Summary
所述方法将实验性尾静脉转移测定与活体动物成像相结合，除了对肺部转移数和大小进行定量外，还能够实时监测乳腺癌转移的形成和生长。
Abstract
转移是癌症相关死亡的主要原因，转移性疾病患者的治疗选择有限。鉴定和测试新的治疗靶点，这将有助于开发更好的治疗转移性疾病需要临床前在体内模型。这里演示的是一个合成小鼠模型，用于分析乳腺癌转移殖民化和后续生长。转移性癌细胞通过编码萤火虫荧光素酶和ZsGreen蛋白的病毒载体稳定地转导。然后，候选基因在荧光素酶 / ZsGreen 表达的癌细胞中稳定地纵，然后通过侧尾静脉将细胞注射到小鼠体内，以测定转移的殖民化和生长。然后，使用体内成像设备测量活体动物肿瘤细胞的生物发光或荧光，以量化转移性负担随时间的变化。荧光蛋白的表达允许在实验结束时对肺部转移的数量和大小进行量化，而无需切片或组织染色。该方法提供了一种相对快速、简便的方法，用于测试候选基因在转移性殖民化和生长中的作用，并且比传统的尾静脉转移测定提供了更多的信息。使用这种方法，我们表明，在乳腺癌细胞中同时敲除Yes相关蛋白（YAP）和带有PDZ结合图案（TAZ）的转录共激活剂可减轻肺部转移负担，这种减轻的负担是转移殖民化显著受损和减少转移生长的结果。
Introduction
癌症仍然是全球第二大死因1和转移是造成这些死亡大多数2，3。然而，对控制转移性殖民化和随后生长的分子机制的了解有限，阻碍了对转移性疾病的有效治疗的发展。确定新的治疗靶点需要一种测定，以测试候选基因的扰动表达或功能如何影响转移形成和生长。虽然自主鼠标模型有其优点，但它们的生成既耗时又昂贵，因此更适合于目标验证而不是目标发现。移植模型系统，其中候选基因在体外癌细胞中扰动，然后对转移电位的影响在体内被评估，比自体模型更便宜，吞吐量更高。此外，用于稳定传递RNAi、CRISPR/CAS9和转基因的病毒载体也随处可见，使得在癌细胞系中几乎容易干扰任何感兴趣的基因或基因。这种方法也可以用来通过将细胞移植到免疫功能低下或人化小鼠中来分析候选基因在转移性殖民化和人类癌细胞系生长中的作用。
用于测试移植癌细胞在体内形成的两种检测是自发转移测定和实验性转移测定。在自发转移测定4，5中，癌细胞被注射到小鼠体内，允许形成原发性肿瘤，然后对自发转移形成和随后的生长进行测定。此模型的强度是细胞必须完成转移过程的所有步骤，才能形成转移性肿瘤。然而，许多癌细胞系在自发转移模型中不能有效地转移，任何影响原发性肿瘤生长的细胞操作都可能混淆转移测定的结果。实验转移测定，其中癌细胞直接注射到循环，用于避免这些陷阱。常见的实验性转移测定包括尾静脉注射6，7，8（这里演示），心内注射9，和门户静脉注射10。
此处介绍的协议的目的是提供一个体内实验性转移测定，允许研究人员实时监测转移形成和生长，以及量化同一小鼠肺部的端点转移数和大小。为此，传统的实验尾静脉转移测定6、7、8与活体动物成像相结合，使用体内成像装置9、11、12、13、14。通过侧尾静脉将稳定表达荧光素酶和荧光蛋白的肿瘤细胞注射到小鼠体内，然后利用体内成像装置测量肺部转移性负担随时间的变化（图1）。然而，活体动物成像设备无法区分或测量单个转移的大小。因此，在实验结束时，使用荧光立体显微镜计算和测量肺部荧光转移的大小，而无需切片和组织学或免疫组织化学（图1）。该协议可用于测试改变候选基因的表达或功能如何影响转移形成和生长。潜在的治疗化合物，如小分子或功能阻断抗体也可以测试。
为了证明这种方法，我们首先进行了概念验证实验，其中在转移小鼠乳腺癌细胞中击倒了必要的复制因子，复制蛋白A3（RPA3）。研究表明，与注射控制细胞的小鼠相比，注射RPA3敲除细胞的小鼠在每个时间点的转移负担明显较少。对含转移的肺的分析表明，这种转移负担的减少是显著减少转移殖民化和损害形成转移的生长的结果。为了进一步演示此技术，我们测试了同时击倒 Yes 相关蛋白 （YAP） 和带有 PDZ 结合图案 （TAZ） 的转录共激活剂是否会损害转移性殖民化或后续生长。YAP 和 TAZ 是两个相关的转录共激活器，是 Hippo 路径的关键下游效应器。我们15，16和其他已经牵连YAP和TAZ在转移（在17，18，19），表明这些蛋白质是很好的治疗目标。一直，我们发现注射YAP/TAZ敲除细胞的小鼠显著减轻了转移负担。对肺部的分析表明，YAP/TAZ敲除细胞形成的转移要少得多，而确实形成的转移较小。这些实验演示了实验性转移测定如何让研究人员快速、廉价地测试候选基因在转移形成和生长中的作用。他们进一步展示了活体动物成像和整个肺部转移的荧光定量的组合使用如何使研究人员更好地了解转移殖民化过程中的步骤。
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Protocol
