילימטרים) היה גם מופחת באופן דרסטי על ידי RPA3 הסתרה (איור 3ד). לבסוף, את הגודל של גרורות בודדות שנוצרו עכברים RPA3 למטה היו בדרך כלל הרבה יותר קטן מאשר אלה בעכברים בקרה (איור 3E). בנוסף גרורות גדולות בעכברים שליטה, שמנו גם גרורות קטנות רבות גם, אבל לא יכול לקבוע אם אלה הם תאי הגידול שנזרע את הריאה לא לגדול או אם הם תאי הגידול לשפוך מאחד גרורות גדול יותר כי הזרע מחדש את הריאה במיקום חדש (איור 3E). באופן קולקטיבי נתונים אלה מראים כי RPA3 נדרש עבור גרורות היווצרות ידי 4T1 תאים. ממצאים אלה צפויים כי העבודה הקודמת שלנו הראה כי RPA3 להפיל תאים הופחת באופן משמעותי את היכולת ליצור גרורות בריאות לאחר הזרקת וריד הזנב16. עם זאת, ניסוי זה מדגים כיצד להשתמש הדמיה חיה בעלי חיים וכימות פלורסנט של מספר גרורות וגודל ניתן להשתמש כדי לקבוע אם שינויים בנטל גרורתי הם בשל הבדלים מושבת גרורתית או צמיחה.
כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בגישה זו כדי לענות על שאלה רלוונטית יותר ביולוגית, שאלנו אם מדובר ב-, ולאחר מכן, לצורך התיישבות גרורתית והצמיחה הבאה במודל הסינגנטי הזה של סרטן השד. הביטוי והפעילות של לנבוח או TAZ הם גדלו בסרטן רבים בהשוואה לרקמה נורמלית וזה ניבוי של תוצאה של החולה המסכנה25,26,27,28,29. בנוסף, מספר מחקרים יש מעורבים לנבוח, taz, או teads, השותפים קריטי/taz-מחייב שותפים, ב גרורות15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, 41, 42,, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. בהינתן נתונים אלה השתמשנו בגישה שלנו כדי לבדוק אם לנבוח ו TAZ נדרשים עבור גרורות היווצרות וצמיחה. בשביל זה, אנחנו משתמשים וקטור retroviral יעיל המבטא טנדם miR30 מבוססי שרין מיקוד הן לנבוח ו TAZ. כפי שמוצג, זה שרין טנדם באופן יעיל מפחית את ביטוי החלבון מוכן לבטא את ה-TAZ, ואת הפעילות הטרנסגרפית בתאים 4T1 (איור 4א, ב). 4t1-לוציפראז תאים היו מותמרים באופן בלתי נשכח עם גרסה zsgreen ביטוי של וקטור זה טנדם/TAZ מרין miR30 או שליטה מבוסס מרין (איור 4ג) ולאחר מכן לאחר מכן על ידי זריקות וריד הזנב ב-syngeneic balb/C עכברים. כפי שמוצג באיור 4, הקצב שבו נטל גרורתי גדל היה מהיר יותר בעכברים הזריקו בתאי בקרה בהשוואה לעכברים שהוחדרו עם מיקוד התאים (איור 4D-F). גרורות פחות משמעותית שנוצרו בעכברים שהוחדרו עם מיקוד התאים של העכבר, בהשוואה לעכברים עם תאי שליטה בין אם נספרות באופן ידני (איור 5A, B) או באמצעות תוכנת ניתוח התמונה (איור 5ג). לא רק הרבה יותר בצורת גרורות בעכברי השליטה, אבל הם היו בדרך כלל גדולים יותר (איור 5E). בעקביות, את הנטל הגרורתי בריאות (אזור גרורות כולל mm) היה גם מופחת באופן דרסטי על ידי מיקוד למטה (איור 5ד). חשוב לציין כי כאשר גרורות הן גדולות וקרובות, התוכנה עלולה להיות מסוגלת להבדיל גרורות נפרדות. זה היה המקרה עבור כמה גרורות בעכברים שליטה (עכבר 3 ועכבר 7). לכן, חשוב לבדוק את הפלט של תוכנת ניתוח התמונה כדי להבטיח שהוא מדידה במדויק את האזור של גידולים בודדים. זו גם הסיבה שבגללה חשוב למטב את מספר התאים המוזרקים ואת אורך הניסוי. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים כי ב-, ו TAZ נדרשים לקיים את הקצב שבו נטל גרורתי עולה במודל מורגימית של סרטן שד גרורתי וכי זה בשל חוסר היכולת של גרורות לצורה וצמיחה מופחתת של גרורות כמה שעשו טופס.
