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Cancer Research

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60687
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Summary

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Abstract

A metástase é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e há opções terapêuticas limitadas para pacientes com doença metastática. A identificação e o teste de novos alvos terapêuticos que facilitarão o desenvolvimento de melhores tratamentos para doençametastática requer modelos in vivo pré-clínicos. Demonstrado aqui é um modelo de camundongo singênico para atribuir câncer de mama colonização metastática e crescimento subseqüente. As células cancerosas metastáticas são transinduzidas de forma estrutumsónte com vetores virais codificando protecções de vaga-lume e ZsGreen. Os genes candidatos são então manipulados de forma evigorada em células cancerosas lúciferase/ZsGreen e, em seguida, as células são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda para analisar a colonização e o crescimento metastáticos. Um dispositivo de imagem in vivo é então usado para medir a bioluminescência ou fluorescência das células tumorais nos animais vivos para quantificar as mudanças na carga metastática ao longo do tempo. A expressão da proteína fluorescente permite que o número e o tamanho das metástases nos pulmões sejam quantificados no final do experimento sem a necessidade de secção ou coloração histológica. Esta abordagem oferece uma maneira relativamente rápida e fácil de testar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento, e fornece muito mais informações do que os ensaios tradicionais de metástase da veia da cauda. Usando essa abordagem, mostramos que o knockdown sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) em células de câncer de mama leva à redução da carga metastática nos pulmões e que esta carga reduzida é o resultado de colonização metastática significativamente prejudicada e crescimento reduzido de metástases.

Introduction

O câncer continua a ser a segunda principal causa de morte em todo o mundo1 e metástase é responsável pela maioria dessas mortes2,3. No entanto, uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares que regem a colonização metastática e o crescimento subsequente tem dificultado o desenvolvimento de tratamentos eficazes para a doença metastática. A identificação de novos alvos terapêuticos requer um ensaio para testar como a expressão ou função perturbada de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Embora os modelos de mouse autrátecos tenham suas vantagens, eles são demorados e caros de gerar, tornando-os mais adequados para a validação de destino em vez de descoberta de destino. Os sistemas de modelos de transplante em que o gene candidato é perturbado nas células cancerosas in vitro e, em seguida, os efeitos sobre o potencial metastático são avaliados in vivo, são menos caros e de maior rendimento do que os modelos autótos. Além disso, os vetores virais para entrega estável de RNAi, CRISPR/CAS9 e transgenes estão amplamente disponíveis, tornando relativamente fácil perturbar praticamente qualquer gene ou genes de interesse em linhas de células cancerosas. Esta abordagem também pode ser usada para analisar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento em linhas de células cancerosas humanas, transplantando as células em camundongos imunocomprometidos ou humanizados.

Os dois tipos de ensaios utilizados para testar a formação da metástase por células cancerosas transplantadas in vivo são ensaios de metástase espontânea e ensaios de metástase experimental. Em ensaios metástase espontânea4,5, as células cancerosas são injetadas em camundongos, autorizados a formar um tumor primário, e, em seguida, a formação metástase espontânea e crescimento subseqüente são ensaios. A força deste modelo é que as células devem completar todas as etapas do processo metastático, a fim de formar tumores metastáticos. No entanto, muitas linhas de células cancerosas não metástase eficientemente em modelos de metástase espontânea, e qualquer manipulação das células que impacta o crescimento do tumor primário pode confundir os resultados do ensaio metástase. Ensaios experimentais de metástase, em que as células cancerosas são injetadas diretamente em circulação, são usados para evitar essas armadilhas. Os ensaios experimentais comuns da metástase incluem a injeção da veia da cauda6,7,8 (e demonstrado aqui), injeção intracardiac9,e injeção da veia do portal10.

O objetivo do protocolo apresentado aqui é fornecer um ensaio de metástase experimental in vivo que permita que um pesquisador monitore a formação e o crescimento da metástase em tempo real, bem como quantificar o número e o tamanho da metástase do ponto final nos pulmões do mesmo rato. Para isso, a tradicional metástase experimental da veia da cauda conta6,7,8 são combinadas com imagens de animais vivos, utilizando um dispositivo de imagem in vivo9,11,12,13,14. As células tumorais expressando de forma evigorada tanto a luciferase quanto uma proteína fluorescente são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda e, em seguida, o dispositivo de imagem in vivo é usado para medir mudanças na carga metastática nos pulmões ao longo do tempo (Figura 1). No entanto, o dispositivo de imagem animal vivo in vivo não pode distinguir ou medir o tamanho das metástases individuais. Assim, no final do experimento, um estreoscópio fluorescente é usado para contar o número e medir o tamanho das metástases fluorescentes nos pulmões sem a necessidade de secção e histologia ou imunohistoquímica (Figura 1). Este protocolo pode ser usado para testar como alterar a expressão ou função de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Potenciais compostos terapêuticos, como pequenas moléculas ou anticorpos de bloqueio de função também podem ser testados.

Para demonstrar essa abordagem, primeiro realizamos um experimento de prova de conceito no qual o fator essencial de replicação, a proteína de replicação A3 (RPA3) é derrubado em células metastáticas de câncer de mama de camundongos. Nós mostramos que os ratos injetados com células rpa3 knockdown têm significativamente menos carga metastática em cada ponto de tempo em comparação com ratos injetados com células de controle. A análise dos pulmões contendo metástasidade mostra que essa redução da carga metastática é o resultado de uma colonização metastática significativamente reduzida e crescimento prejudicado das metástases que se formam. Para demonstrar ainda mais essa técnica, testamos se a queda sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) prejudica a colonização metastática ou o crescimento subsequente. YAP e TAZ são dois co-ativadores transcricionais relacionados que são os efetores críticos a jusante do Caminho do Hipopótamo. Nós15,16 e outros implicamos YAP e TAZ na metástase (revista em17,18,19), sugerindo que essas proteínas são bons alvos terapêuticos. Consistentemente, nós encontramos que os ratos injetados com pilhas do knockdown de YAP/TAZ tinham reduzido significativamente a carga metastática. A análise dos pulmões mostrou que as células knockdown YAP/TAZ formaram muito menos metástases e que as metástases que se formaram eram menores. Esses experimentos demonstram como os ensaios de metástase experimental permitem que um pesquisador teste rapidamente e barata o papel de um gene candidato na formação e crescimento da metástase. Eles mostram ainda como o uso combinado de imagens de animais vivos e quantificação fluorescente de metástases em pulmões inteiros permite ao pesquisador entender melhor os passos durante a colonização metastática.

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Protocol

Este protocolo envolve o uso de camundongos e materiais bioperigosos e requer a aprovação dos comitês de segurança institucional apropriados. Todo o trabalho in vivo descrito aqui é aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Albany Medical College (IACUC).