该协议涉及使用小鼠和生物有害物质，需要获得相关机构安全委员会的批准。这里所有描述的体内工作都得到奥尔巴尼医学院动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注：有关协议概述，请参阅图 1中的原理图。
1. 包装所有必需的逆转录病毒和慢病毒
注：所述协议使用慢病毒或逆转录病毒载体来稳稳地表达荧光酶和荧光蛋白，以及操纵候选基因的表达。这些病毒被包装在HEK-293FT细胞中，如下所述。
- 第1天：在2mL的完整生长介质（DMEM中10%的FBS，1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺）的6孔板上的6孔板上的板HEK-293FT细胞，使其在第2天达到40-60%。在37°C下孵育，5%CO2过夜。
- 第2天：对于要包装的每个病毒载体，转染40-60%的HEK-293FT细胞与逆转录病毒或慢病毒载体和编码病毒涂层和包装蛋白的适当载体。
注：本协议使用VSVG作为涂层蛋白，psPAX2用于慢病毒包装，gag-pol用于抗逆转录病毒包装（有关载体列表，请参阅补充表1）。 - 为每个混合物制作一个共转染混合物，如下所示：
- 结合4μL的脂质溶液进行转染（见材料表）和96μL转染缓冲液，孵育5分钟。
- 加入1μg病毒载体，0.5微克涂层蛋白载体（VSVG）和0.5μg包装蛋白载体（psPAX2或gag-pol），孵育20分钟。
- 将步骤1.3.2中的共转染混合物轻轻加入步骤1.1中镀的HEK-293FT细胞，并在37°C、5%CO2孵育过夜。
- 第3天：从每个井中取出含有转染的介质，并轻轻地向每个井中加入2 mL的完整生长介质。在37°C下孵育，5%CO2孵育约24小时。
- 第4天：使用3mL注射器从每口井收集病毒上清液，并通过0.45 μm过滤器过滤到2 mL微离心管中。
- 可选：如果需要收集第二批病毒，请在每个井中轻轻添加 2 mL 的完整生长介质，并在 37°C、5% CO2下孵育约 24 小时。
- 第5天（可选）：收集第二轮病毒上清液，如步骤1.5。
注： 该协议可以通过冻结病毒上清液暂停。
2. 生成可稳稳地表达荧光酶和荧光蛋白的癌细胞
注：以下协议描述了如何首先使用两个具有独特选择基因的载体，将4T1细胞与萤火虫荧光素酶和荧光蛋白（ZsGreen）进行稳扎贴标。然后，第三病毒载体用于操纵候选基因的表达。然而，同时提供荧光蛋白和基因操作的病毒载体也可以作为替代方法（如下所述代表性的实验）。可以使用其他癌细胞，但细胞数应针对步骤 2.1 和 2.7.1 进行优化。
- 板 4T1 细胞在 1.5 x 105细胞/孔在 12 孔板中，在完整的生长培养基（10% FBS 在 DMEM 与 1% 青霉素/链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺），并在 37°C，5% CO2过夜孵育。
- 感染4T1细胞与步骤1中生成的病毒上清液，如下所示。
- 从细胞中吸出生长培养物，加入500μL的荧光酶病毒上清液和500μL的荧光蛋白病毒上清液，同时用荧光素酶和荧光蛋白病毒上生子感染细胞。
- 添加 1 μL 的 8 毫克/mL 六溴二苯丙胺（参见材料表）。
- 在37°C下孵育细胞，5%至75-90%汇入（通常为24-48小时）。
- 用500μL的胰蛋白酶将4T1细胞胰蛋白酶化2-5分钟（细胞应自由冲洗井底）。将所有细胞转移到4 mL的选择培养基（包含适当抗生素的完整生长培养基）中的6厘米培养皿中，从而淬火胰蛋白酶。在同一选择介质中盘一个6厘米的未感染控制细胞。
注：应提前通过测试几种剂量来确定适当的抗生素浓度。此外，荧光激活细胞分选也可用于选择荧光标记细胞，以代替药物选择。 - 在37°C下孵育细胞，在选择培养基中孵育5%的CO2，并在必要时分裂细胞，直到所有未受感染的控制细胞都死（取决于选择基因和细胞系）。
- 确认受感染的 4T1 细胞使用绿色激发 （450-490 nm）/发射 （500-550 nm） 过滤器以 50-100 倍放大倍率在倒置荧光显微镜上表达 ZsGreen 荧光蛋白。
- 确认受感染的 4T1 细胞使用市售的荧光素酶活性试剂盒表达荧光素酶，如下所示。
- 使用最小体积的1x被动性莱沙缓冲液来莱沙酶表达4T1细胞，并控制4T1细胞不表达荧光素酶，轻轻摇动30分钟。
- 将20μL的细胞赖萨酸添加到白底96孔板中，然后从荧光素酶活性试剂盒中加入50μL的荧光素酶测定试剂。
- 使用板读取器使用发光设置测量光谱中所有波长的细胞的发光。
注：通过冻结稳定转导的细胞，可以暂停该协议。
- 操作候选基因的表达，如下所示：
- 板 6 x 105标记 4T1 细胞从步骤 2.6 在 60 mm 盘中在 4 mL 的完整生长介质中，并在 37°C、5% CO2孵育过夜。
- 从每口井中吸出生长介质，加入2 mL的完整生长介质，含有4μL的8mg/mL六丙二甲酰胺溴化物。