איור 1: סכימטי של הפרוטוקול. כל הווירוסים הדרושים ארוזים לראשונה בתאי HEK-293FT. התאים הרצויים עבור המחקר הם בו נגועים בו לוציפראז ווירוסים פלורסנט שכל אחד לבטא גן ייחודי בחירת התרופה היונקים. תאים נגועים מורחבים לאחר מכן במדיה המתאים המכיל את שתי התרופות כדי לבחור לתאי התמרה באופן בלתי נשכח המבטא הן לוציפראז וחלבון florescent. ביטוי של שתי התוויות מאושר כמתואר בפרוטוקול. התאים המסומנים לאחר מכן מתתמרים עם וירוס שלישי המכיל מניפולציה גנטית (miR30,) ו גן שלישי בחירת סמים ייחודי. לאחר הבחירה עם התרופה השלישית, התאים מוזרק לתוך העכברים דרך הווריד זנב לרוחב. נטל גרורתי מפוקח בעכברים לאורך הניסוי עם מערכת vivo חיה הדמיה חיה. בסוף הניסוי, עכברים מורדמים, ותמונות של הריאות כולו נלקחים באמצעות מיקרוסקופ מבתר פלורסנט, ולאחר מכן משמש למדוד את מספר וגודל של גרורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: לוציפראז מבוסס בvivo חי הדמיה בעלי חיים מראה כי RPA3 מפחית את נטל גרורתי של סרטן השד. (A) סכמטי מראה איך התאים נוצרו עבור זה במחקר vivo. התאים 4t1 היו מותמרים באופן מאוד עם קידוד וירוס ללוציפראז ו hygromycin התנגדות. תאים נגועים נבחרו עם 600 μg/mL של hygromycin B לשבוע ולאחר מכן לוציפראז הפעילות נמדדה ההורים או 4t1-ללוציפראז באמצעות ערכת הכתב לוציפראז וקורא צלחת (n = 1 ניסוי עם שכפול בארות בממוצע). 4T1-לוציפראז תאים נדבקו וירוס כי לספק ZsGreen ו miR30 מטרה מיקוד או mCherry (שליטה) או mRPA3. בחירה Puromycin (2.5 μg/mL) במשך 3 ימים שימש לבחירת שילוב יציב של הווירוס. (ב-ה) 4t1-לוציפראז תאים באופן מאוד ביטוי ZsGreen ובקרה (sh-מדובדבן) או mRPA3 (Sh-mRPA3-431) מרין הוזרק לתוך עכברים והתמונה עבור biלומינסנציה על הימים המצוינים כמתואר בפרוטוקול. (ב &Amp; ג) תמונות ביולומילטיות עבור עכבר מייצג של כל קבוצה על הזרקת היום המצוין (D) העלילה של יומן הרישום10 השתנה לוציפראז מנמדד עבור כל עכבר במהלך הניסוי. (E) פיזור העלילה עם ממוצע (קו מלא) עבור המדרונות של כל עכבר D (n = 6 עבור sh-שליטה ו 8 עבור Sh-mRPA3-431). משמעות סטטיסטית נבדקה באמצעות מבחן t של סטודנט; * p ≤ 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קוונפיקציה של גרורות הפלורסנט חושף כי RPA3 מונע התיישבות גרורתית והצמיחה הבאים של תאים סרטניים בשד. (A) פלורסנט (משמאל) ו ברייטפילד (מימין) תמונות של האונות הנציג מכל עכבר מוזרק באיור 2 21 ימים לאחר ההזרקה. כוכביות (*) הצביעו על ברוקצ ' פלורסנט ירוק אוטומטי. (C-E) תוכנת ניתוח תמונה (ראה טבלת חומרים) שימש כדי לזהות ולמדוד אובייקטים באמצעות סף עוצמה של 25 אל 100 ואת סף גודל של 0.01 מ"מ2 אל אינסוף. (ב &Amp; ג) פיזור מזימה עם ממוצע (בר אחיד) של המספר הכולל של גרורות בריאות של כל עכבר כאשר הם נספרים (ב) על ידי תוכנת ניתוח תמונה (C). (ד) השטח הכולל (mm) של הריאה שנמדד עם תוכנת ניתוח תמונה מותווים כנטל גרורתי עם הממוצע המצוין על ידי בר מלא. (ה) גודלו של כל גרורות מותווים עבור כל עכבר. עכברים