NOTA: Para uma visão geral do protocolo, veja esquema na Figura 1.

1. Empacotando todos os retrovírus e lentivírus necessários

NOTA: O protocolo descrito usa vetores lentivirais ou retrovirais para expressar de forma etona uma enzima luciferase e proteína fluorescente, bem como para manipular a expressão de um gene candidato. Estes vírus são embalados em células HEK-293FT, conforme descrito abaixo.

  1. Dia 1: Células HEK-293FT em placas de 6 poços em 2 mL de mídia de crescimento completo (10% FBS em DMEM com 1% penicilina/estreptomicina e 2 mM L-Glutamina) para que sejam 40-60% confluentcono no dia 2. Incubar a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
  2. Dia 2: Para que cada vetor viral seja embalado, transfect um poço de confluent de 40-60% de pilhas HEK-293FT com o vetor retroviral ou lentiviral e os vetores apropriados que codificam o revestimento viral e as proteínas de empacotamento.
    NOTA: Este protocolo usa VSVG como a proteína do revestimento, psPAX2 para empacotamento lentiviral, e mordaça-pol para o empacotamento retroviral (veja a tabela suplementar 1 para a lista do vetor).
  3. Faça uma mistura de co-transfecção para cada um bem como segue:
    1. Combine 4 μL de solução lipídica para transfecções (ver Tabela de Materiais)e 96 μL de buffer de transfecção e incubar por 5 minutos.
    2. Adicione 1 μg de vetor viral, 0,5 μg de vetor de proteína de revestimento (VSVG) e 0,5 μg de vetores de proteína de embalagem (psPAX2 ou gag-pol) e incubado por 20 minutos.
    3. Adicione suavemente a mistura de co-transfecção do passo 1.3.2 às células HEK-293FT banhadas no passo 1.1 e incubam a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
  4. Dia 3: Retire os meios contendo transfecção de cada poço e adicione suavemente 2 mL de mídia de crescimento completo para cada poço. Incubar a 37 °C, 5% CO2 por aproximadamente 24 horas.
  5. Dia 4: Colete o supernatant viral de cada poço usando uma seringa de 3 mL e filtre através de um filtro de 0,45 μm em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  6. Opcional: Se a coleta de um segundo lote de vírus for desejada, adicione suavemente 2 mL de mídia de crescimento completo a cada poço e incubar em 37 °C, 5% CO2 por aproximadamente 24 horas.
  7. Dia 5 (Opcional): Recolher uma segunda rodada de supernatant viral como no passo 1.5.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado congelando o supernatant viral.

2. Geração de células cancerosas expressando luciferase e uma proteína fluorescente

NOTA: O seguinte protocolo descreve como primeiro rotular células 4T1 com lúciferase de vaga-lume e uma proteína fluorescente (ZsGreen) usando dois vetores com genes de seleção exclusivos. Em seguida, um vetor viral 3rd é usado para manipular a expressão de um gene candidato. No entanto, vetores virais que simultaneamente entregam uma proteína fluorescente e uma manipulação genética também podem ser usados como uma alternativa (como nos experimentos representativos abaixo). Outras células cancerosas podem ser usadas, mas os números celulares devem ser otimizados para as etapas 2.1 e 2.7.1.

  1. Células 4T1 de placa em 1,5 x 105 células/poço em uma placa de 12 poços em mídia de crescimento completo (10% FBS em DMEM com 1% penicilina/estreptomicina e 2 mM L-Glutamina) e incubada em 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
  2. Infectar as células 4T1 com o supernatant viral gerado na etapa 1 da seguinte forma.
    1. Ascutu os meios de crescimento das células e adicione 500 μL de supernatant viral luciferase e 500 μL de proteína fluorescente supernatant viral para infectar simultaneamente as células com ambos os supernatants viral luciferase e proteína fluorescente.
    2. Adicionar 1 μL de 8 mg/mL hexadimetrina brometo (ver Tabela de Materiais).
    3. Incubar as células a 37 °C, 5% até 75-90% confluent (tipicamente 24-48 horas).
  3. Trypsinize as células 4T1 com 500 μL de trippsina por 2-5 minutos (as células devem enxaguar livremente fora do fundo do poço). Transfira todas as células para um prato de 6 cm em 4 mL de mídia de seleção (mídia de crescimento completo contendo os antibióticos apropriados) saciando assim a tripse. Placa de um prato de 6 cm de células de controle não infectadas nos mesmos meios de seleção.
    NOTA: A concentração adequada de antibióticos deve ser determinada antes do tempo, testando várias doses. Além disso, a triagem celular ativada por fluorescência também pode ser usada para selecionar as células com rótulo fluorescente no lugar da seleção de medicamentos.
  4. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2 em meios de seleção e dividir as células quando necessário até que todas as células controle não infectadas estão mortos (dependente do gene de seleção e linha celular).
  5. Confirme que as células 4T1 infectadas estão expressando a proteína fluorescente ZsGreen usando uma excitação verde (450-490 nm)/emission (500-550 nm) filtro definido em um microscópio fluorescente invertido em ampliação 50-100x.
  6. Confirme que as células 4T1 infectadas estão expressando luciferase usando um kit de atividade de luciferase comercialmente disponível da seguinte forma.
    1. Use um volume mínimo de 1x passivo lysis buffer para lyse luciferase expressando células 4T1 e controle 4T1 células que não expressam luciferase, agitando suavemente por 30 minutos.
    2. Adicione 20 μL de lysato celular a uma placa de 96 poços de fundo branco e, em seguida, 50 μL do reagente de ensaio luciferase do kit de atividade luciferase.
    3. Use um leitor de placa para medir a luminescência das células em todos os comprimentos de onda no espectro usando a configuração de luminescência.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado congelando as células de solucionadamente transinduzidas.
  7. Manipular a expressão do gene candidato da seguinte forma:
    1. Placa 6 x 105 rotuladas 4T1 células do passo 2.6 em um prato de 60 mm em 4 mL de mídia de crescimento completo e incubar em 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
    2. Aspirar a mídia de crescimento de cada poço e adicionar 2 mL de mídia de crescimento completo contendo 4 μL de 8 mg/mL hexadimetrina brometo.
    3. Adicione 2 mL de supernatant viral do passo 1 para as células banhadas a partir do passo 2.7.2 e incubar a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
    4. Trypsinize as células 4T1 com 500 μL de trippsina por 2-5 minutos (as células devem enxaguar livremente fora do fundo do poço). Transfira todas as células para um prato de 10 cm em 10 mL de mídia de seleção (mídia de crescimento completo contendo os antibióticos apropriados) saciando assim a trippsina. Placa de alguns controle não infectadorotulado células 4T1 nos mesmos meios de seleção.
    5. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2 em meios de seleção e dividir as células quando necessário até que todas as células não infectadas estão mortos.
    6. Confirme que a expressão do gene candidato é alterada usando uma abordagem padrão, como mancha ocidental20 ou qPCR21.
    7. Ensaio luminescência e fluorescência como nos passos 2.5-2.6 para determinar o quão semelhantes eles estão no controle e células knockdown, como isso pode mudar (ver Discussão).
      NOTA: O protocolo pode ser pausado congelando as células de solucionadamente transinduzidas.