- 从步骤1向步骤2.7.2的细胞添加2 mL的病毒上清液，并在37°C，5%CO2过夜孵育。
- 用500μL的胰蛋白酶将4T1细胞胰蛋白酶化2-5分钟（细胞应自由冲洗井底）。将所有细胞转移到10 mL的选择培养基（包含适当抗生素的完整生长培养基）中的10厘米培养皿中，从而淬火胰蛋白酶。在同一选择介质中为一些未感染的对照片添加标记的 4T1 细胞。
- 在37°C下孵育细胞，在选择介质中孵育5%CO2，必要时分裂细胞，直到所有未感染的细胞死亡。
- 确认候选基因的表达使用标准方法改变，如西方印版20或qPCR21。
- 在步骤 2.5-2.6 中测定发光和荧光，以确定它们在控制和击倒细胞中的相似性，因为这种情况可能会改变（请参阅讨论）。
注：通过冻结稳定转导的细胞，可以暂停该协议。
3. 体内实验设计的优化
- 优化所需的转移负担的相应细胞数和实验持续时间，如下所示。
- 在完整的生长培养中从步骤2.6中展开荧光和生物发光4T1细胞，以便在所需的注射日提供多余的细胞。
- 如步骤 4.2 所述，为尾静脉注射准备细胞。要确定注射的最佳细胞数，请以100μL的1x PBS中几种不同浓度重新悬浮细胞。
注： 我们建议测试一系列从 25，000 到 500，000 的细胞编号/鼠标。 - 将细胞悬浮液放在冰上，直到注射。
- 通过步骤4.3中描述的横向尾静脉，将步骤3.1.2中每个4T1细胞的稀释注入3-4个小鼠中（见下文）。
- 将鼠标返回到笼子并监控 15 分钟，以确保完全恢复。应每周检查3次小鼠是否有疼痛或疼痛的迹象。
- 使用活体动物成像设备监测小鼠转移形成和生长3-6周（细胞系和小鼠菌株依赖性）（参见步骤5和6）。
- 根据标准机构指南，在尾静脉注射后3-6周给小鼠安乐死。
- 准备肺部，评估步骤7中描述的转移大小和数量。
- 为所需的转移负担选择适当的转移生长时间长度（请参阅讨论）。
4. 标记癌细胞的尾静脉注射
注：步骤4.2.4已针对在合成BALB/c小鼠中生长的4T1细胞进行了优化。如果使用其他癌细胞系和小鼠菌株，应首先优化注射的细胞数量和测定长度。
- 在完全生长培养基的两个 15 厘米培养皿上展开步骤 2 中生成的 4T1 细胞系，以便在注射当天提供多余的细胞。
- 准备细胞进行尾静脉注射，如下所示：
- 吸气介质，用1x PBS冲洗细胞板。
- 每15厘米板用5mL的胰蛋白酶对细胞进行2-5分钟的胰蛋白酶（细胞应自由冲洗井底）。将所有细胞转移到锥形管中。用足够的完整生长培养基洗组织培养皿中的剩余细胞，以淬火胰蛋白酶，并将洗涤添加到同一锥形管中。
- 使用自动细胞计数器对细胞进行计数，以确定细胞总数。
- 在122 x g下将细胞离心3分钟，吸出上清液，并在1xPBS中以所需的浓度重新悬浮细胞。在这里，2.5 x 104细胞以 100 μL 的 PBS 注入每只小鼠，因此在 2.5 x 105细胞/mL 处重新悬浮细胞。将细胞悬浮液放在冰上，直到注射。
注意：将细胞胰蛋白酶化和尾静脉注射之间的时间限制在大约1小时，这一点很重要。
- 将步骤 4.2.5 中的 4T1 细胞通过侧尾静脉注射到小鼠体内，如下所示：
- 在动物设施的引擎盖中工作，通过反转管或使用 1 mL 注射器轻轻但彻底地混合细胞，以确保它们均匀地重新悬浮。在装入注射器之前，务必确保细胞重新悬浮。
- 加载带细胞悬浮液的 1 mL Luer 锁注射器并排出多余的气泡。在注射器上放置一个 1/2 英寸、30 口径的针头，并向上斜面并排出气泡。
- 轻轻地将鼠标放入啮齿动物约束器中。
- 侧侧尾静脉应可见和扩张。如果没有，轻轻捏住尾巴的底座，将尾巴浸入温暖的自来水中，以稀释静脉。
注：通过将鼠标保持架置于加热灯下方和/或加热垫顶部，也可以实现静脉扩张。 - 用酒精擦拭清洁尾巴。将针头插入尾静脉，侧向斜面，并注射100 μL细胞悬浮液。
注：如果针正确插入静脉，它应容易稍微向前和向后滑动，在推柱塞时不应有阻力。成功的注射也会导致"冲洗"，其中静脉的蓝色在注射后几秒钟变成白色。
- 慢慢取出针头并使用无菌纱布，向注射部位施加压力以停止任何出血。
- 将鼠标返回到笼子并监控 15 分钟，以确保完全恢复。应每周检查3次小鼠是否有疼痛或疼痛的迹象。
- 使用活体动物成像设备监测小鼠转移形成和生长3-6周（细胞系和小鼠菌株依赖性）（参见步骤5和6）。
5. 使用活体动物成像装置用荧光监测转移负担
注：请勿使用有源发光信号将动物的荧光图像化。
- 如果只是成像生物发光，请跳到步骤 6。
- 打开体内活体动物成像设备。
- 根据制造商的指南建立体内活体动物成像麻醉系统，将1.5%至2%的异苯二苯基输送到麻醉室和成像室。
- 用荧光标记转移小鼠从步骤4进行麻醉，将其放入麻醉室，并输送1.5-2.5%的异常。
- 打开图像软件（见材料表）并登录。
- 单击"初始化"按钮并等待计算机初始化。