שליטה מצוינים על ידי הנקודות הכחולות ו mRPA3 מלמטה עכברים על ידי נקודות אדומות. הערה, סרגל קנה המידה מופרד ב-1 מ"מ כדי להקל על הדמיה של גודל ומספר גרורות קטנות (n = 6 sh-שליטה, 8 sh-mRPA3-431). משמעות סטטיסטית נבדקה באמצעות מבחן t של סטודנט; p = 0.06; * * p ≤ 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הסתרה מפחיתה את הנטל הגרורתי של סרטן השד. (A & ב) 4t1 תאים באופן מאוד מביע בקרה מבוססת miR30 (מצ) או טנדם/TAZ מרין (sh-mYAP1/mTAZ6) נותחו על ידי ניתוח כתמי אבןהמערבי (A) או העברה עם בניית הכתב לוציפראז והמאייד ל-YAP1/taz-tead בפעילות הטרנססקריפט כמתואר בעבר15,16 (ב) (n = 5 עבור בקרה ו-4 עבור מTAZ6). (ג) סכמטי מראה כיצד התאים נוצרו עבור המחקר vivo. 4t1-לוציפראז תאים נדבקו רטרווירוסים כי לספק zsgreen או miR30 מטרה מיקוד של מצ (שליטה) או טנדם miR30 מיקוד המיקוד הן myap ו mcherry. תאים נגועים נבחרו ב Puromycin (2.5 μg/mL) במשך 3 ימים. 4T1-לוציפראז תאים באופן מאוד ביטוי ZsGreen ובקרה (sh-mCherry) או לנבוח/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ1) מוזרקים אז לתוך עכברים ולאחר מכן התמונה עבור biלומינסנציה על ידי בימים המוזרקים. (D &Amp; E) תמונות ביולומילטיות לעכבר מייצג של כל קבוצה בהזרקה ביום ההודעה שצוינה. (ו) העלילה של יומן הרישום10 הופך לוציפראז האות נמדד עבור כל עכבר במהלך הניסוי. (ז) פיזור מגרש עם ממוצע (בר מלא) עבור המדרונות של כל עכבר בפה (n = 7 עבור sh-שליטה 8 עבור sh-mRPA3-431). ממוצע מצוין על-ידי קו מוצק. משמעות סטטיסטית נבדקה באמצעות מבחן t של סטודנט; p = 0.06; , p ≤ 0.01; ***. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: יש לחפש ו TAZ כדי ליישב את הריאות בתאי סרטן שד גרורות. (A) פלורסנט (משמאל) ו ברייטפילד (ימין) תמונות של האונות הנציג מכל עכבר מוזרק באיור 4 21 ימים לאחר ההזרקה. (C-E) תמונות עובדו עם תוכנת ניתוח תמונה כמתואר באיור 3. (ב &Amp; ג) פיזור התוויה עם ממוצע (בר מלא) של המספר הכולל של גרורות בריאות של כל עכבר כאשר נספר באופן ידני (ב) או על ידי תוכנת ניתוח תמונה (ג). (ד) השטח הכולל של כל גרורות (mm) נמדד עם תוכנת ניתוח תמונה והתווה כנטל גרורתי עם ממוצע (בר מלא). (ה) גודלו של כל גרורות מותווים עבור כל עכבר. עכברים שליטה מצוינים על-ידי הנקודות הכחולות ו-sh-mYAP1/mTAZ6 להוריד עכברים על ידי נקודות אדומות. הערה, סרגל קנה המידה מופרד ב 1 מ"מ כדי להמחיש טוב יותר את גודל ומספר גרורות קטנות (n = 7 sh-שליטה, 8 sh-mYA1/mTAZ6). ממוצע מצוין על-ידי קו מוצק. משמעות סטטיסטית נבדקה באמצעות מבחן t של סטודנט; * p ≤ 0.05, * *, p ≤ 0.01; **. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: טבלה של וקטורים. כל הווקטורים הנמצאים בשימוש רשומים וקטורים חדשים מתוארים. טכניקות סטנדרטיות לביולוגיה מולקולרית שימשו לשכפול וקטורים ורצפים חדשים עבור תיאר 97-mer החדש כלולים. אזכורים מתייחסים ל: [1]53, [2]16, [3]54נא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן.