3. Otimização do design experimental in vivo

  1. Otimizar o número de células apropriado e a duração do experimento para a carga metastática desejada da seguinte forma.
    1. Expandir as células 4T1 fluorescentes e bioluminescentes do passo 2.6 em mídia de crescimento completo para que as células em excesso estejam disponíveis no dia desejado de injeção.
    2. Prepare as células para injeções de veia da cauda, como descrito no passo 4.2. Para determinar o número óptimo da pilha para injeções, resuspenda as pilhas em diversas concentrações diferentes em 100 μL de 1x PBS.
      NOTA: Recomendamos testar uma variedade de números de celular / mouse de 25.000 até 500.000.
    3. Mantenha as suspensões celulares no gelo até a injeção.
    4. Injete cada diluição de células 4T1 do passo 3.1.2 em 3-4 camundongos através da veia lateral da cauda descrita no passo 4.3 (veja abaixo).
    5. Devolva o mouse à sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir uma recuperação completa. Os ratos devem ser verificados para sinais da dor ou da aflição 3x semanalmente.
    6. Monitore camundongos para formação e crescimento de metástase por 3-6 semanas (linha celular e tensão do rato dependente) usando um dispositivo de imagem animal vivo in vivo (ver etapas 5 e 6).
      1. Eutanásia ratos 3-6 semanas após a injeção da veia da cauda de acordo com diretrizes institucionais padrão.
      2. Prepare os pulmões e avalie o tamanho e o número da metástase descritos na etapa 7.
      3. Escolha o período de tempo apropriado para que as metástases cresçam para a carga metastática desejada (veja a discussão).

4. Injeção da veia da cauda de pilhas de cancro etiquetadas

NOTA: Passo 4.2.4 foi otimizado para células 4T1 que crescem em camundongos BALB/c singênicos. Se outras linhas celulares cancerosas e cepas de camundongos forem usadas, o número de células injetadas e o comprimento do ensaio devem ser otimizados primeiro.

  1. Expandir as linhas de célula4T1 geradas no passo 2 em dois pratos de 15 cm em mídia de crescimento completo para que o excesso de células estejam disponíveis no dia da injeção.
  2. Prepare as células para a injeção da veia da cauda da seguinte forma:
    1. Assaa a mídia e lave as placas celulares com 1x PBS.
    2. Trypsinize as células com 5 mL de trippsina por placa de 15 cm por 2-5 minutos (as células devem enxaguar livremente fora do fundo do poço). Transfira todas as células para um tubo cônico. Lave as células restantes do prato de cultura de tecido com bastante mídia de crescimento completo para saciar a triptina e adicionar a lavagem para o mesmo tubo cônico.
    3. Conte as células usando um contador de células automatizado para determinar o número total da célula.
    4. Centrífugas as células em 122 x g por 3 minutos, aspirar o supernatant, e resuspender as células em 1x PBS na concentração desejada. Aqui, 2,5 x 104 células são injetadas em cada rato em 100 μL de PBS, de modo que as células resuspendem em 2,5 x 105 células/mL. Mantenha as suspensões celulares no gelo até a injeção.
      NOTA: é importante limitar a quantidade de tempo entre a trippsinização das células e a injeção da veia da cauda para cerca de 1 hora.
  3. Injete células 4T1 do passo 4.2.5 em camundongos através da veia lateral da cauda da seguinte forma:
    1. Trabalhando em um capuz na instalação animal, misture suavemente, mas completamente as células, invertendo o tubo ou usando uma seringa de 1 mL para garantir que eles sejam resuspensos uniformemente. Certifique-se sempre que as células sejam resuspensas antes de carregar a seringa.
    2. Carregue uma seringa de 1 mL Luer-lock com suspensão celular e expela bolhas de ar em excesso. Coloque uma agulha de 1/2 polegada, calibre 30 na seringa com o bisumo para cima e expelir bolhas de ar.
    3. Coloque suavemente o rato em um condesão de roedores.
    4. As veias laterais da cauda devem ser visíveis e dilatadas. Se não, aperte delicadamente a base da cauda e mergulhe a cauda na água morna da torneira para dilatar as veias.
      NOTA: Dilatação das veias também pode ser alcançado através da colocação da gaiola do rato uma lâmpada de aquecimento e / ou em cima de uma almofada de aquecimento.
    5. Use uma limpeza de álcool para limpar a cauda. Insira a agulha na veia da cauda, bevel lado para cima, e injetar 100 μL de suspensão celular.
      NOTA: Se a agulha é inserida corretamente na veia, deve facilmente deslizar ligeiramente para a frente e para trás, e não deve haver resistência quando o desentupidor é empurrado. Injeções bem-sucedidas também devem resultar em um "flush" em que a cor azul da veia fica branca por alguns segundos após a injeção.
  4. Lentamente remover a agulha e usando uma gaze estéril, aplicar pressão para o local da injeção para parar qualquer sangramento.
  5. Devolva o mouse à sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa. Os ratos devem ser verificados para sinais da dor ou da aflição 3x semanalmente.
  6. Monitore camundongos para formação e crescimento de metástase por 3-6 semanas (linha celular e tensão do rato dependente) usando um dispositivo de imagem animal vivo in vivo (ver etapas 5 e 6).

5. Monitorar a carga metastática por fluorescência com um dispositivo de imagem animal vivo in vivo

NOTA: Não animal de imagem para fluorescência com sinal luminescente ativo.

