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Cancer Research

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60687
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Summary

L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

Abstract

La métastase est la principale cause de décès liés au cancer et il existe peu d'options thérapeutiques pour les patients atteints de maladie métastatique. L'identification et l'essai de nouvelles cibles thérapeutiques qui faciliteront le développement de meilleurs traitements pour la maladie métastatique exigent des modèles précliniques in vivo. Démontré ici est un modèle de souris syngénéique pour assainer la colonisation métastatique de cancer du sein et la croissance suivante. Les cellules cancéreuses métastatiques sont traitées de façon stable avec des vecteurs viraux codant la luciferase firefly et les protéines ZsGreen. Les gènes candidats sont ensuite manipulés de façon stable dans les cellules cancéreuses exprimant la luciferase/ZsGreen, puis les cellules sont injectées chez la souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue pour mettre en évidence la colonisation et la croissance métastatiques. Un dispositif d'imagerie in vivo est ensuite utilisé pour mesurer la bioluminescence ou la fluorescence des cellules tumorales chez les animaux vivants afin de quantifier les changements dans la charge métastatique au fil du temps. L'expression de la protéine fluorescente permet de quantifier le nombre et la taille des métastases dans les poumons à la fin de l'expérience sans avoir besoin de sectionnement ou de coloration histologique. Cette approche offre un moyen relativement rapide et facile de tester le rôle des gènes candidats dans la colonisation et la croissance métastatiques, et fournit beaucoup plus d'informations que les tests traditionnels de métastase de veine de queue. En utilisant cette approche, nous montrons que le renversement simultané de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif liant PDZ (TAZ) dans les cellules cancéreuses du sein conduit à une réduction de la charge métastatique dans les poumons et que cette charge réduite est le résultat d'une colonisation métastatique considérablement altérée et d'une croissance réduite des métastases.

Introduction

Le cancer reste la deuxième cause de décès dans le monde1 et la métastes est responsable de la majorité de ces décès2,3. Cependant, une compréhension limitée des mécanismes moléculaires qui régissent la colonisation métastatique et la croissance subséquente a entravé le développement de traitements efficaces pour la maladie métastatique. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques nécessite un essai pour tester comment l'expression ou la fonction perturbée d'un gène candidat influence la formation et la croissance de métastes. Bien que les modèles de souris autochthonous aient leurs avantages, ils sont longs et coûteux à générer, ce qui les rend plus adaptés à la validation des cibles plutôt qu'à la découverte de cibles. Les systèmes de modèle de transplantation dans lesquels le gène candidat est perturbé dans les cellules cancéreuses in vitro et puis les effets sur le potentiel métastatique sont évalués in vivo, sont moins chers et plus élevés que les modèles autochthonous. En outre, les vecteurs viraux pour l'administration stable de l'ARNi, du CRISPR/CAS9 et des transgènes sont largement disponibles, ce qui rend relativement facile de perturber pratiquement n'importe quel gène ou gène d'intérêt dans une lignée de cellules cancéreuses. Cette approche peut également être utilisée pour évaluer le rôle des gènes candidats dans la colonisation métastatique et la croissance des lignées cellulaires cancéreuses humaines en transplantant les cellules chez des souris immunodéprimées ou humanisées.

Les deux types d'essais utilisés pour tester la formation de métastes par les cellules cancéreuses transplantées in vivo sont les tests spontanés de métastes et les essais expérimentaux de métastes. Dans les essais spontanés de métastes4,5, les cellules cancéreuses sont injectées chez les souris, permis de former une tumeur primaire, puis la formation spontanée de métastes et la croissance ultérieure sont astorées. La force de ce modèle est que les cellules doivent compléter toutes les étapes du processus métastatique afin de former des tumeurs métastatiques. Cependant, beaucoup de lignes de cellules cancéreuses ne métastasent pas efficacement dans les modèles spontanés de métastase, et n'importe quelle manipulation des cellules qui influence la croissance primaire de tumeur peut confondre les résultats de l'analyse de métastase. Des tests expérimentaux de métastes, dans lesquels les cellules cancéreuses sont injectées directement dans la circulation, sont utilisés pour éviter ces pièges. Les essais expérimentaux communs de métastes incluent l'injection de veine de queue6,7,8 (et démontrée ici), l'injection intracardiaque9,et l'injection de veine de portail10.