טבלה משלימה 2: דוגמה של vivo חיה עיבוד נתונים הדמיה וניתוח. גיליון אלקטרוני הממחיש כיצד הנתונים הגולמיים מתמונות בעלי החיים vivo חיים מומרים לניתוח כמתואר בשלבים 6.7 ו-6.8. נתונים גולמיים שנרכשו הדמיה בעלי חיים vivo live השתנה באמצעות יומן10 המרה. שיעור השינוי בנטל גרורתי מחושב עבור כל עכבר על-ידי חישוב השיפוע שנוצר על-ידי יומן הרישום10 נתונים שעברו טרנספורמציה. דוגמאות כוללות ניתוח לוציפראז מאיור 2. העמודות מסומנות בצבע כדי לציין את הנתונים ששימשו להפקת כל ערך מדרון והנוסחאות משמשות לשימוש בגיליון האלקטרוני. לחיצה כפולה על הבאר תחשוף את הנוסחה המשמשת לעיבוד הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים של השיטה
זה קריטי כדי לייעל את מספר התאים המוזרקים (שלב 3) עבור קו תא נתון ומתח העכבר כמו זה יכול להשפיע מאוד על מספר גרורות כי הטופס ואת אורך הניסוי. אם תאים רבים מדי מוזרק או לגדול גרורות במשך זמן רב מדי, גרורות עשוי להיות קשה לספור עושה את ההשפעות של מניפולציה גנטית קשה להעריך. עם זאת, אם מעט מדי תאים מוזרק, מעטים או לא גרורות יכול להיווצר. לפיכך, יש לעשות ניסוי מקדים באמצעות מספר שונה של תאים כדי לקבוע את המספר האופטימלי ואת משך הזמן שהגרורות גדלות. כדי להבטיח מספר עקבי של גרורות בתוך קבוצה, זה חשוב להזריק מספרים שווים של תאים קיימא לתוך כל עכבר. כיוון שתאים יכולים להתיישב הן בצינור והן במזרק, התאים צריכים להיות מושעים מחדש בעדינות לפני טעינת המזרק, ואין להשאיר את השעית התאים במזרק במשך זמן רב מדי (step 4.3.2). הכדאיות של התא פוחתת ככל שהתאים מושעה, ולכן כמות הזמן בין טריסיזציה והזרקה של התאים צריכה להיות לא יותר משעה אחת (שלב 4.2.5). בועות אוויר וגושים גדולים של תאים לא צריך להיות מוזרק מאז אלה יכולים לגרום תסחיפים כי להרוג את העכבר. בנוסף, התאים הציור עד המחט יכול להטות אותם, כך המזרק צריך להיות טעון ללא המחט. כדי לאשר כי מספר שווה יחסית של תאים הוזרק, ב vivo live תמונות בעלי חיים ניתן לקחת זמן קצר לאחר ההזרקה (איור 2B, איור 4ד).
