Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões
Summary
A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.
Abstract
A metástase é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e há opções terapêuticas limitadas para pacientes com doença metastática. A identificação e o teste de novos alvos terapêuticos que facilitarão o desenvolvimento de melhores tratamentos para doençametastática requer modelos in vivo pré-clínicos. Demonstrado aqui é um modelo de camundongo singênico para atribuir câncer de mama colonização metastática e crescimento subseqüente. As células cancerosas metastáticas são transinduzidas de forma estrutumsónte com vetores virais codificando protecções de vaga-lume e ZsGreen. Os genes candidatos são então manipulados de forma evigorada em células cancerosas lúciferase/ZsGreen e, em seguida, as células são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda para analisar a colonização e o crescimento metastáticos. Um dispositivo de imagem in vivo é então usado para medir a bioluminescência ou fluorescência das células tumorais nos animais vivos para quantificar as mudanças na carga metastática ao longo do tempo. A expressão da proteína fluorescente permite que o número e o tamanho das metástases nos pulmões sejam quantificados no final do experimento sem a necessidade de secção ou coloração histológica. Esta abordagem oferece uma maneira relativamente rápida e fácil de testar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento, e fornece muito mais informações do que os ensaios tradicionais de metástase da veia da cauda. Usando essa abordagem, mostramos que o knockdown sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) em células de câncer de mama leva à redução da carga metastática nos pulmões e que esta carga reduzida é o resultado de colonização metastática significativamente prejudicada e crescimento reduzido de metástases.
Introduction
O câncer continua a ser a segunda principal causa de morte em todo o mundo1 e metástase é responsável pela maioria dessas mortes2,3. No entanto, uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares que regem a colonização metastática e o crescimento subsequente tem dificultado o desenvolvimento de tratamentos eficazes para a doença metastática. A identificação de novos alvos terapêuticos requer um ensaio para testar como a expressão ou função perturbada de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Embora os modelos de mouse autrátecos tenham suas vantagens, eles são demorados e caros de gerar, tornando-os mais adequados para a validação de destino em vez de descoberta de destino. Os sistemas de modelos de transplante em que o gene candidato é perturbado nas células cancerosas in vitro e, em seguida, os efeitos sobre o potencial metastático são avaliados in vivo, são menos caros e de maior rendimento do que os modelos autótos. Além disso, os vetores virais para entrega estável de RNAi, CRISPR/CAS9 e transgenes estão amplamente disponíveis, tornando relativamente fácil perturbar praticamente qualquer gene ou genes de interesse em linhas de células cancerosas. Esta abordagem também pode ser usada para analisar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento em linhas de células cancerosas humanas, transplantando as células em camundongos imunocomprometidos ou humanizados.
Os dois tipos de ensaios utilizados para testar a formação da metástase por células cancerosas transplantadas in vivo são ensaios de metástase espontânea e ensaios de metástase experimental. Em ensaios metástase espontânea4,5, as células cancerosas são injetadas em camundongos, autorizados a formar um tumor primário, e, em seguida, a formação metástase espontânea e crescimento subseqüente são ensaios. A força deste modelo é que as células devem completar todas as etapas do processo metastático, a fim de formar tumores metastáticos. No entanto, muitas linhas de células cancerosas não metástase eficientemente em modelos de metástase espontânea, e qualquer manipulação das células que impacta o crescimento do tumor primário pode confundir os resultados do ensaio metástase. Ensaios experimentais de metástase, em que as células cancerosas são injetadas diretamente em circulação, são usados para evitar essas armadilhas. Os ensaios experimentais comuns da metástase incluem a injeção da veia da cauda6,7,8 (e demonstrado aqui), injeção intracardiac9,e injeção da veia do portal10.
O objetivo do protocolo apresentado aqui é fornecer um ensaio de metástase experimental in vivo que permita que um pesquisador monitore a formação e o crescimento da metástase em tempo real, bem como quantificar o número e o tamanho da metástase do ponto final nos pulmões do mesmo rato. Para isso, a tradicional metástase experimental da veia da cauda conta6,7,8 são combinadas com imagens de animais vivos, utilizando um dispositivo de imagem in vivo9,11,12,13,14. As células tumorais expressando de forma evigorada tanto a luciferase quanto uma proteína fluorescente são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda e, em seguida, o dispositivo de imagem in vivo é usado para medir mudanças na carga metastática nos pulmões ao longo do tempo (Figura 1). No entanto, o dispositivo de imagem animal vivo in vivo não pode distinguir ou medir o tamanho das metástases individuais. Assim, no final do experimento, um estreoscópio fluorescente é usado para contar o número e medir o tamanho das metástases fluorescentes nos pulmões sem a necessidade de secção e histologia ou imunohistoquímica (Figura 1). Este protocolo pode ser usado para testar como alterar a expressão ou função de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Potenciais compostos terapêuticos, como pequenas moléculas ou anticorpos de bloqueio de função também podem ser testados.
Para demonstrar essa abordagem, primeiro realizamos um experimento de prova de conceito no qual o fator essencial de replicação, a proteína de replicação A3 (RPA3) é derrubado em células metastáticas de câncer de mama de camundongos. Nós mostramos que os ratos injetados com células rpa3 knockdown têm significativamente menos carga metastática em cada ponto de tempo em comparação com ratos injetados com células de controle. A análise dos pulmões contendo metástasidade mostra que essa redução da carga metastática é o resultado de uma colonização metastática significativamente reduzida e crescimento prejudicado das metástases que se formam. Para demonstrar ainda mais essa técnica, testamos se a queda sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) prejudica a colonização metastática ou o crescimento subsequente. YAP e TAZ são dois co-ativadores transcricionais relacionados que são os efetores críticos a jusante do Caminho do Hipopótamo. Nós15,16 e outros implicamos YAP e TAZ na metástase (revista em17,18,19), sugerindo que essas proteínas são bons alvos terapêuticos. Consistentemente, nós encontramos que os ratos injetados com pilhas do knockdown de YAP/TAZ tinham reduzido significativamente a carga metastática. A análise dos pulmões mostrou que as células knockdown YAP/TAZ formaram muito menos metástases e que as metástases que se formaram eram menores. Esses experimentos demonstram como os ensaios de metástase experimental permitem que um pesquisador teste rapidamente e barata o papel de um gene candidato na formação e crescimento da metástase. Eles mostram ainda como o uso combinado de imagens de animais vivos e quantificação fluorescente de metástases em pulmões inteiros permite ao pesquisador entender melhor os passos durante a colonização metastática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas do método
É fundamental otimizar o número de células injetadas (passo 3) para uma determinada linha celular e tensão do mouse, pois isso pode influenciar muito o número de metástases que se formam e a duração do experimento. Se muitas células são injetadas ou as metástases crescem por muito tempo, as metástases podem ser difíceis de contar tornando os efeitos da manipulação genética difíceis de avaliar. No entanto, se muito poucas células são injetadas, poucas ou n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos emily norton para ajudar com infecções virais e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também Ryan Kanai para ajudar a adquirir imagens dos pulmões e Kate E. Tubbesing para ajudar com a análise de imagem das metástases verdes nos pulmões. Agradecemos ao pessoal do centro de investigação animal pelo seu apoio e pela assistência na preparação deste vídeo. Este trabalho foi apoiado por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
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