Le but du protocole présenté ici est de fournir un test de métastes expérimentales in vivo qui permet à un chercheur de surveiller la formation et la croissance des métastes en temps réel, ainsi que de quantifier le nombre et la taille des métastes des points d'extrémité dans les poumons d'une même souris. Pour ce faire, les essais expérimentaux traditionnels de métastes de veine de queue6,7,8 sont combinés avec l'imagerie animale vivante, utilisant un dispositif d'imagerie in vivo9,11,12,13,14. Les cellules tumorales exprimant de façon stable à la fois la luciferase et une protéine fluorescente sont injectées chez les souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue, puis le dispositif d'imagerie in vivo est utilisé pour mesurer les changements de la charge métastatique dans les poumons au fil du temps (Figure 1). Cependant, le dispositif d'imagerie animale vivante in vivo ne peut pas distinguer ou mesurer la taille des métastases individuelles. Ainsi, à la fin de l'expérience, un stéréomicroscope fluorescent est utilisé pour compter le nombre et mesurer la taille des métastases fluorescentes dans les poumons sans avoir besoin de sectionnement et d'histologie ou d'immunohistochimie (Figure 1). Ce protocole peut être utilisé pour tester comment la modification de l'expression ou de la fonction d'un gène candidat influence la formation et la croissance des métastes. Des composés thérapeutiques potentiels tels que de petites molécules ou des anticorps bloquant la fonction peuvent également être testés.

Pour démontrer cette approche, nous avons d'abord effectué une expérience de preuve de concept dans laquelle le facteur essentiel de réplication, la protéine de réplication A3 (RPA3) est renversé dans les cellules métastatiques de cancer du sein de souris. Nous montrons que les souris injectées avec rpA3 knockdown cellules ont beaucoup moins de charge métastatique à chaque moment par rapport aux souris injectées avec des cellules témoins. L'analyse des poumons métastases-contenants montre que ce fardeau métastatique réduit est le résultat de la colonisation métastatique sensiblement réduite et de la croissance altérée des métastases qui se forment. Pour démontrer davantage cette technique, nous avons examiné si l'élimination simultanée de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif de liaison PDZ (TAZ) altère la colonisation métastatique ou la croissance ultérieure. YAP et TAZ sont deux co-activateurs transcriptionnels connexes qui sont les effecteurs critiques en aval de la voie hippopotame. Nous15,16 et d'autres ont impliqué YAP et TAZ dans la métastasie (revue en17,18,19), suggérant que ces protéines sont de bonnes cibles thérapeutiques. Constamment, nous avons constaté que les souris injectées avec des cellules knockdown YAP/TAZ avaient considérablement réduit la charge métastatique. L'analyse des poumons a montré que les cellules de renversement de YAP/TAZ ont formé beaucoup moins de métastases et que les métastases qui se sont formées étaient plus petites. Ces expériences démontrent comment les essais expérimentaux de métastes permettent à un chercheur de tester rapidement et à peu de frais le rôle d'un gène candidat dans la formation et la croissance de métastes. Ils montrent en outre comment l'utilisation combinée de l'imagerie animale vivante et de la quantification fluorescente des métastases dans des poumons entiers permet au chercheur de mieux comprendre les étapes de la colonisation métastatique.

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Protocol

Ce protocole implique l'utilisation de souris et de matériaux biodangereux et nécessite l'approbation des comités de sécurité institutionnels appropriés. Tous les travaux in vivo décrits ici sont approuvés par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Collège médical d'Albany.

REMARQUE : Pour une vue d'ensemble du protocole, voir schéma à la figure 1.