  1. Se apenas a bioluminescência de imagens, pule para o passo 6.
  2. Ligue o dispositivo de imagem animal vivo in vivo.
  3. Configure o sistema in vivo de anestesia de imagens de animais vivos de acordo com as diretrizes do fabricante para entregar entre 1,5% e 2% de isoflurano à câmara de anestesia e à câmara de imagem.
  4. Camundongos anestesia com metástases fluorescente rotulados a partir do passo 4, colocando-os em uma câmara de anestesia e entregando 1,5-2,5% isoflurane.
  5. Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais)e login.
  6. Clique no botão Initialize e aguarde a inicialização da máquina.
  7. Mude o Campo de Visão para D.
    NOTA: Campo de Vista C também pode ser usado se uma visão mais próxima de um mouse é necessária, mas isso limita o número de ratos que podem ser imagem sinuosamente.
  8. Uma vez que o software indicou que a câmera atingiu a temperatura adequada, clique no botão Imaging Wizard, escolha Fluorescence e, em seguida, escolha o par de filtro apropriado do menu suspenso.
    NOTA: Se o fluorofofóbico que está sendo usado não é uma opção, escolha Input EX / EM e digite a excitação e emissão necessária.
  9. Coloque o mouse na câmara como descrito no passo 3.2.4.
  10. Clique em adquirir seqüência.
  11. Após a imagem, devolva o mouse à sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa.
  12. Repita o passo 5.2 e passos 5.7-5.9 com pelo menos um mouse que não contém metástases. NOTA: Este mouse será usado para quantificar e subtrair sinal de fundo durante a análise (passo 8).
  13. Imagem 2-3 vezes por semana para a duração do experimento.

6. Monitorando a carga metastática pela bioluminescência com um dispositivo vivo in vivo da imagem latente animal

  1. Ligue o dispositivo de imagem animal vivo in vivo in vivo e configure o programa da seguinte forma.
    1. Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais)e login. Clique no botão Initialize e aguarde a inicialização da máquina. Mude o Campo de Visão para D.
      NOTA: Campo de Vista C pode ser usado para uma visão mais próxima da imagem do corpo do mouse completo; no entanto, isso limita o número de ratos que podem ser imagemdes ao mesmo tempo.
    2. Para uso pela primeira vez, eite as configurações de exposição da seguinte forma: clique em Eit | Preferências | Aquisição | Auto Exposição e alterar o tempo máximo de exposição do padrão de 60 segundos para 300 segundos e clique em OK.
      NOTA: Não altere quaisquer outros parâmetros na guia de exposição automática.
  2. Configure o sistema de anestesia de acordo com as diretrizes do fabricante para entregar entre 1,5% e 2% de isoflurano à câmara de anestesia e à câmara de imagem.
  3. Certifique-se de que a câmera atingiu a temperatura adequada antes de prosseguir para o passo 6.4.
  4. Camundongos contendo metástase do passo 4, colocando-os em uma câmara de anestesia e entregando isoflurano de 1,5-2,5%.
  5. Prepare os camundongos para imagens de bioluminescência da seguinte forma.
    1. Carregue uma seringa de 1 mL com D-luciferin (30 mg/mL em D-PBS) e adicione uma agulha de calibre 30 de 1/2 polegada singada à seringa e expela bolhas de ar.
    2. Medir e registrar a massa do rato anestesiado.
    3. Contenha o rato beliscando a nuca usando os dedos do polegar e ponteiro e agarrando a cauda entre o dedo mindinho e a base da mão. Inverter o mouse em um ângulo de 45 graus, com a cabeça apontada para baixo.
    4. Insira a agulha, do lado do bislado para cima, no espaço intraperitoneal (IP) do lado esquerdo do rato. Confirme a entrada no espaço IP, retirando um pequeno volume. Não deve haver cor na base da agulha ao desenhar de volta no espaço IP.
    5. Injete o volume adequado de D-luciferin para uma dose de 150 mg/kg.
    6. Imediatamente após a administração D-luciferin, iniciar um temporizador e colocar o mouse plana em suas costas no dispositivo de imagem com o nariz no cone do nariz e garantir que 1,5-2,5% isoflurane está sendo administrado. Coloque divisores entre cada rato se a imagem de vários ratos. Certifique-se de que os ratos estejam posicionados o mais plano possível (ou seja, não se inclinando para um lado).
    7. Clique nas caixas luminescentes e de fotografia e, em seguida, clique em Adquirir no Painel de Controle de Aquisição.
  6. Adquirir continuamente imagens bioluminescentes até que o sinal de pico seja alcançado e use a imagem com o sinal bioluminescente de pico para análise.
  7. Após a imagem, devolva o mouse à sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa.
  8. Imagem 2-3 vezes por semana para a duração do experimento.

7. Quantificação do número e tamanho das metástases

NOTA: O período de tempo que as metástases são permitidas crescer devem ser determinados para cada linha de pilha e tensão do rato, e serão influenciados pelo número de pilhas injetadas.

  1. Eutanásia os ratos de acordo com diretrizes institucionais padrão.
  2. Isolar e remover os pulmões de cada rato e enxaguar em 1x PBS para remover o excesso de sangue.
  3. Delicadamente separar os pulmões em lobos.
  4. Adquirir imagens de metástases ZsGreen nos lobos em 10x em campo brilhante e fluorescência usando um estereoscópio fluorescente com um filtro de banda larga GFP (excitação 470/40x).
    NOTA: Mantenha a mesma ampliação e brilho para todas as amostras. A ampliação utilizada pode variar dependendo do tamanho, número e brilho das metástases, bem como do campo de visão para o microscópio utilizado.
  5. Use o software de análise de imagem para quantificar o tamanho e o número de metástases das imagens.
    NOTA: O protocolo para análise de imagem é dependente de software e pode ser otimizado com tumores a partir do step3. Alternativamente, conte o número de metástases em cada pulmão usando manualmente o estereoscópio fluorescente. O protocolo pode ser pausado aqui e a etapa 8 pode ser feita em qualquer ponto depois que todas as imagens in vivo foram coletadas.