- 将视场更改为D。
注： 如果需要更近距离的鼠标视图，也可以使用视图 C字段，但这限制了可以同时成像的鼠标数量。 - 一旦软件指示摄像机已达到适当的温度，请单击"成像向导"按钮，选择荧光，然后从下拉菜单中选择相应的滤光片对。
注：如果所使用的荧光剂不是一个选项，请选择输入EX/EM并键入所需的激励和发射。 - 如步骤 3.2.4 所述，将鼠标放在造型室中。
- 单击"获取序列"。
- 成像后，将鼠标返回到笼子并监控 15 分钟，以确保完全恢复。
- 使用至少一个不包含转移的鼠标重复步骤 5.2 和步骤 5.7-5.9。注：此鼠标将用于在分析期间量化和减去背景信号（步骤 8）。
- 在实验期间，每周图像 2-3 次。
6. 使用活体动物成像装置通过生物发光监测转移负担
- 打开体内活体动物成像设备，并设置程序如下。
- 打开图像软件（见材料表）并登录。单击"初始化"按钮并等待计算机初始化。将视场更改为D。
注：视图C 字段可用于更近距离的视图，以映像整个鼠标正文;但是，这限制了一次可以成像的小鼠数量。 - 首次使用时，按如下方式编辑曝光设置：单击"编辑 |首选项 |收购 |自动曝光并将最大曝光时间从默认 60 秒更改为 300 秒，然后单击"OK"。
注：请勿更改自动曝光选项卡中的任何其他参数。
- 打开图像软件（见材料表）并登录。单击"初始化"按钮并等待计算机初始化。将视场更改为D。
- 根据制造商的指南设置麻醉系统，将1.5%至2%的等分胶输送到麻醉室和成像室。
- 在继续步骤 6.4 之前，确保摄像机已达到适当的温度。
- 麻醉转移包含转移的小鼠从步骤4，将它们放在麻醉室，并提供1.5-2.5%的离胶。
- 为小鼠进行生物致发光成像准备，如下所示。
- 用 D-荧光素装入 1 mL 注射器（D-PBS 中为 30 mg/mL），然后向注射器添加 1/2 英寸 30 口径针头并排出气泡。
- 测量并记录麻醉小鼠的质量。
- 用拇指和指针手指捏住老鼠的脖子，抓住小指和手底之间的尾巴，以抑制鼠标。以 45 度角反转鼠标，其头部朝下。
- 将针，斜面向上，插入鼠标的左侧腹中 （IP） 空间。通过回拉小音量确认进入 IP 空间。在 IP 空间中拉回时，针底不应有颜色。
- 以150mg/kg的剂量注射适当的D-荧光素。
- 在D-荧光素给药后，启动计时器，将鼠标平放在成像装置的背面，鼻锥中的鼻子，确保施用1.5-2.5%的偏胶。如果成像多个鼠标，则在每个鼠标之间放置分隔线。确保小鼠尽可能平放（即不倾斜到一侧）。
- 单击"发光"和"照片"框，然后单击"获取控制面板"中的"获取"。
- 连续获取生物发光图像，直到达到峰值信号，并使用带有峰值生物发光信号的图像进行分析。
- 成像后，将鼠标返回到笼子并监控 15 分钟，以确保完全恢复。
- 在实验期间，每周图像 2-3 次。
7. 转移的数量和大小的量化
注：应为每个细胞系和小鼠菌株确定转移允许生长的时间长度，并受注射的细胞数量的影响。
- 根据标准机构准则对小鼠实施安乐死。
- 从每只小鼠中分离和去除肺部，用 1x PBS 冲洗以去除多余的血液。
- 轻轻地将肺分离成叶。
- 使用带有GFP宽带滤波器的荧光立体镜（激励470/40x），在明亮场和荧光中以10倍的波瓣获取ZsGreen转移的图像。
注：对所有样品保持相同的放大倍率和亮度。使用的放大倍数可能因转移的大小、数量和亮度以及所用显微镜的视场而异。 - 使用图像分析软件量化图像转移的大小和数量。
注：图像分析协议与软件相关，可以从步骤3中针对肿瘤进行优化。或者，使用荧光立体镜手动计算每个肺的转移数。协议可以在这里暂停，步骤8可以在收集所有体内图像后的任何时候完成。
8. 处理和分析使用活体动物成像装置采集的图像的数据
- 打开图像软件中每个鼠标的所有图像文件。
注：使用带有峰值生物发光信号的图像进行分析 - 通过单击图像窗口左上角的箭头并将其更改为相应的单位，确保这些单位符合生物发光数据的辐射度和荧光数据的效率。
- 使用上次时间点的图像创建感兴趣的区域 （ROI），如下所示。
- 单击工具调色板窗口中的ROI 工具。通过单击箭头并选择1插入一个 ROI。
- 单击 ROI 的边框并将其移到鼠标的胸前。调整 ROI 的大小，使其覆盖鼠标的胸部，并且不排除信号。
- 单击度量值 ROI 并将原始编号复制或键入 Excel 工作表。
注：对于生物发光数据，选择总通量（光子/秒），这是 ROI 中所有辐射的总和。由于转移不一定均匀地增长，因此总通量优先于平均辐射，因为它测量转移性负担的总和。同样，对于荧光数据，应使用总效率百分比（发射光（光子/秒）/激发光（光子/秒））代替平均效率。 - 右键单击图像文件中，复制步骤 8.3 中使用的 ROI 并将其粘贴到每个图像文件中。
注：在量化荧光图像时，在未发生转移的小鼠上量化同一区域。使用此信号作为背景信号，并从获取的每个包含荧光转移的小鼠图像中减去它。 - 将粘贴的 ROIs 移到步骤 8.3.4 中为每个图像选择的相同区域，并重复步骤 8.4。