1. Emballage de tous les rétrovirus et lentivirus requis

REMARQUE : Le protocole décrit utilise des vecteurs lentiviraux ou rétroviraux pour exprimer de façon stable une enzyme de la luciferase et une protéine fluorescente ainsi que pour manipuler l'expression d'un gène candidat. Ces virus sont emballés dans les cellules HEK-293FT comme décrit ci-dessous.

  1. Jour 1: Plaque HEK-293FT cellules sur 6-bien plaques dans 2 ml de support de croissance complète (10% FBS dans DMEM avec 1% pénicilline / streptomycine et 2 mM L-Glutamine) de sorte qu'ils sont 40-60% confluent le jour 2. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant la nuit.
  2. Jour 2 : Pour que chaque vecteur viral soit emballé, transfect un puits de confluent de 40 à 60 % des cellules HEK-293FT avec le vecteur rétroviral ou lentiviral et les vecteurs appropriés codant les protéines virales de la couche et de l'emballage.
    REMARQUE : Ce protocole utilise VSVG comme protéine de manteau, psPAX2 pour l'emballage lentiviral, et gag-pol pour l'empaquetage rétroviral (voir tableau supplémentaire 1 pour la liste de vecteur).
  3. Faire un mélange de co-transfection pour chaque puits comme suit:
    1. Combinez 4 ll de solution lipidique pour les transfections (voir Tableau des matériaux)et 96 l de tampon de transfection et incubez pendant 5 minutes.
    2. Ajouter 1 g de vecteur viral, 0,5 g de vecteur de protéines de couche (VSVG) et 0,5 g de vecteur de protéines d'emballage (psPAX2 ou gag-pol) et couver pendant 20 minutes.
    3. Ajouter délicatement le mélange de co-transfection de l'étape 1.3.2 aux cellules HEK-293FT plaquées à l'étape 1.1 et incuber à 37 oC, 5% CO2 pendant la nuit.
  4. Jour 3 : Retirez les supports contenant de la transfection de chaque puits et ajoutez doucement 2 ml de support de croissance complet à chaque puits. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant environ 24 heures.
  5. Jour 4 : Ramassez le supernatant viral de chaque puits à l'aide d'une seringue de 3 ml et filtrez à travers un filtre de 0,45 m dans un tube microcentrifuge de 2 ml.
  6. Facultatif : Si la collecte d'un deuxième lot de virus est souhaitée, ajouter délicatement 2 ml de support de croissance complet à chaque puits et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant environ 24 heures.
  7. Jour 5 (facultatif): Recueillir un deuxième tour de supernatant viral comme dans l'étape 1.5.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause en gelant le supernatant viral.

2. Génération de cellules cancéreuses exprimant de façon stable la luciferase et une protéine fluorescente

REMARQUE : Le protocole suivant décrit comment d'abord étiqueter de façon stable les cellules 4T1 avec de la luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase et une protéine fluorescente (ZsGreen) utilisant deux vecteurs avec des gènes uniques de sélection. Ensuite, un3e vecteur viral est utilisé pour manipuler l'expression d'un gène candidat. Cependant, les vecteurs viraux qui fournissent simultanément une protéine fluorescente et une manipulation génétique peuvent également être utilisés comme alternative (comme dans les expériences représentatives ci-dessous). D'autres cellules cancéreuses peuvent être utilisées, mais les nombres cellulaires doivent être optimisés pour les étapes 2.1 et 2.7.1.