8. Processamento e análise dos dados das imagens adquiridas com o dispositivo de imagem animal vivo in vivo in vivo

  1. Abra todos os arquivos de imagem para cada mouse no software de imagem.
    NOTA: Use a imagem com o sinal bioluminescente máximo para análise
  2. Certifique-se de que as unidades estão em Radiance para dados bioluminescentes e eficiência para dados fluorescentes clicando na seta no canto superior esquerdo da janela de imagem e mudando-a para a unidade apropriada.
  3. Use a imagem do último ponto de tempo para criar uma região de interesse (ROI) da seguinte forma.
    1. Clique em ferramentas ROI na janela da paleta de ferramentas. Insira um ROI clicando na seta e selecionando 1.
    2. Clique na fronteira do ROI e mova-o sobre o peito do mouse. Ajuste o tamanho do ROI para que ele cubra o baú do mouse e não exclui o sinal.
  4. Clique em medir ROIs e copiar ou digitar o número bruto em uma folha de excel.
    NOTA: Para dados bioluminescentes selecione o fluxo total (fótons/segundo), que é a soma de todo o brilho no ROI. Uma vez que as metástases não crescem necessariamente uniformemente, o fluxo total é preferido em vez de brilho médio, pois mede a soma da carga metastática. Da mesma forma, para dados fluorescentes, o % de eficiência total (luz de emissão (fótons/segundo)/luz de excitação (fótons/segundo)) deve ser usado em vez da eficiência média.
  5. Clique direito no arquivo de imagem para copiar o ROI usado na etapa 8.3 e colá-lo em cada arquivo de imagem.
    NOTA: Ao quantificar imagens fluorescentes, quantificar a mesma região em um mouse que foi imagemda sem metástase. Use este sinal como sinal de fundo e subtraia-o de cada imagem de rato contendo metástase fluorescente adquirida.
  6. Mova ROIs colados sobre a mesma região selecionada na etapa 8.3.4 para cada imagem e repita a etapa 8.4.
  7. Traçar e analisar os dados brutos da seguinte forma (ver Tabela Suplementar 2).
    1. Faça um registro10 transformação dos dados brutos para cada mouse usando a fórmula indicada(Tabela Suplementar 2)e enredo como na Figura 2D e Figura 4F. A transformação do log10 lineariza a curva de crescimento que tende a ser geométrica e minimiza a heteroscedasticidade.
    2. Usando regressão linear, calcule a inclinação da linha equipada para o registro10 dados transformados para cada mouse traçado na etapa 8.7.1(Tabela Suplementar 2). Consulte a fórmula na Tabela Suplementar 2 para se adequar à linha e calcular a inclinação em uma etapa.
    3. Traçar os valores numéricos das pistas como na Figura 2E e Figura 4G. Use o teste t de um aluno ou a Nova ANOVA de sentido único (para mais de 2 grupos) nas pistas para determinar o significado estatístico.

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Representative Results

Para demonstrar a abordagem acima, realizamos um experimento de prova de conceito no qual um fator crítico de replicação, o RPA3 foi derrubado em uma linha de células carcinoma mamária samária do camundongo metastático (4T122). Enquanto o protocolo descreve a rotulagem das células com proteínas luciferase e fluorescentes antes da manipulação genética, usamos uma abordagem modificada porque os vetores RNAi também entregam ZsGreen (Figura 2A). Primeiro, as células 4T1 foram transinduzidas com uma construção lentiviral codificando a resistência ao vaga-lume e a hygromicina (pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro). Após a seleção de higromicina, um ensaio luciferase foi realizado para confirmar a expressão estável do vaga-lume(Figura 2A). Em seguida, as células 4T1-Lúciferase foram transinduzidas de forma evigorada com vetores retrovirais que expressam ZsGreen e um shRNA baseado em miR30 de controle, ou um shRNA baseado em miR30 mostrado anteriormente para atingir efetivamente o mouse RPA316,23,24. As células foram então injetadas nos camundongos através da veia lateral da cauda e o sinal bioluminescente in vivo foi medido duas vezes por semana para monitorar a carga metastática (Figura 2B,C). O sinal transformado de registro10 para cada mouse foi traçado como carga metastática ao longo do tempo(Figura 2D)e as encostas de cada parcela foram determinadas(Figura 2E). Estes dados mostram que a taxa de variação na carga metastática é significativamente reduzida com o knockdown RPA3 comparado às pilhas de controle. Embora as diferenças sejam marcantes, esses dados por si só não nos permitem determinar se a redução da carga metastática é o resultado de menos metástases ou devido ao crescimento mais lento das metástases. Portanto, as metástases rotuladas por ZsGreen nos pulmões também foram analisadas ao final do experimento. Camundongos injetados com células rpa3 knockdown quase não tinha metástases nos pulmões, enquanto os ratos controle tinha inúmeras metástases grandes (Figura 3). Além disso, as metástases que se formavam a partir de células rpa3 knockdown eram claramente menores do que o controle 4T1 metástases (Figura 3A). Consistente com nossas contagens manuais(Figura 3B),o software de análise de imagem contou significativamente menos metástases nos camundongos knockdown RPA3 (Figura 3C). Além disso, a carga metastática total nos pulmões (soma das áreas de cada metástase em milímetros) também foi drasticamente reduzida pelo knockdown RPA3 (Figura 3D). Finalmente, o tamanho das metástases individuais que se formaram nos camundongos rpa3 knockdown eram geralmente muito menores do que aqueles nos ratos controle (Figura 3E). Além das grandes metástases nos camundongos controle, observamos inúmeras metástases pequenas também, mas não podemos determinar se são células tumorais que semearam o pulmão e não cresceram ou se são células tumorais derramadas de uma das metástases maiores que resemearam o pulmão em um novo local (Figura 3E). Coletivamente, esses dados mostram que rpa3 é necessário para a formação de metástase por células 4T1. Estes resultados foram esperados porque nosso trabalho precedente mostrou que as pilhas da batida RPA3 tinham reduzido significativamente a habilidade de dar forma às metástases nos pulmões que seguem a injeção da veia da cauda16. No entanto, este experimento demonstra como o uso de imagens de animais vivos e quantificação fluorescente do número e tamanho da metástase podem ser usados para determinar se as mudanças na carga metastática são devido a diferenças na colonização ou crescimento metastático.

Para demonstrar como essa abordagem pode ser usada para responder a uma pergunta biologicamente mais relevante, perguntamos se yap e taz são necessários para a colonização metastática e posterior crescimento neste modelo singênico de câncer de mama. A expressão e atividade de YAP ou TAZ são aumentadas em muitos cânceres em comparação com o tecido normal e isso é preditivo do mau resultado do paciente25,26,27,28,29. Além disso, vários estudos têm implicado YAP, TAZ, ou TEADs, os parceiros críticos YAP/TAZ-binding, na metástase15,30,31,32,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Dado esses dados, usamos nossa abordagem para testar se yap e taz são necessários para a formação e crescimento da metástase. Para isso, usamos um vetor retroviral expressando shRNAs baseados em miR30 com mira tanto yap quanto taz. Como mostrado, este shRNA tandem reduz eficazmente a expressão yap e taz proteína e atividade transcriptional em células 4T1 (Figura 4A,B). As células 4T1-Luciferase foram transinduzidas com uma versão expressiva do ZsGreen deste vetor shRNA YAP/TAZ tandem ou um shRNA baseado em miR30 de controle (Figura 4C)e depois aseremda por injeções de veias de cauda em camundongos BALB/c singênicos. Como mostrado na Figura 4, a taxa em que a carga metastática aumentou foi significativamente mais rápida nos camundongos injetados com células de controle em comparação com os ratos injetados com células knockdown YAP /TAZ (Figura 4D-F). Significativamente menos metástases formadas nos camundongos injetados com células knockdown YAP/TAZ em comparação com camundongos com células controle, sejam contadas manualmente(Figura 5A,B)ou usando o software de análise de imagem(Figura 5C). Não só muitas metástases mais forma minásticas nos ratos de controle, mas eles eram geralmente maiores(Figura 5E). Consistentemente, a carga metastática nos pulmões (área total da metástase no mm) foi reduzida igualmente dràstica pelo knockdown de YAP/TAZ(figura 5D). É importante notar que quando as metástases são grandes e próximas, o software pode ser incapaz de diferenciar metástases distintas. Este era o argumento para algumas metástases em ratos do controle (rato 3 e rato 7). Assim, é importante verificar a saída do software de análise de imagem para garantir que ele está medindo com precisão a área de tumores individuais. É também por isso que é importante otimizar o número de células injetadas e a duração do experimento. Coletivamente, esses dados mostram que yap e taz são obrigados a sustentar a taxa em que a carga metastática aumenta em um modelo singênico murine de câncer de mama metastático e que isso é devido à incapacidade de metástases para formar e reduzir o crescimento das metástases poucos que se formou.