- 绘制和分析原始数据如下（参见补充表 2）。
- 使用指示的公式（补充表 2）对每只鼠标的原始数据进行10的日志转换，并绘制如图 2D和图 4F所示。对数10变换使增长曲线线性化，该增长曲线倾向于几何，并最小化异方差。
- 使用线性回归，计算步进 8.7.1 中绘制的每个鼠标的拟合线的斜率到日志10转换数据（补充表 2）。请参阅补充表 2中的公式以拟合行并计算一步坡度。
- 绘制斜率的数值，如图2E和图 4G所示。在斜坡上使用学生的 t 测试或单向 ANOVA（对于超过 2 组）来确定统计显著性。
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Representative Results
为了演示上述方法，我们进行了概念验证实验，其中关键的复制因子 RPA3 在转移性小鼠乳腺癌细胞系 （4T122） 中被击倒。虽然该协议描述了在基因操作之前用荧光素酶和荧光蛋白标记细胞，但我们使用了一种改良的方法，因为RNAi载体也提供ZsGreen（图2A）。首先，4T1细胞通过慢病毒结构稳稳地转导，编码萤火虫荧光素酶和湿霉素抗性（pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro）。在选择湿霉素后，执行荧光酶测定，以确认萤火虫荧光素酶的稳定表达（图2A）。接下来，4T1-Luciferase细胞被稳稳地转导为逆转录病毒载体，表达ZsGreen和基于miR30的对照miR30shRNA，或以前显示能有效靶向小鼠RPA316、23、24的miR30型shRNA。然后通过侧侧尾静脉将细胞注射到小鼠体内，并在体内每周测量两次生物发光信号，以监测转移性负担（图2B，C）。每只鼠标的日志10变换信号绘制为随时间的转移负担（图2D），并确定了每个图的斜率（图2E）。这些数据表明，与对照细胞相比，RPA3击倒后，转移性负担的变化率显著降低。尽管差异是惊人的，但这些数据本身并不能让我们确定转移负担的减少是转移减少还是转移生长缓慢的结果。因此，在实验结束时还分析了肺部的ZsGreen标记转移。注射RPA3击倒细胞的小鼠肺部几乎没有转移，而对照小鼠有大量大转移（图3）。此外，从RPA3敲除细胞形成的转移明显小于控制4T1转移（图3A）。与我们的手动计数（图3B）一致，图像分析软件在RPA3击倒小鼠中计数的转移要少得多（图3C）。此外，RPA3击倒（图3D）也大大减少了肺中总转移负担（每个转移区域之和（毫米为单位）。最后，在RPA3击倒小鼠中形成的个体转移的大小通常比对照小鼠小得多（图3E）。除了对照小鼠的大转移外，我们还观察到许多小转移，但无法确定这些肿瘤细胞是播种肺的肿瘤细胞，没有生长，或者它们是肿瘤细胞是否从一个较大的转移体中脱落，这种转移在新的位置重新播种肺（图3E）。这些数据共同表明，RPA3是4T1细胞转移形成所必需的。这些发现是预料之中的，因为我们以前的研究显示，RPA3击倒细胞在尾静脉注射16后，在肺部形成转移的能力明显下降。然而，这个实验演示了如何使用活体动物成像和荧光定量转移数和大小来确定转移负担的变化是否由于转移殖民化或生长的差异。
为了演示如何使用这种方法来回答一个更具生物学相关性的问题，我们询问了在乳腺癌的这种合成模型中，是否需要YAP和TAZ进行转移性殖民化和后续生长。与正常组织相比，YAP或TAZ的表达和活性在许多癌症中有所增加，这是对不良患者结果25、26、27、28、29的预测。此外，一些研究还涉及YAP、TAZ或TEADs，关键的YAP/TAZ绑定伙伴，在转移15，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42， 43，44，45，46，47，48，49，50，51，52 。鉴于这些数据，我们使用我们的方法来测试转移形成和生长是否需要YAP和TAZ。为此，我们使用抗逆转录病毒载体表达基于串联miR30的shRNA，面向YAP和TAZ。如图所示，这种串联shRNA可有效降低4T1细胞中的YAP和TAZ蛋白表达和转录活性（图4A，B）。4T1-Luciferase细胞通过该串联YAP/TAZ shRNA载体的ZsGreen表达版本或对照miR30基shRNA（图4C）进行稳态转导，然后在合成BALB/c小鼠中通过尾静脉注射进行测定。如图4所示，与注射YAP/TAZ敲除细胞的小鼠相比，注射对照细胞的小鼠转移负担增加的速度明显加快（图4D-F）。与使用人工计数（图5A，B）或使用图像分析软件（图5C）的小鼠相比，注射YAP/TAZ敲除细胞的小鼠形成的转移显著减少。不仅更多的转移形式在对照小鼠中，而且它们一般较大（图5E）。一贯地，肺的转移负担（总转移面积在毫米）也大大减少了YAP/TAZ击倒（图5D）。需要注意的是，当转移很大且接近时，软件可能无法区分不同的转移。控制小鼠（小鼠3和小鼠7）中的一些转移就是这种情况。因此，检查图像分析软件的输出，确保它准确测量单个肿瘤的面积是非常重要的。这也是为什么优化注射的细胞数量和实验时间的重要性。总体而言，这些数据表明，YAP和TAZ需要维持转移性乳腺癌的合成小鼠模型转移负担增加的速度，这是由于转移无法形成和减少确实形成的少数转移的生长。