  1. Plaque 4T1 cellules à 1,5 x 105 cellules / bien dans une plaque de 12 puits dans le support de croissance complète (10% FBS dans DMEM avec 1% pénicilline / streptomycine et 2 mM L-Glutamine) et incuber à 37 oC, 5% CO2 nuit.
  2. Infecter les cellules 4T1 avec le supernatant viral généré à l'étape 1 comme suit.
    1. Aspirez le support de croissance des cellules et ajoutez 500 l de supernatant viral de luciferase et 500 l de supernatant viral de protéine fluorescente pour infecter simultanément les cellules avec les supernatants viraux de luciferase et fluorescents de protéine.
    2. Ajouter 1 l de 8 mg/mL de bromure d'hexadimethrine (voir Tableau des matériaux).
    3. Incuber les cellules à 37 oC, 5 % jusqu'à 75-90 % de confluents (généralement de 24 à 48 heures).
  3. Trypsiniser les cellules 4T1 avec 500 L de trypsine pendant 2-5 minutes (les cellules doivent rincer librement le fond du puits). Transférer toutes les cellules dans un plat de 6 cm dans 4 ml de média de sélection (média de croissance complet contenant les antibiotiques appropriés) étanchant ainsi la trypsine. Déposer un plat de 6 cm de cellules témoins non infectées dans le même support de sélection.
    REMARQUE : La concentration appropriée d'antibiotiques doit être déterminée à l'avance en testant plusieurs doses. En outre, le tri des cellules activées par la fluorescence peut également être utilisé pour sélectionner les cellules étiquetées fluorescentes à la place de la sélection des médicaments.
  4. Incuber les cellules à 37 oC, 5 % de CO2 dans le milieu de sélection et diviser les cellules si nécessaire jusqu'à ce que toutes les cellules témoins non infectées soient mortes (dépendantes du gène de sélection et de la lignée cellulaire).
  5. Confirmez que les cellules 4T1 infectées expriment la protéine fluorescente ZsGreen à l'aide d'un filtre vert d'excitation (450-490 nm)/émission (500-550 nm) réglé sur un microscope fluorescent inversé au grossissement 50-100x.
  6. Confirmez que les cellules 4T1 infectées expriment la luciferase à l'aide d'un kit d'activité de luciferase disponible dans le commerce comme suit.
    1. Utilisez un volume minimal de tampon de lyse passive 1x pour lyse les cellules 4T1 exprimant la luciferase et contrôlez les cellules 4T1 qui n'expriment pas la luciferase, secouant doucement pendant 30 minutes.
    2. Ajouter 20 l de lysate cellulaire dans une plaque blanche de 96 puits, puis 50 l de réagent d'extrait de luciferase du kit d'activité de la luciferase.
    3. Utilisez un lecteur de plaque pour mesurer la luminescence des cellules à toutes les longueurs d'onde dans le spectre en utilisant le réglage de luminescence.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause en gelant les cellules stabilisées.
  7. Manipuler l'expression du gène candidat comme suit :
    1. Plaque 6 x 105 cellules 4T1 étiquetées à partir de l'étape 2.6 sur un plat de 60 mm dans 4 ml de support de croissance complète et incuber à 37 oC, 5% CO2 pendant la nuit.
    2. Aspirez le support de croissance de chaque puits et ajoutez 2 ml de support de croissance complet contenant 4 oL de 8 mg/mL de bromure d'hexadimethrine.
    3. Ajouter 2 ml de supernatant viral de l'étape 1 aux cellules plaquées à partir de l'étape 2.7.2 et incuber à 37 oC, 5% CO2 pendant la nuit.
    4. Trypsiniser les cellules 4T1 avec 500 L de trypsine pendant 2-5 minutes (les cellules doivent rincer librement le fond du puits). Transférer toutes les cellules dans un plat de 10 cm dans 10 ml de média de sélection (média de croissance complet contenant les antibiotiques appropriés) étanchant ainsi la trypsine. Plaquer certaines cellules 4T1 non infectées dans le même média de sélection.
    5. Incuber les cellules à 37 oC, 5 % de CO2 dans le milieu de sélection et diviser les cellules si nécessaire jusqu'à ce que toutes les cellules non infectées soient mortes.
    6. Confirmer que l'expression du gène candidat est modifiée à l'aide d'une approche standard comme western blot20 ou qPCR21.
    7. Analysez la luminescence et la fluorescence comme dans les étapes 2.5-2.6 pour déterminer comment elles sont semblables dans les cellules de contrôle et de knockdown, car cela peut changer (voir Discussion).
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause en gelant les cellules stabilisées.