כימות מדויקות ועקביות של אות הביולומילטית חשוב ותלוי בתאים הנוטלים את הטיפול בחילוף החומרים של D-לluciferin. זה יכול להיות מושפע על ידי משתנים רבים כולל, המינון של D-לluciferin, עיתוי של הזרקה, טמפרטורת הגוף של העכבר, כמה מורדם העכבר הוא כאשר מוזרק, וכיצד עכבר ממוקם בחדר ההרדמה לפני הדמיה. לכן, חשוב לשמור על עקביות בשלבים אלה עבור כל העכברים והפעלות ההדמיה. השתמשנו במשטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף העכבר עקבית כאשר בתא ההרדמה. מאז האות חייב לחדור את הרקמה הן ביולונטי וזיהוי פלורסנט, זה גם קריטי לשמור על מיקום העכבר עקבי עבור כל תמונה (שטוח על גבו עובד הטוב ביותר עבור הדמיה של הריאות). כימות של תמונות פלורסנט מן ההדמיה בעלי חיים vivo חיים צריך תמיד להיעשות באמצעות יעילות% יחידות כמו זה מאפשר השוואה הולמת בין התמונות. כמו כן, השטף הכולל (פוטונים/שנייה) צריך תמיד לשמש כאשר כימות תמונות ביולומי,. לניתוח של הנטל הגרורתי, יומן הרישום10 ממיר את עקומת הצמיחה (לפני האות המקסימלי מגיע) לתוך מזימה לינארית, אשר היה צורך בניתוח השיפוע.
שינויים ופתרון בעיות של השיטה
בפרוטוקול המוצג אוכלוסיה של תאים מועלת באופן ראשוני בחלבון פלורסנט ולluciferase, ולאחר מכן האוכלוסיה מועלת בעזרת וקטור בקרה או וקטור המכוון אל הגן של הריבית. הדבר מבטיח ששתי אוכלוסיות התאים בעלי חלבון פלורסנט דומה וביטוי לוציפראז. עם זאת, כחלופה, וקטורים ויראליות המספקים בו שני מרכיבים אלה יכול להיות מנוצל. אכן, בניסויים נציג השתמשנו ZsGreen ביטוי וקטורים retroviral יעיל כדי לבטא את שרין בתאי 4T1-לluciferase. מומלץ לבטא את ביטוי הליפראז וחלבון הפלורסנט בכל קבוצות התאים לאחר שינוי גן העניין. רמות שונות של ביטוי בין קבוצות יכול לסבך את הפרשנות של הנתונים, אז עדיף אם הקבוצות השונות יש ביטוי דומה של חלבון פלורסנט הן לluciferase. בנוסף, כדוריות הדם האדומות יכול להיות פלורסנט אוטומטית עלול להקשות על הדמיה של גרורות הפלורסנט בריאות. אם זה המקרה, כדוריות הדם האדומות ניתן לנקות מן הריאות על ידי PBS זלוף במהלך המתת החסד כדי להפחית את רקע פלורסנט אוטומטי (טכניקות המתת חסד המתאימה והנחיות יש לעקוב אחר). למרות ההבדלים בין השליטה לבין קבוצות מנוק בניסויים נציג שלנו הם דרמטיים, את ההבדלים עכבר-אל-העכבר, כי לעתים קרובות קיים ב vivo גרורות בחני הוא ניכר בעכברים בקרה (איור 3b ואיור 5ב). כאשר השונות הזאת היא גבוהה, זה יכול להקשות על קביעת סדר הגודל של אפקט הנוק-אין. גישה חלופית שניתן להשתמש בו כדי להפחית את השונות הזאת היא לתייג את תאי הבקרה ומנוק תאים עם חלבונים פלורסנט ברורים ואנזימים לוציפראז ברורים ולאחר מכן לערבב את שתי האוכלוסיות במספרים שווים ולהזריק את התערובת. לדוגמה, תאים לשלוט באופן בלתי נשכח המבטא עגבניות renilla לוציפראז יכול להיות מעורב עם מצנוק תאים המבטא zsgreen ו גחלילית ללוציפראז. בתוך vivo חי התקנים הדמיה בעלי חיים יכול להבחין renilla לוציפראז מ גחלילית לוציפראז, ועגבניה מ ZsGreen, כך או האור הירוק או הידרוסנס יכול לשמש באופן עצמאי לכמת כל האוכלוסייה תאים. אכן, כפול הדמיה לוציפראז של תאים 4T1 גדל כמו גידולים ראשוניים בעלי חיים חיים הפגינו באמצעות vivo live הדמיה בעלי חיים המכשיר4. עם זאת, חשוב לציין כי ייתכנו חפיפה באות פלורסנט, ולכן צעד ספקטרלי (ראה הנחיות היצרנים) יש לכלול בגישה זו. בנוסף, the renilla לוציפראז ו גחלילית לוציפראז צריך להיות הדמיה בנפרד עם עיכוב זמן מספיק המאפשר את האות הראשון לוציפראז לא ניתן עוד לזיהוי לפני הדמיה השני. השימוש fluorophores ברורים עדיין מאפשר את מספר וגודל גרורות בריאות להיות מכמת16. כדי לבדוק התיישבות גרורתית וצמיחה באיברים אחרים מלבד הריאות הפרוטוקול הזה ניתן לשנות ומשמש עבור הזרקת וריד הפורטל9,10.