Figure 1
Figura 1: Esquemático do protocolo. Todos os vírus necessários são embalados pela primeira vez em células HEK-293FT. As células desejadas para o estudo são então simultaneamente infectadas com vírus lúciferase e fluorescentes que expressam um gene único de seleção de medicamentos mamíferos. As células infectadas são então expandidas nos meios de comunicação adequados contendo ambos os medicamentos para selecionar para células transinduzidas de forma evigorada expressando tanto a luciferase quanto a proteína fluorescente. A expressão de ambos os rótulos é confirmada conforme descrito no protocolo. As células rotuladas são então transinduzidas com um terceiro vírus contendo manipulação genética (miR30 shRNA) e um terceiro gene único de seleção de medicamentos. Após a seleção com a terceira droga, as células são injetadas nos ratos através da veia da cauda lateral. A carga metastática é monitorada nos camundongos durante todo o experimento com um sistema de imagem animal vivo in vivo. No final do experimento, os ratos são sacrificados, e imagens de todos os pulmões são tomadas usando um microscópio de dissecação fluorescente e, em seguida, usado para medir o número e o tamanho das metástases. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Imagens de animais vivos in vivo baseadas em Lúciferase mostram que o knockdown rpa3 reduz a carga metastática do câncer de mama. (A)Esquemático mostrando como as células foram geradas para este estudo in vivo. As células 4T1 foram transinduzidas de forma evigorada com uma resistência à luciferase e à hisgromicina. As células infectadas foram selecionadas com 600 μg/mL de hygromicina B por uma semana e, em seguida, a atividade luciferase foi medida em células parentais ou 4T1-lúciferase usando um kit de repórter lúciferase e leitor de placas (n = 1 experimento com poços replicados em média). As células 4T1-Luciferase foram infectadas com retrovírus que fornecem ZsGreen e miR30 shRNAs visando mCherry (controle) ou mRPA3. A seleção de puromicina (2,5 μg/mL) por 3 dias foi utilizada para selecionar para integração estável do vírus. (B-E) células 4T1-luciferase expressando zsgreen e controle (sh-mCherry) ou mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNAs foram injetados em camundongos e imagem para bioluminescência nos dias indicados, conforme descrito no protocolo. (B&C) Imagens bioluminescentes para um mouse representativo de cada grupo na injeção pós-dia indicada (D)Enredo do registro10 transformou sinal luciferase medido para cada mouse ao longo do experimento. (E)Espalhe enredo com média (linha sólida) para as encostas de cada rato em D (n = 6 para sh-controle e 8 para sh-mRPA3-431). O significância estatístico foi testado usando o teste t de um estudante; *p ≤ 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Quantificação de metástases fluorescentes revela que rpa3 knockdown impede a colonização metastática e posterior crescimento das células de câncer de mama. (A) Fluorescente (esquerda) e brightfield (direita) imagens de lobos representativos de cada rato injetado na Figura 21 dias após a injeção. Asteriscos (*) indicou brônquio autofluorescente verde. (C-E) O software de análise de imagem (ver Tabela de Materiais)foi usado para identificar e medir objetos usando um limite de intensidade de 25 a 100 e um limite de tamanho de 0,01 mm2 ao infinito. (B&C) Espalhe enredo com a Média (barra sólida) do número total de metástases nos pulmões de cada rato quando contado (B) pelo software de análise de imagem (C). (D)A área total (mm) do pulmão que foi medida com software de análise de imagem é traçada como carga metastática com a Média indicada por uma barra sólida. (E)O tamanho de cada metástase é traçado para cada rato. Os ratos do controle são indicados pelos pontos azuis e pelos ratos do knockdown mRPA3 pelos pontos vermelhos. Note, a barra de escala é separada em 1 mm para tornar mais fácil visualizar o tamanho e o número de metástases pequenas (n = 6 sh-control, 8 sh-mRPA3-431). O significância estatístico foi testado usando o teste t de um estudante; p = 0,06; ** p ≤ 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: YAP/ TAZ knockdown reduz a carga metastática do câncer de mama. (A&B) células 4T1 expressando de forma enova o controle baseado em miR30 (mCherry) ou shRNAs YAP/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ6) foram analisadas pela análise de borrões ocidentais (A)ou transacionado com uma construção de repórter luciferase YAP/TAZ-TEAD e ensaiou para a atividade transcriptional YAP/TAZ-TEAD, conforme descrito anteriormente15,16 (B) (n = 5 para controle e 4 para YAP1/TAZ6). (C)Esquemático mostrando como as células foram geradas para o estudo in vivo. As células 4T1-Luciferase foram infectadas com retrovírus que fornecem ZsGreen e um shRNA miR30 visando mCherry (controle) ou shRNAs tandem miR30 visando mYAP e mTAZ. As células infectadas foram selecionadas em Puromicina (2,5 μg/mL) por 3 dias. Células 4T1-luciferase expressando zsgreen e controle (sh-mCherry) ou YAP/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ1) shRNAs foram injetadas em camundongos e imagemdas para bioluminescência nos dias injetados. (D&E) Imagens bioluminescentes para um rato representativo de cada grupo na injeção do borne do dia indicado. (F)Enredo do registro10 transformado sinal luciferase medido para cada mouse ao longo do experimento. (G)Espalhe enredo com Média (barra sólida) para as encostas de cada rato em F (n = 7 para sh-controle e 8 para sh-mRPA3-431). A média é indicada por uma linha sólida. O significância estatístico foi testado usando o teste t de um estudante; p = 0,06; #, p ≤ 0,01; ***. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: YAP e TAZ são necessários para células metastáticas de câncer de mama para colonizar os pulmões. (A) Fluorescente (esquerda) e brightfield (direita) imagens de lobos representativos de cada rato injetado na Figura 4 21 dias após a injeção. (C-E) As imagens foram processadas com software de análise de imagem, conforme descrito na Figura 3. (B&C) Espalhe enredo com a média (barra sólida) do número total de metástases nos pulmões de cada rato quando contado manualmente(B)ou por software de análise de imagem (C). (D)A área total de todas as metástases (mm) foi medida com software de análise de imagem e traçada como carga metastática com a Média (barra sólida). (E)O tamanho de cada metástase é traçado para cada rato. Os ratos do controle são indicados pelos pontos azuis e pelos ratos do knockdown do sh-mYAP1/mTAZ6 pelos pontos vermelhos. Note- a barra de escala é separada em 1 mm para melhor visualizar o tamanho e o número de metástases pequenas (n = 7 sh-control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). A média é indicada por uma linha sólida. O significância estatístico foi testado usando o teste t de um estudante; *p ≤ 0,05, **, p ≤ 0,01; **. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Tabela Suplementar 1: Tabela de vetores. Todos os vetores usados estão listados e novos vetores são descritos. Técnicas padrão de biologia molecular foram usadas para clonar novos vetores e sequências para shRNA de 97 mers recém-descritos. Citações referem-se a: [1]53, [2]16, [3]54Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela suplementar 2: Exemplo de processamento e análise de dados de imagem de animais vivos in vivo in vivo. Planilha demonstrando como os dados brutos das imagens de animais vivos in vivo são convertidos para análise, conforme descrito nos passos 6,7 e 6,8. Dados brutos adquiridos a partir da imagem de animais vivos in vivo in vivo transformado usando uma transformação de log10. A taxa de variação na carga metastática é calculada para cada mouse calculando a inclinação gerada pelos dados transformados de registro10. Exemplos incluem análise luciferase da Figura 2. As colunas são codificadas por cores para indicar quais dados foram usados para gerar cada valor de inclinação e as fórmulas são investidas na planilha. O clique duplo no poço revelará a fórmula usada para processar os dados. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