3. Optimisation de la conception expérimentale in vivo

  1. Optimisez le nombre de cellules approprié et la durée de l'expérience pour la charge métastatique souhaitée comme suit.
    1. Élargir les cellules 4T1 fluorescentes et bioluminescentes à partir de l'étape 2.6 dans le support de croissance complet afin que les cellules excédentaires soient disponibles le jour désiré de l'injection.
    2. Préparer les cellules pour les injections de veine de la queue comme décrit à l'étape 4.2. Pour déterminer le nombre optimal de cellules pour les injections, resuspendre les cellules à plusieurs concentrations différentes dans 100 'L de 1x PBS.
      REMARQUE : Nous recommandons de tester une gamme de numéros de cellules/souris de 25 000 à 500 000.
    3. Gardez les suspensions cellulaires sur la glace jusqu'à l'injection.
    4. Injecter chaque dilution des cellules 4T1 de l'étape 3.1.2 dans 3-4 souris via la veine latérale de queue décrite à l'étape 4.3 (voir ci-dessous).
    5. Remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète. Les souris doivent être vérifiées pour les signes de douleur ou de détresse 3x hebdomadaire.
    6. Surveiller la formation et la croissance de la métamase chez les souris pendant 3 à 6 semaines (lignée cellulaire et souche de souris dépendante) à l'aide d'un dispositif d'imagerie animale vivant in vivo (voir les étapes 5 et 6).
      1. Euthanasier les souris 3-6 semaines après l'injection de veine de queue selon les directives institutionnelles standard.
      2. Préparer les poumons et évaluer la taille et le nombre de métastes décrits à l'étape 7.
      3. Choisissez la durée appropriée pour que les métastases se développent pour le fardeau métastatique désiré (voir discussion).

4. Injection de veine de queue des cellules cancéreuses étiquetées

REMARQUE : L'étape 4.2.4 a été optimisée pour les cellules 4T1 qui poussent chez des souris syngénétiques BALB/c. Si d'autres lignées de cellules cancéreuses et des souches de souris sont utilisées, le nombre de cellules injectées et la longueur de l'épreuve doivent d'abord être optimisés.

  1. Élargir les lignées cellulaires 4T1 générées à l'étape 2 sur deux plats de 15 cm dans un support de croissance complet afin que les cellules excédentaires soient disponibles le jour de l'injection.
  2. Préparer les cellules pour l'injection de veine de la queue comme suit:
    1. Aspirer le support et rincer les plaques cellulaires avec 1x PBS.
    2. Trypsiniser les cellules avec 5 ml de trypsine par plaque de 15 cm pendant 2-5 minutes (les cellules doivent rincer librement le fond du puits). Transférer toutes les cellules dans un tube conique. Laver les cellules restantes du plat de culture tissulaire avec suffisamment de support de croissance complet pour étancher la trypsine et ajouter le lavage au même tube conique.
    3. Comptez les cellules à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé pour déterminer le nombre total de cellules.
    4. Centrifuger les cellules à 122 x g pendant 3 minutes, aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules en 1x PBS à la concentration désirée. Ici, 2,5 x 104 cellules sont injectées dans chaque souris dans 100 'L de PBS, de sorte que les cellules de resuspendre à 2,5 x 105 cellules/mL. Gardez les suspensions cellulaires sur la glace jusqu'à l'injection.
      REMARQUE : il est important de limiter le temps entre la trypsinisation des cellules et l'injection de veine de queue à environ 1 heure.
  3. Injecter des cellules 4T1 de l'étape 4.2.5 chez les souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue comme suit :
    1. En travaillant dans une hotte à l'établissement animalier, mélanger doucement mais soigneusement les cellules en inversant le tube ou en utilisant une seringue de 1 ml pour s'assurer qu'elles sont uniformément remises en suspension. Assurez-vous toujours que les cellules sont remises en suspension avant de charger la seringue.
    2. Chargez une seringue de 1 ml de verrouillage Luer avec une suspension cellulaire et expulsez les bulles d'air excédentaires. Placez une aiguille de 30 calibres de 1/2 pouce sur la seringue avec le bevel et expulsez les bulles d'air.
    3. Placez délicatement la souris dans une formatrice de rongeurs.
    4. Les veines latérales de la queue doivent être visibles et dilatées. Si ce n'est pas le cas, pincez délicatement la base de la queue et trempez la queue dans l'eau chaude du robinet pour dilater les veines.
      REMARQUE : La dilatation des veines peut également être réalisée en plaçant la cage de souris sous une lampe chauffante et/ou sur un coussin chauffant.
    5. Utilisez une lingette à alcool pour nettoyer la queue. Insérez l'aiguille dans la veine de la queue, côté bevel vers le haut, et injectez 100 L de suspension cellulaire.
      REMARQUE : Si l'aiguille est insérée correctement dans la veine, elle doit facilement glisser légèrement vers l'avant et vers l'arrière, et il ne devrait pas y avoir de résistance lorsque le piston est poussé. Les injections réussies devraient également avoir comme conséquence un « flush » dans lequel la couleur bleue de la veine devient blanche pendant quelques secondes suivant l'injection.
  4. Retirez lentement l'aiguille et à l'aide d'une gaze stérile, exercez une pression sur le site d'injection pour arrêter tout saignement.
  5. Remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète. Les souris doivent être vérifiées pour les signes de douleur ou de détresse 3x hebdomadaire.
  6. Surveiller la formation et la croissance de la métamase chez les souris pendant 3 à 6 semaines (lignée cellulaire et souche de souris dépendante) à l'aide d'un dispositif d'imagerie animale vivant in vivo (voir les étapes 5 et 6).