מגבלות השיטה
באמצעות התקן vivo live הדמיה בעלי חיים כדי לרכוש נטל גרורתי בזמן אמת בשילוב עם התווית התאים fluorescently אופן שכותרתו מספק שיטה רבת עוצמה כדי שיטת הקולוניזציה גרורתית ואת הצמיחה הבאה; עם זאת, ישנן מגבלות על גישה זו. גנים מסוימים עשויים להידרש הפצת תאים מולדים ולא תפקידים ספציפיים גרורות. בשנת מבחנה התפשטות התא ניתן לעשות לפני בניסוי vivo כדי לקבוע אם הגן משבש את הצמיחה מחוץ למוח. כאשר הדמיה חיה חיה, הביולומינטי או האות פלורסנט מן גרורות חייב להיות חזק מספיק כדי לעבור דרך הרקמה. בנוסף, התכונות האופטיות (כלומר, הקליטה והפיזור) של הרקמה משפיעות גם על גילוי55. מקור האור עירור חייב להיות מסוגל לעבור דרך הרקמה כדי להלהיב התווית תאים סרטניים וביולומינסנציה יש טווח דינמי גדול יותר מאשר פלואורסצנטית. לפיכך, למרות שניתן להשתמש באור השמש להדמיה חיה, ביולומינסנציה עדיף לגילוי אות באברים פנימיים. בנוסף, כמה זנים העכבר המוסמכת עשוי לדחות תאים המבטא חלבונים פלורסנט. אכן, מצאנו כי תאים ביטוי עגבניות, GFP, או מצ נדחו או למטה מוסדר fluorophore כאשר גדל בעכברים BALB/c (נתונים לא מוצגים ו15). עם זאת, כפי שמוצג כאן (איור 3 ואיור 5) ובעבר15,16, zsgreen-תאים המסומנים הם לזיהוי עכברים אלה. במקרים שבהם הביטוי חלבון פלורסנט הופך להיות בלתי ניתן לגילוי, דרך נוספת לכמת את הקולוניזציה גרורתית יחסית היא להשתמש qPCR לכמת או גן פלורסנט או גן אחר בתוך וקטור נגיפי משולב15. למרות שvivo חי הדמיה בעלי חיים מאפשר לך לזהות שינויים בנטל גרורתי, זה לא מאפשר אחד כדי לקבוע אם שינויים אלה הם בשל גודל או מספר של גרורות. זה גם לא מספק מידע מרחבי על המיקום של הגרורות. יתרה מזאת, עוצמת האות יכולה להיות מושפעת מעומק הרקמה.