图 1：协议架构。所有必要的病毒首先包装在HEK-293FT细胞中。然后，该研究所需的细胞同时感染荧光素酶和荧光病毒，每种病毒都表达出独特的哺乳动物药物选择基因。然后，在含有这两种药物的适当培养物中展开受感染的细胞，以选择用于表达荧光素酶和荧光蛋白的稳稳转导细胞。两个标签的表示都确认在协议中。然后，标记的细胞被转导为包含基因操作（miR30 shRNA）的第三种病毒和第三个独特的药物选择基因。使用第三种药物选择后，细胞通过侧尾静脉注射到小鼠体内。在实验过程中，使用活体动物成像系统监测小鼠的转移负担。在实验结束时，小鼠被安乐死，并使用荧光解剖显微镜拍摄整个肺部的图像，然后用于测量转移的数量和大小。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：基于Luciferase的活体活体动物成像显示，RPA3击倒可减轻乳腺癌转移负担。（A） 显示细胞是如何在体内研究产生的原理图.4T1细胞通过慢病毒编码荧光素酶和湿霉素抗性稳稳地转导。用600微克/mL的湿霉素B选择受感染的细胞一周，然后用荧光素酶试剂盒和板读器（n = 1个平均复制孔的实验）在亲子细胞或4T1-荧光酶细胞中测量荧光酶活性。4T1-Luciferase 细胞随后感染了逆转录病毒，这些逆转录病毒提供以 mCherry（对照）或 mRPA3 为目标的 ZsGreen 和 miR30 shRNA。使用3天2.5微克/mL选择紫霉素，用于选择稳定整合病毒。（B-E） 4T1-荧光酶细胞，可稳稳地表达ZsGreen和控制（sh-mCherry）或mRPA3（sh-mRPA3-431）shRNA，在协议所述的指定日期被注射到小鼠体内，并成像进行生物发光。（B&C）在实验过程中为每只小鼠测量的对数10转化荧光酶信号的日志10转化荧光酶信号的日志10变换的荧光酶信号的指定日（D）上，每组代表性小鼠的生物发光图像。（E） D 中每只小鼠的斜率（n = 6 表示 sh-control，8 表示 sh-mRPA3-431），具有均值（实线）的散点图。使用学生不测试测试统计显著性;*p = 0.05。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：荧光转移的定量表明，RPA3敲除可防止转移殖民化和乳腺癌细胞的后续生长。（A） 荧光（左）和亮场（右）图像代表叶从每只小鼠注射在图2注射后21天。星号 （*） 表示绿色自荧光支气管。（C-E）图像分析软件（见材料表）用于使用强度阈值 25 到 100 和大小阈值 0.01 mm2到无穷大来识别和测量对象。（B&C）通过图像分析软件（C） 计数 （B） 时，每个小鼠肺部转移总数的均值（实棒）的散点图。（D） 使用图像分析软件测量的肺总面积（毫米）绘制为转移性负担，以实心条指示的平均值。（E） 每只小鼠都绘制出每个转移的大小。对照小鼠由蓝点表示，mRPA3击倒小鼠用红点表示。请注意，刻度条在 1 mm 处分离，以便更轻松地可视化小转移的大小和数量（n = 6 sh 控制，8 sh-mRPA3-431）。使用学生不测试测试统计显著性;p = 0.06;[ p ] 0.01。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：YAP/TAZ击倒减轻乳腺癌转移负担。（A&B） 4T1细胞通过西斑分析（A） 或转染分析，可稳稳地表达基于 miR30 的控制 （mCherry） 或串联 YAP/TAZ shRNA （sh-mYAP1/mTAZ6） 使用 YAP/TAZ-TEAD 荧光素酶报告器构造和测定YAP/TAZ-TEAD转录活性，如前文所述15，16 （B）（n= 5用于控制，4表示YAP1/TAZ6）。（C） 显示细胞是如何生成在体内研究的原理图.4T1-Luciferase 细胞感染了逆转录病毒，这些逆转录病毒提供 ZsGreen 和 miR30 shRNA，以 mCherry（对照）为目标，或以 mYAP 和 mTAZ 为目标的串联 miR30 shRNA。在Puromycin（2.5微克/mL）中选择受感染的细胞3天。4T1-荧光酶细胞，在注射的日子里，将酶酶酶酶酶稳稳地表达ZsGreen和控制（sh-mCherry）或YAP/TAZ（sh-mYAP1/mTAZ1）shRNA注射到小鼠体内，并成像进行生物发光。（D&E）在指定注射后当天，每组代表性小鼠的生物发光图像。（F） 在实验过程中为每个小鼠测量的对数10变换的荧光素酶信号的图解。（G） 散射图，每只鼠标的斜率（n = 7 表示 sh-control，8 表示 sh-mRPA3-431），每只鼠标的斜率为均值（实心条）。均值由实线表示。使用学生不测试测试统计显著性;p = 0.06;[，p = 0.01;]***.请点击此处查看此图的较大版本。