5. Suivi de la charge métastatique par fluorescence avec un dispositif d'imagerie animale vivante in vivo

REMARQUE : N'imagez pas l'animal pour la fluorescence avec le signal luminescent actif.

  1. Si seulement la bioluminescence d'imagerie, sautez à l'étape 6.
  2. Allumez le dispositif d'imagerie animale en direct in vivo.
  3. Mettre en place le système in vivo d'anesthésie d'imagerie animale vivante selon les directives du fabricant pour livrer entre 1,5% et 2% isoflurane à la chambre d'anesthésie et à la chambre d'imagerie.
  4. Anesthésiez les souris avec des métastases étiquetées fluorescentes à partir de l'étape 4 en les plaçant dans une chambre d'anesthésie et en livrant 1,5-2,5% d'isoflurane.
  5. Ouvrez le logiciel d'image (voir Tableau des matériaux) et connectez-vous.
  6. Cliquez sur le bouton Initialize et attendez que la machine entreparle.
  7. Changer le champ de vision en D.
    REMARQUE : Le champ de vision C peut également être utilisé si une vue plus étroite d'une souris est nécessaire, mais cela limite le nombre de souris qui peuvent être représentées simultanément.
  8. Une fois que le logiciel a indiqué que la caméra a atteint la température appropriée, cliquez sur le bouton Assistant d'imagerie, choisissez Fluorescence et choisissez ensuite la paire de filtres appropriée dans le menu déroulant.
    REMARQUE : Si le fluorophore utilisé n'est pas une option, choisissez Input EX/EM et tapez l'excitation et l'émission requises.
  9. Placez la souris dans la chambre comme décrit à l'étape 3.2.4.
  10. Cliquez sur Acquire Sequence.
  11. Après l'imagerie, remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète.
  12. Répétez l'étape 5.2 et les étapes 5.7-5.9 avec au moins une souris qui ne contient pas de métastases. REMARQUE : Cette souris sera utilisée pour quantifier et soustraire le signal d'arrière-plan pendant l'analyse (étape 8).
  13. Image 2-3 fois par semaine pendant toute la durée de l'expérience.