משמעות השיטה והיישומים העתידיים הפוטנציאליים
ישנן דרכים רבות בהן ניתן לשנות גישה זו כדי לקבל מידע נוסף או שונה. מגוון של התאים הסרטניים בסרטן כולל קווי התאים של סרטן האדם או המטופל נגזר xenografts יכול לשמש בטיפול זה. מודלים אחרים של העכבר יכול לשמש גם, כולל טרנסגניים או עכברים המיועדים לבדוק כיצד מיקוד חלבונים שנעשו על ידי תאים סטרומה השפעות הקולוניזציה גרורתית וצמיחה של תאים סרטניים מוזרק. אם יש גנים מועמדים מרובים להיבדק, גישה זו יכולה להיות מגובשת כי ב vivo live התקני דימות בעלי חיים יכולים לזהות ולהבחין מגוון רחב של fluorophores. פעולה זו תקטין את מספר העכברים הדרושים ותגדיל את מספר היעדים שניתן לבדוק. ב vivo חי הדמיה בעלי חיים יכול להיות משולב גם עם רנטגן או CT9 הדמיה כדי לספק הרבה יותר מידע מרחבי על המיקום של גרורות. לבסוף, גישה זו יכולה להיות שונה כדי לסדר שלבים ספציפיים יותר בתוך הקולוניזציה מושבת גרורתית. לדוגמה, השלבים המעורבים בזריעת תאי הגידול (intravascular הישרדות, מערכת הגברה, והישרדות פוסט-מטרעות) ניתן להבדיל על-ידי כימות מספר תאי הגידול בריאות במספר נקודות זמן בתוך 3 הימים הראשונים שלאחר ההזרקה (כגון שנעשה כאן16). במקרה זה, הריאות ניתן גם להיות מוכתם עם סמנים כלי הדם ו לשעבר התמונה vivo כדי לקבוע את אחוז התאים הסרטניים כי יש ex, בכל פעם נקודה56,57.
לסיכום, השימוש בזמן אמת ב vivo live הדמיה בעלי חיים של פלורסנט ותאים סרטניים זורח בעקבות הזרקת וריד הזנב מאפשר ניתוח מפורט יותר של איך גן מועמד או גנים משפיעים על מושבת גרורתית ואת הצמיחה הבאה. גישה זו היא מהירה יותר וזולה יותר מאשר מודלים של עכבר autochthonous ונמנע כמה אזהרות של מודלים גרורות ספונטנית. השימוש הן של הזריחה והן הלומינסנציה כאמצעי לזיהוי וככמת גרורות נותן לחוקרים הקוראים עצמאית המשפרת את הביטחון בתוצאות ולאפשר גמישות בעיצוב ניסיוני. השימוש של הקרינה הפלואורסצנטית לכמת את הגודל ואת המספר ימנע את הצורך בזמן רב ובאופן פוטנציאלי לעיבוד היסטלוגי וניתוח, ומאפשר שימוש נוסף של הרקמות כולו. ניתן להשתמש בפרוטוקול עם מספר טכניקות שונות כדי לטפל בביטוי או בתפקוד של הגן המועמד, כגון RNAi, ביטוי טרנזגנטי, או CRISPR/Cas-בתיווך עריכה, והוא יכול לשמש גם כדי לבדוק מולקולות קטנות, פונקציה חסימת נוגדנים, או תרכובות טיפוליות פוטנציאליות אחרים. כפי שהוזכר לעיל, ניתן לעשות מספר שינויים פשוטים כדי לשפר את האפשרות ולספק מידע נוסף. גישה זו היא דרך אידיאלית לזהות ולבדוק גנים פרו-גרורתית כי יש פוטנציאל טיפולי לטיפול בסרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים אמילי נורטון על סיוע עם זיהומים ויראלי קריאה ביקורתית של כתב היד. אנחנו גם מודים לריאן Kanai לעזרה עם רכישת תמונות של הריאות וקייט E. טאבבסינג לעזרה עם ניתוח תמונה של גרורות ירוקות בריאות. אנו מודים לצוות המחקר של בעלי החיים על תמיכתם וסיוע בהכנת וידאו זה. עבודה זו נתמכת על ידי הגרנט סוזן ג ' Komen הקריירה המענק הוענק J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
References
- Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
- Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Mohanty, S., Xu, L.
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
- Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
- Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
- Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
- Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
- Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
- Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
- Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
- Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
- Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
- Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
- Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
- Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
- Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
- Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
- Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
- Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
- Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
- Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
- Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
- Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
- Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
- Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
- Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
- Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
- Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
- Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
- Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).