图5：转移性乳腺癌细胞对肺部进行殖民化需要YAP和TAZ。（A） 注射后21天，每只小鼠的荧光（左）和亮场（右）图像。（C-E）图像处理与图像分析软件如图3所示。（B&C）手动计数（B） 或通过图像分析软件 （C） 时，带有每个小鼠肺部转移总数的平均数（实心条）的散射图。（D） 使用图像分析软件测量所有转移（mm）的总面积，并绘制为均值（实心条）的转移负担。（E） 每只小鼠都绘制出每个转移的大小。对照小鼠由蓝点表示，sh-mYAP1/mTAZ6 敲落小鼠用红点表示。请注意，刻度条在 1 mm 处分离，以更好地可视化小转移的大小和数量（n = 7 sh 控制，8 sh-mYA1/mTAZ6）。均值由实线表示。使用学生不测试测试统计显著性;[p = 0.05，*，p = 0.01; **.请点击此处查看此图的较大版本。
补充表1：矢量表。列出所有使用的矢量，并描述新的矢量。标准分子生物学技术用于克隆新载体，并包括新描述的97-mer shRNA序列。引文参阅：[1]53， [2]16， [3]54请点击这里下载此表。
补充表2：活体动物成像数据处理和分析实例。演示来自活体动物图像的原始数据如何转换为分析的电子表格，如步骤 6.7 和 6.8 中所述。从体内活体动物成像中获取的原始数据使用日志10变换进行转化。通过计算日志10转换数据生成的斜率，计算每只鼠标的转移性负担变化率。示例包括图 2中的荧光素酶分析。这些列采用颜色编码，以指示用于生成每个斜率值的数据，以及公式嵌入电子表格中。双击井将显示用于处理数据的公式。请点击此处下载此表。
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Discussion
方法的关键步骤
优化给定细胞系和小鼠菌株的细胞数量（步骤 3）至关重要，因为这将极大地影响形成转移的数量和实验的长度。如果注射的细胞过多或转移生长时间过长，转移可能难以计数，因此难以评估基因操作的影响。然而，如果注射的细胞太少，可能形成很少或没有转移。因此，应使用不同数量的细胞进行初步实验，以确定转移生长的最佳数量和时间长度。为了确保一个组内的转移数量一致，重要的是向每只小鼠注入相同数量的活细胞。由于细胞可以同时沉淀在管和注射器中，因此在装入注射器之前，应轻轻重新悬浮细胞，并且细胞悬浮液不应在注射器中保留太久（步骤 4.3.2）。细胞活力降低，细胞悬浮时间越长，因此胰蛋白酶化和细胞注射之间的时间不应超过一小时（步骤4.2.5）。不应注入气泡和大团状细胞，因为这些气泡会导致杀死小鼠的emboli。此外，通过针头向上绘制细胞可以剪切它们，因此注射器应该在没有针头的情况下加载。为了确认注射的细胞数量相对相等，注射后不久可以拍摄体内活体动物图像（图2B，图4D）。
准确和一致地定量生物发光信号很重要，并且取决于细胞的接受和代谢D-荧光素。这可能受许多变量的影响，包括D-荧光素的剂量、注射时间、小鼠的体温、注射时如何麻醉小鼠，以及小鼠在成像前如何定位在麻醉室。因此，对于所有小鼠和成像会话，保持这些步骤一致至关重要。我们在麻醉室使用加热垫来保持小鼠体温的一致性。由于信号必须穿透组织进行生物发光和荧光检测，因此保持每个图像的小鼠位置一致也至关重要（其背面平坦最适合肺部成像）。应始终使用效率 % 单位对体内活体动物成像中的荧光图像进行定量，这样可以适当比较图像。同样，在量化生物发光图像时，应始终使用总通量（光子/秒）。为了分析转移性负担，对原点10变换将增长曲线（在达到最大信号之前）转换为线性图，这是斜率分析所必需的。
方法的修改和故障排除
在提出的协议中，首先用荧光蛋白和荧光素酶稳稳地转导细胞群，然后用对照载体或载体转导目标基因。这确保了两个细胞群具有相似的荧光蛋白和荧光素酶表达。然而，作为替代，可以同时提供其中两个组件的病毒载体。事实上，在具有代表性的实验中，我们使用ZsGreen表达逆转录病毒载体来表达4T1-荧光酶细胞中的shRNA。建议在感兴趣的基因改变后，在所有细胞组中测定荧光酶和荧光蛋白的表达。组之间的不同表达水平会使数据的解释复杂化，因此，如果不同的组具有相似的荧光蛋白和荧光素酶的表达，则最好如此。此外，红血球可以是自荧光的，并可能使其难以可视化肺部的荧光转移。如果是这种情况，在安乐死期间，通过PBS灌注可以从肺部清除红血球，以减少自荧光背景（应遵循适当的安乐死技术和指南）。尽管我们在代表性实验中控制组和击倒组之间的差异是巨大的，但控制小鼠中经常出现在体内转移化分析中固有的小鼠对小鼠变异性（图3B和图5B）。