6. Suivi de la charge métastatique par bioluminescence à l'égard d'un dispositif d'imagerie animale vivant in vivo

  1. Allumez le dispositif d'imagerie animale en direct in vivo et configurez le programme comme suit.
    1. Ouvrez le logiciel d'image (voir Tableau des matériaux) et connectez-vous. Cliquez sur le bouton Initialize et attendez que la machine entreparle. Changer le champ de vision en D.
      REMARQUE : Le champ de vision C peut être utilisé pour une vue plus proche de l'image du corps complet de la souris; cependant, cela limite le nombre de souris qui peuvent être photographiés à la fois.
    2. Pour la première utilisation, modifiez les paramètres d'exposition comme suit : cliquez sur Modifier Préférences Acquisition (acquisition) Exposition automatique et changer le temps d'exposition maximum de la par défaut 60 secondes à 300 secondes et cliquez sur OK.
      REMARQUE : Ne modifiez aucun autre paramètre dans l'onglet exposition automatique.
  2. Mettre en place le système d'anesthésie selon les directives du fabricant pour livrer entre 1,5% et 2% isoflurane à la chambre d'anesthésie et la chambre d'imagerie.
  3. Assurez-vous que la caméra a atteint la température appropriée avant de passer à l'étape 6.4.
  4. Anesthésiez les souris contenant des métastes à partir de l'étape 4 en les plaçant dans une chambre d'anesthésie et en livrant 1,5-2,5% d'isoflurane.
  5. Préparer les souris à l'imagerie par bioluminescence comme suit.
    1. Chargez une seringue de 1 ml de D-luciferin (30 mg/mL en D-PBS) puis ajoutez une aiguille de calibre 30 de 1/2 pouce à la seringue et expulsez les bulles d'air.
    2. Mesurer et enregistrer la masse de la souris anesthésiée.
    3. Retenez la souris en pinçant les éraflures de leur cou à l'aide du pouce et des doigts de pointeur et en saisissant la queue entre le doigt pinkie et la base de la main. Inverser la souris à un angle de 45 degrés, avec sa tête pointée vers le bas.
    4. Insérez l'aiguille, côté bevel vers le haut, dans l'espace intrapéritoné gauche de la souris (IP). Confirmer l'entrée dans l'espace IP en retirant un petit volume. Il ne devrait pas y avoir de couleur à la base de l'aiguille lors du retrait dans l'espace IP.
    5. Injecter le volume approprié de D-luciferin pour une dose de 150 mg/kg.
    6. Immédiatement après l'administration de D-luciferin, commencez une minuterie et placez la souris à plat sur son dos dans le dispositif d'imagerie avec son nez dans le cône de nez et assurez-vous que 1.5-2.5% isoflurane est administré. Placez les séparateurs entre chaque souris si l'imagerie de souris multiples. Assurez-vous que les souris sont placées aussi à plat que possible (c.-à-d. ne pas se pencher d'un côté).
    7. Cliquez sur les cases Luminescent et Photograph, puis cliquez sur Acquérir dans le panneau de contrôle d'acquisition.
  6. Acquérez continuellement des images bioluminescentes jusqu'à ce que le signal de pointe soit atteint et utilisez l'image avec le signal bioluminescent de pointe pour l'analyse.
  7. Après l'imagerie, remettre la souris dans sa cage et surveiller pendant 15 minutes pour assurer une récupération complète.
  8. Image 2-3 fois par semaine pendant toute la durée de l'expérience.

7. Quantification du nombre et de la taille des métastases

REMARQUE : La durée de croissance des métastases est déterminée pour chaque lignée cellulaire et la souche de la souris, et sera influencée par le nombre de cellules injectées.