Etapas críticas do método
É fundamental otimizar o número de células injetadas (passo 3) para uma determinada linha celular e tensão do mouse, pois isso pode influenciar muito o número de metástases que se formam e a duração do experimento. Se muitas células são injetadas ou as metástases crescem por muito tempo, as metástases podem ser difíceis de contar tornando os efeitos da manipulação genética difíceis de avaliar. No entanto, se muito poucas células são injetadas, poucas ou nenhuma metástases podem se formar. Assim, um experimento preliminar deve ser feito usando diferentes números de células para determinar o número ideal e o período de tempo que as metástases crescem. Para garantir um número consistente de metástases dentro de um grupo, é importante injetar números iguais de células viáveis em cada mouse. Uma vez que as células podem se estabelecer no tubo e na seringa, as células devem ser resuspensas suavemente antes de carregar a seringa, e as suspensões celulares não devem ser deixadas na seringa por muito tempo (passo 4.3.2). A viabilidade celular diminui quanto mais tempo as células estiverem suspensas, de modo que a quantidade de tempo entre a trippsinização e a injeção das células não deve ser superior a uma hora (passo 4.2.5). Bolhas de ar e grandes grupos de células não devem ser injetados, uma vez que estes podem causar emboli que matam o mouse. Além disso, desenhar células através da agulha pode tosquiá-los, de modo que a seringa deve ser carregada sem a agulha. Para confirmar que um número relativamente igual de células foi injetado, in vivo imagens de animais podem ser tomadas logo após a injeção (Figura 2B, Figura 4D).

Quantificação precisa e consistente do sinal bioluminescente é importante e depende das células que assumam e metabolizaram o D-luciferin. Isso pode ser influenciado por muitas variáveis, incluindo, a dose de D-luciferin, o momento da injeção, a temperatura corporal do rato, como anestesiado o mouse é quando injetado, e como um rato é posicionado na câmara de anestesia antes da imagem. Portanto, é fundamental manter essas etapas consistentes para todos os camundongos e sessões de imagem. Usamos uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal consistente do rato, enquanto na câmara de anestesia. Desde que o sinal deve penetrar o tecido para a deteção bioluminescente e fluorescente, é igualmente crítico manter a posição do rato consistente para cada imagem (liso em sua parte traseira trabalha melhor para a imagem latente dos pulmões). A quantificação de imagens fluorescentes da imagem animal vivo in vivo in vivo deve sempre ser feita usando as unidades do % da eficiência porque esta permite a comparação apropriada entre imagens. Da mesma forma, o fluxo total (fótons/segundo) deve ser sempre usado ao quantificar imagens bioluminescentes. Para análise da carga metastática, a transformação do log10 converte a curva de crescimento (antes que o sinal máximo seja alcançado) em uma trama linear, que era necessária para a análise de inclinação.

Modificações e solução de problemas do método
No protocolo apresentado uma população de células é primeiro transinduzida com uma proteína fluorescente e luciferase, então essa população é transinduzida com um vetor de controle ou um vetor visando o gene de interesse. Isso garante que ambas as populações celulares tenham proteína fluorescente semelhante e expressão luciferase. No entanto, como uma alternativa, vetores virais que entregam simultaneamente dois desses componentes poderiam ser utilizados. De fato, nos experimentos representativos usamos zsgreen expressando vetores retrovirais para expressar os shRNAs em células 4T1-lúciferase. Recomenda-se que a expressão da luciferase e da proteína fluorescente seja amenizada em todos os grupos celulares após a alteração do gene de interesse. Diferentes níveis de expressão entre os grupos podem complicar a interpretação dos dados, por isso é melhor se os diferentes grupos têm expressão semelhante tanto da proteína fluorescente quanto da luciferase. Além disso, os glóbulos vermelhos podem ser autofluorescentes e podem dificultar a visualização das metástases fluorescentes nos pulmões. Se este for o caso, os glóbulos vermelhos podem ser retirados dos pulmões pela perfusão PBS durante a eutanásia para reduzir o fundo autofluorescente (técnicas e diretrizes apropriadas de eutanásia devem ser seguidas). Embora as diferenças entre grupos de controle e knockdown em nossos experimentos representativos sejam dramáticas, a variabilidade inerente do rato ao rato que muitas vezes existe nos ensaios de metástase in vivo é evidente nos camundongos controle(Figura 3B e Figura 5B). Quando essa variabilidade é alta, pode dificultar determinar a magnitude do efeito knockdown. Uma abordagem alternativa que poderia ser usada para reduzir essa variabilidade é rotular as células controle e células knockdown com proteínas fluorescentes distintas e enzimas luciferase distintas e, em seguida, misturar as duas populações em números iguais e injetar a mistura. Por exemplo, células de controle expressando tomate e renilla luciferase podem ser misturadas com células knockdown expressando ZsGreen e lúciferase vaga-lume. In vivo dispositivos de imagem animal vivo pode distinguir renilla luciferase de fogo-de-fogo luciferase, e tomate de ZsGreen, de modo que a fluorescência ou a luminescência podem ser usadas para quantificar independentemente cada população celular. Na verdade, a imagem de luciferase dupla de células 4T1 crescendo como tumores primários em animais vivos tem sido demonstrado usando um dispositivo de imagem animal vivo in vivo4. No entanto, é importante notar que pode haver sobreposição no sinal fluorescente, portanto, uma etapa de desmixagem espectral (ver diretrizes dos fabricantes) deve ser incluída nessa abordagem. Além disso, a renilla luciferase e o vaga-lume lúciferase devem ser imageados separadamente com um atraso de tempo adequado que permita que o primeiro sinal de luciferase não seja mais detectável antes de fazer a imagem do segundo. O uso de fluorofóforos distintos ainda permite que o número e o tamanho da metástase nos pulmões sejam quantificados16. Para testar a colonização metastática e o crescimento em outros órgãos além dos pulmões este protocolo pode ser modificado e utilizado para injeções intracáscardíacas e de veias portal9,10.

