Summary

Kombineret brug af hale vene metastase assays og Real-Time in vivo billeddannelse at kvantificere brystkræft metastatisk kolonisering og byrde i lungerne

Published: December 19, 2019
doi:

Summary

Den beskrevne fremgangsmåde kombinerer eksperimentelle hale vene metastase assays med in vivo levende dyr billeddannelse at tillade real-time overvågning af brystkræft metastase dannelse og vækst i tillæg til kvantificering af metastase antal og størrelse i lungerne.

Abstract

Metastase er hovedårsagen til kræftrelaterede dødsfald, og der er begrænsede terapeutiske muligheder for patienter med metastatisk sygdom. Identifikation og afprøvning af nye terapeutiske mål, der vil lette udviklingen af bedre behandlinger for metastatisk sygdom, kræver prækliniske in vivo-modeller. Demonstreret her er en og musemodel for bestemmelse brystkræft metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst. Metastatiske kræftceller er stabilt transduceret med virale vektorer kodning Firefly der og zsgreen proteiner. Kandidat gener er derefter stabilt manipuleret i luciferase/ZsGreen-udtrykker kræftceller og derefter cellerne injiceres i mus via den laterale hale vene til at assay metastatisk kolonisering og vækst. En in vivo Billeddannende anordning anvendes derefter til at måle tumor cellernes bioluminescens eller fluorescens i de levende dyr for at kvantificere ændringer i metastatisk byrde over tid. Udtrykket af det fluorescerende protein gør det muligt at kvantificere antallet og størrelsen af metastaser i lungerne ved afslutningen af forsøget uden behov for skæring eller histologisk farvning. Denne tilgang giver en relativt hurtig og nem måde at teste rollen af kandidat gener i metastatisk kolonisering og vækst, og giver en hel del mere information end traditionelle hale vene metastase assays. Ved hjælp af denne tilgang viser vi, at samtidig Knockdown af ja associeret protein (YAP) og transkriptional Co-aktivator med et PDZ-bindende motiv (TAZ) i brystkræft celler fører til reduceret metastatisk byrde i lungerne, og at denne reducerede byrde er resultatet af signifikant forringet metastatisk kolonisering og reduceret vækst af metastaser.

Introduction

Kræft er fortsat den anden førende dødsårsag verdensomspændende1 og metastase er ansvarlig for de fleste af disse dødsfald2,3. En begrænset forståelse af de molekylære mekanismer, der regulerer metastatisk kolonisering og efterfølgende vækst, har imidlertid hindret udviklingen af effektive behandlinger for metastatisk sygdom. Identifikationen af nye terapeutiske mål kræver en analyse for at teste, hvordan rystet udtryk eller funktion af et kandidat-gen påvirker metastase dannelse og vækst. Mens autoktont musemodeller har deres fordele, er de tidskrævende og dyre at generere, hvilket gør dem mere velegnede til målvalidering i stedet for Målsøgning. Transplantations modelsystemer, hvor kandidat genet er rystet i kræftceller in vitro og derefter virkninger på metastatisk potentiale vurderes in vivo, er billigere og højere gennemløb end autoktone modeller. Desuden er virale vektorer for stabil levering af RNAi, crispr/CAS9, og Trans Genes er bredt tilgængelige, hvilket gør det relativt let at forstyrrer næsten ethvert gen eller gener af interesse i en Cancer cellelinjer. Denne fremgangsmåde kan også bruges til at assay rollen af kandidat gener i metastatisk kolonisering og vækst i humane Cancer cellelinjer ved at transplanteres cellerne til immunkompromitterede eller humaniserede mus.

De to typer af assays, der anvendes til at teste metastase dannelse ved transplanterede cancerceller in vivo er spontane metastase assays og eksperimentelle metastase assays. I spontane metastase assays4,5, kræftceller injiceres i mus, lov til at danne en primær tumor, og derefter spontan metastase dannelse og efterfølgende vækst er analyseret. Styrken af denne model er, at cellerne skal fuldføre alle trin i den metastatiske proces for at danne metastatiske tumorer. Men, mange kræft cellelinjer ikke metastaserer effektivt i spontane metastase modeller, og enhver manipulation af de celler, der påvirker primær tumorvækst kan tolerere resultaterne af metastase assay. Eksperimentelle metastase assays, hvor kræftceller injiceres direkte i omløb, anvendes til at undgå disse faldgruber. Almindeligt eksperimentelle metastase assays omfatter hale vene injektion6,7,8 (og påvist her), intrakardiel injektion9, og Portal vene injektion10.