当这种变异性很高时，就很难确定击倒效应的大小。另一种可用于减少这种变异性的方法是，用不同的荧光蛋白和独特的荧光酶标记对照细胞和击倒细胞，然后混合两个种群，数量相等，然后注射混合物。例如，可稳稳地表达番茄和雷尼拉荧光素酶的控制细胞与表达ZsGreen和萤火虫荧光素酶的击倒细胞混合。活体动物成像设备可以区分雷尼拉荧光素酶和萤火虫荧光素酶，番茄与ZsGreen，因此荧光或发光可用于独立量化每个细胞群。事实上，使用活体动物成像装置4，对在活体动物中作为原发性肿瘤生长的4T1细胞进行双荧光素酶成像。但是，需要注意的是，荧光信号可能存在重叠，因此这种方法中应包含光谱解混步骤（参见制造商指南）。此外，雷尼拉荧光素酶和萤火虫荧光素酶应单独成像，具有足够的时间延迟，使第一个荧光素酶信号在成像第二个信号之前不再可检测到。使用不同的荧光草仍然使肺转移的数量和大小被量化16。为了测试转移殖民化和生长在除肺以外的其他器官，该协议可以修改，并用于心脏内和门户静脉注射9，10。
方法的限制
使用体内活体动物成像装置与荧光标记的癌细胞一起获得实时转移负担，为测定转移殖民化和后续生长提供了一种强有力的方法;但是，这种方法有局限性。某些基因可能需要先天细胞增殖，而不是在转移中的特定作用。体外细胞增殖测定可以在体内实验之前进行，以确定该基因是否破坏体外生长。当成像活体动物时，转移的生物发光或荧光信号必须足够强，才能通过组织。此外，组织的光学特性（即吸收和散射）也影响检测55。激发光源必须能够通过组织来激发荧光标记的癌细胞，生物发光具有比荧光更大的动态范围。因此，虽然荧光可用于活体动物成像，但生物发光是检测内部器官信号的首选。此外，一些免疫能力小鼠菌株可能排斥表达荧光蛋白的细胞。事实上，我们发现，在BALB/c小鼠中生长时，表达番茄、GFP或mCherry的细胞被拒绝或降低调节荧光酸（未显示和15）。然而，如此处所示（图3和图5）和之前15，16，ZsGreen标记的细胞是可检测在这些小鼠。在荧光蛋白表达变得无法检测的情况下，另一种量化相对转移殖民化的方法是使用qPCR量化荧光基因或集成病毒载体15中的另一个基因。尽管活体动物成像设备允许您检测转移性负担的变化，但它不允许确定这些变化是否由于转移大小或数量的变化。它还不提供有关转移位置的空间信息。此外，信号的强度可能受它在组织的深度的影响。
该方法的意义和潜在的未来应用
有许多方法可以修改此方法以获得更多或不同的信息。各种癌细胞系，包括人类癌细胞系或患者衍生的异种移植物可用于此测定。其他小鼠模型也可用于使用，包括转基因或敲除小鼠，旨在测试基质细胞制成的靶向蛋白如何影响注射癌细胞的转移殖民化和生长。如果有多个候选基因需要测试，这种方法可以多路复用，因为体内活体动物成像设备可以检测和区分各种荧光道。这将减少所需的小鼠数量，并增加可测试的目标数。活体动物成像也可以与X射线或CT9成像相结合，提供有关转移位置的更多空间信息。最后，可以修改此方法，以在转移殖民化级联中分析更具体的步骤。例如，在注射后头3天内（如此处完成16）中，通过量化肺部多个时间点的肿瘤细胞数量，可以区分肿瘤细胞播种（血管内生存、外溢和术后存活）的步骤。在这种情况下，肺也可以沾染血管标记和图像前体内，以确定癌细胞的百分比，每次点56，57。
总之，在尾静脉注射后，使用荧光和发光癌细胞的实时活体动物成像，可以更详细地分析候选基因或基因如何影响转移性殖民化和后续生长。这种方法比自体小鼠模型更快、更便宜，避免了自发转移模型的一些注意事项。使用荧光和发光作为检测和量化转移的手段，使研究人员能够独立读取结果，从而提高对结果的信心，并使实验设计具有灵活性。使用荧光来量化转移大小和数量，避免了耗时且可能代价高昂的组织学处理和分析，并允许对整个组织进行额外使用。该协议可用于多种不同的技术，以操纵候选基因的表达或功能，如RNAi、转基因表达或CRISPR/Cas介导编辑，也可用于测试小分子、功能阻断抗体或其他潜在的治疗化合物。如上所述，可以进行几个简单的修改，以增强测定并提供其他信息。这种方法是识别和测试具有治疗癌症治疗潜力的亲转移基因的理想方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢艾米莉·诺顿协助病毒感染和批判性阅读手稿。我们还感谢Ryan Kanai帮助获取肺部图像，凯特E.Tubbesing帮助研究肺部绿色转移的图像分析。我们感谢动物研究设施的工作人员的支持和协助，在编写这个视频。这项工作得到了苏珊·科门职业催化剂奖的支持，该奖金授予J.M.L.（#CCR17477184）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
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