Limitações do método
O uso de um dispositivo de imagem animal vivo in vivo para adquirir carga metastática em tempo real em conjunto com células cancerosas fluorescentes rotuladas fornece um método poderoso para atribuir a colonização metastática e o crescimento subsequente; no entanto, existem limitações dessa abordagem. Alguns genes podem ser necessários para a proliferação celular inata, em vez de papéis específicos na metástase. Os ensaios in vitro da proliferação da pilha poderiam ser feitos antes da experiência in vivo para determinar se o gene interrompe o crescimento in vitro. Ao imaginar um animal vivo, o sinal bioluminescente ou fluorescente das metástases deve ser forte o suficiente para passar pelo tecido. Além disso, as propriedades ópticas (ou seja, absorção e dispersão) do tecido também influenciam a detecção55. A fonte de luz de excitação deve ser capaz de passar através do tecido para excitar as células cancerosas fluorescentemente rotulados e bioluminescência tem uma gama dinâmica maior do que a fluorescência. Assim, embora a fluorescência possa ser usada para a imagem latente animal viva, a bioluminescência é preferida para detectar o sinal em órgãos internos. Além disso, algumas cepas de camundongos imunocompetentes podem rejeitar células que expressam proteínas fluorescentes. Na verdade, descobrimos que as células que expressam tomate, GFP ou mCherry foram rejeitadas ou regulamentadas pelo fluorofofóbico ao crescer em camundongos BALB/c (dados não mostrados e15). No entanto, como demonstrado aqui (Figura 3 e Figura 5) e anteriormente15,16, ZsGreen-labeled células são detectáveis nestes ratos. Nos casos em que a expressão de proteína fluorescente se torna indetectável, outra maneira de quantificar a colonização metastática relativa é usar qPCR para quantificar o gene fluorescente ou outro gene no vetor viral integrado15. Embora um dispositivo de imagem animal vivo in vivo permita detectar alterações na carga metastática, ele não permite determinar se essas alterações são devido ao tamanho alterado ou número de metástases. Também não fornece informações espaciais sobre a localização das metástases. Além disso, a força do sinal pode ser influenciada pela profundidade do tecido.

O significado do método e potenciais aplicações futuras
Há muitas maneiras em que esta abordagem pode ser modificada para obter mais ou informações diferentes. Uma variedade de linhas de células cancerosas, incluindo linhas de células cancerosas humanas ou xenoenxertos derivados do paciente poderia ser usado neste ensaio. Outros modelos de camundongos também podem ser usados, incluindo camundongos transgênicos ou nocaute projetados para testar como direcionar proteínas feitas por células estromais influencia a colonização metastática e o crescimento das células cancerosas injetadas. Se existem vários genes candidatos a serem testados, essa abordagem pode ser multiplexada porque dispositivos de imagem animal vivo in vivo podem detectar e distinguir uma ampla gama de fluorofônicos. Isso reduziria o número de camundongos necessários e aumentaria o número de alvos que podem ser testados. In vivo imagem animal também pode ser combinado com raios-X ou CT9 imagem para fornecer uma informação muito mais espacial sobre a localização das metástases. Por fim, essa abordagem pode ser modificada para atribuir passos mais específicos dentro da cascata de colonização metastática. Por exemplo, as etapas envolvidas na semeadura da pilha do tumor (sobrevivência intravascular, extravasation, e sobrevivência da extravasation do borne) podem ser distinguidas quantificando o número de pilhas do tumor nos pulmões em diversos pontos do tempo dentro dos primeiros 3 dias que seguem a injeção (tal como feito aqui16). Neste caso, os pulmões também podem ser manchados com marcadores vasculares e imagem ex vivo para determinar a porcentagem de células cancerosas que extramíram a cada ponto de tempo56,57.

Em resumo, o uso de imagens de animais vivos in vivo in vivo em tempo real de células cancerosas fluorescentes e luminescentes após a injeção da veia da cauda permite uma análise mais detalhada de como um gene ou genes candidatos influencia a colonização metastática e o crescimento subsequente. Esta abordagem é mais rápida e menos cara do que os modelos de camundongos aupérquicos e evita algumas das ressalvas de modelos de metástase espontânea. O uso de fluorescência e luminescência como um meio de detectar e quantificar metástases dá aos pesquisadores leituras independentes que melhoram a confiança nos resultados e permitem flexibilidade no projeto experimental. O uso de fluorescência para quantificar o tamanho e o número da metástase evita a necessidade de processamento e análise histológico demorados e potencialmente caros, e permite o uso adicional de tecidos inteiros. O protocolo pode ser usado com uma série de técnicas diferentes para manipular a expressão ou função do gene candidato, como RNAi, expressão transgênica ou edição mediada por CRISPR/Cas, e também pode ser usado para testar pequenas moléculas, anticorpos de bloqueio de função ou outros compostos terapêuticos potenciais. Como mencionado acima, várias modificações simples podem ser feitas para melhorar o ensaio e fornecer informações adicionais. Esta abordagem é uma forma ideal de identificar e testar genes pró-metastáticos que têm potencial terapêutico para o tratamento do câncer.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos emily norton para ajudar com infecções virais e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também Ryan Kanai para ajudar a adquirir imagens dos pulmões e Kate E. Tubbesing para ajudar com a análise de imagem das metástases verdes nos pulmões. Agradecemos ao pessoal do centro de investigação animal pelo seu apoio e pela assistência na preparação deste vídeo. Este trabalho foi apoiado por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões
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Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

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