Formålet med protokollen præsenteres her er at give en in vivo eksperimentel metastase assay, der giver en forsker til at overvåge metastase dannelse og vækst i realtid, samt at kvantificere slutpunktet metastase nummer og størrelse i lungerne af samme mus. For at opnå dette, traditionelle eksperimentelle hale vene metastaser assays6,7,8 kombineres med levende dyr billeddannelse, ved hjælp af en in vivo billedenhed9,11,12,13,14. Tumor celler, der stabilt udtrykker både der og et fluorescerende protein injiceres i mus via den laterale hale vene, og derefter anvendes in vivo billedenheden til at måle ændringer i metastatisk belastning i lungerne over tid (figur 1). In vivo Live Animal Imaging-enheden kan dog ikke skelne mellem eller måle størrelsen af individuelle metastaser. Ved afslutningen af forsøget anvendes et fluorescerende stereomicroskop til at tælle antallet og måle størrelsen af de fluorescerende metastaser i lungerne uden behov for skæring og histologi eller Immunhistokemi (figur 1). Denne protokol kan bruges til at teste, hvordan ændring af udtryk eller funktion af et kandidat-gen påvirker metastase dannelse og vækst. Potentielle terapeutiske forbindelser såsom små molekyler eller funktions blokerende antistoffer kan også testes.

For at demonstrere denne tilgang, vi først udført et bevis for koncept eksperiment, hvor den væsentlige replikation faktor, replikation protein a3 (RPA3) er slået ned i metastatisk mus brystkræft celler. Vi viser, at mus injiceret med RPA3 Knockdown celler har betydeligt mindre metastatisk byrde på hvert tidspunkt i forhold til mus injiceres med kontrol celler. Analyse af de metastase-holdige lunger viser, at denne reducerede metastatiske byrde er resultatet af signifikant reduceret metastatisk kolonisering og nedsat vækst af de metastaser, der dannes. For yderligere at demonstrere denne teknik, vi testede, om samtidige knock down af ja associerede protein (YAP) og transkriptional Co-aktivator med en PDZ-bindende motiv (TAZ) hæmmer metastatisk kolonisering eller efterfølgende vækst. YAP og TAZ er to relaterede transkriptionelle Co-aktivatorer, der er de kritiske downstream effektorer af Hippo pathway. Vi15,16 og andre har impliceret Yap og Taz i metastase (revideret i17,18,19), tyder på, at disse proteiner er gode terapeutiske mål. Konsekvent, vi fandt, at mus injiceres med YAP/TAZ Knockdown celler havde signifikant reduceret metastatisk byrde. Analyse af lungerne viste, at YAP/TAZ Knockdown celler dannede mange færre metastaser, og at de metastaser, der gjorde form var mindre. Disse eksperimenter viser, hvordan eksperimentelle metastase assays giver en forsker til hurtigt og billigt at teste rollen af et kandidat-gen i metastase dannelse og vækst. De viser yderligere, hvordan den kombinerede anvendelse af levende animalsk billeddannelse og fluorescerende kvantificering af metastaser i hele lunger gør det muligt for forskeren bedre at forstå trinene under metastatisk kolonisering.

Protocol

Denne protokol omfatter brug af mus og biologisk farlige materialer og kræver godkendelse fra de relevante institutionelle sikkerhedsudvalg. Alle de beskrevne in vivo arbejde her er godkendt af Albany Medical College institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC). Bemærk: for en protokol oversigt, se skematisk i figur 1. 1. emballering af alle påkrævede retrovira og lentivira Bemærk: den beskrevne protokol…

Representative Results

For at demonstrere ovenstående fremgangsmåde udførte vi et proof of concept-eksperiment, hvor en kritisk Replikerings faktor, RPA3 blev slået ned i en metastatisk mus brystkarcinom cellelinje (4t122). Mens protokollen beskriver mærkning cellerne med både der og fluorescerende proteiner forud for genetisk manipulation, vi brugte en modificeret tilgang, fordi RNAi vektorer også levere zsgreen (figur 2a). For det første var 4t1 celler stabilt tra…

Discussion

Kritiske trin i metoden
Det er afgørende at optimere antallet af injicerede celler (trin 3) for en given cellelinje og musestamme, da dette i høj grad kan påvirke antallet af metastaser, der dannes, og længden af eksperimentet. Hvis der injiceres for mange celler, eller hvis metastaser vokser for længe, kan det være svært at tælle metastaser, hvilket gør det vanskeligt at vurdere virkningerne af den genetiske manipulation. Men, hvis for få celler injiceres, få eller ingen metastaser kan dan…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Emily Norton for at hjælpe med virusinfektioner og kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også Ryan Kanai for hjælp til at erhverve billeder af lungerne og Kate E. Tubbesing for at få hjælp til billedanalyse af de grønne metastaser i lungerne. Vi takker dyreforsknings facilitetens personale for deres støtte og for hjælp til forberedelsen af denne video. Dette arbejde blev støttet af en Susan G. Komen Career Catalyst Grant, der blev tildelt J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

References

  1. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  2. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  3. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  4. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  5. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  6. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  7. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  8. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  9. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  10. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  11. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  12. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  13. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  16. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  17. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  18. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  19. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  20. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  21. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  22. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  23. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  24. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
  25. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  26. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
  27. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  28. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  29. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  30. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  31. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  32. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  33. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
  34. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, 1523-1536 (2014).
  35. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  36. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  37. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  38. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  39. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  40. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 1744-1753 (2018).
  41. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  42. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  43. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  44. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  45. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  46. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  47. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  48. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
  49. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  50. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  51. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  52. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  53. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, 217-225 (2005).
  54. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  55. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  56. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

Play Video

Cite This Article
Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

View Video