  1. Euthanasier les souris selon les directives institutionnelles standard.
  2. Isolez et retirez les poumons de chaque souris et rincez en 1x PBS pour enlever l'excès de sang.
  3. Séparer délicatement les poumons en lobes.
  4. Acquérir des images de métastases ZsGreen dans les lobes à 10x dans un champ lumineux et la fluorescence à l'aide d'un stéréoscope fluorescent avec un filtre à large bande GFP (excitation 470/40x).
    REMARQUE : Maintenez le même grossissement et la même luminosité pour tous les échantillons. Le grossissement utilisé peut varier en fonction de la taille, du nombre et de la luminosité des métastases ainsi que du champ de vision du microscope utilisé.
  5. Utilisez un logiciel d'analyse d'images pour quantifier la taille et le nombre de métastases à partir des images.
    REMARQUE: Le protocole pour l'analyse d'image est dépendant du logiciel et pourrait être optimisé avec des tumeurs à partir de l'étape3. Vous pouvez également compter manuellement le nombre de métastases dans chaque poumon à l'aide du stéréoscope fluorescent. Protocole peut être mis en pause ici et l'étape 8 peut être fait à tout moment après toutes les images in vivo ont été recueillies.

8. Traitement et analyse des données des images acquises avec le dispositif d'imagerie animale en direct in vivo

  1. Ouvrez tous les fichiers d'image pour chaque souris dans le logiciel d'image.
    REMARQUE: Utilisez l'image avec le signal bioluminescent de pointe pour l'analyse
  2. Assurez-vous que les unités sont en radiance pour les données bioluminescentes et l'efficacité pour les données fluorescentes en cliquant sur la flèche en haut à gauche de la fenêtre d'image et en la changeant à l'unité appropriée.
  3. Utilisez l'image du dernier point de temps pour créer une région d'intérêt (ROI) comme suit.
    1. Cliquez sur Les outils DE RETOUR dans la fenêtre Tool Palette. Insérez un retour sur investissement en cliquant sur la flèche et en sélectionnant 1.
    2. Cliquez sur la bordure du ROI et déplacez-la sur la poitrine de la souris. Ajuster la taille du retour sur investissement afin qu'il couvre la poitrine de la souris et n'exclut pas le signal.
  4. Cliquez sur pour mesurer les ROI et copier ou taper le nombre brut dans une feuille Excel.
    REMARQUE : Pour les données bioluminescentes, sélectionnez le flux total (photons/seconde), qui est la somme de tout l'éclat du retour sur investissement. Étant donné que les métastases ne croissent pas nécessairement uniformément, le flux total est préféré à l'éclat moyen parce qu'il mesure la somme du fardeau métastatique. De même, pour les données fluorescentes, le pourcentage d'efficacité totale (lumière d'émission (photons/seconde) /lumière d'excitation (photons/seconde)) devrait être utilisé au lieu de l'efficacité moyenne.
  5. Cliquez à droite dans le fichier d'image pour copier le retour sur investissement utilisé à l'étape 8.3 et le coller dans chaque fichier d'image.
    REMARQUE : Lors de la quantification des images fluorescentes, quantifiez la même région sur une souris qui a été imagesans d'une métasse. Utilisez ce signal comme signal d'arrière-plan et soustrayez-le de chaque image de souris fluorescente contenant des métastes acquise.
  6. Déplacez les ROI collés sur la même région sélectionnée à l'étape 8.3.4 pour chaque image et répétez l'étape 8.4.
  7. Tracer et analyser les données brutes comme suit (voir tableau supplémentaire 2).
    1. Effectuer une transformation du journal10 des données brutes pour chaque souris à l'aide de la formule indiquée (tableau supplémentaire 2) et tracer comme dans la figure 2D et la figure 4F. La transformation du journal10 linéarise la courbe de croissance qui tend à être géométrique et minimise l'hétéroscsitié.
    2. À l'aide de la régression linéaire, calculer la pente de la ligne ajustée au journal10 données transformées pour chaque souris tracée à l'étape 8.7.1 (Tableau supplémentaire 2). Reportez-vous à la formule du tableau supplémentaire 2 pour s'adapter à la ligne et calculer la pente en une seule étape.
    3. Tracer les valeurs numériques des pentes comme dans la figure 2E et la figure 4G. Utilisez le test t d'un étudiant ou l'ANOVA à sens unique (pour plus de 2 groupes) sur les pentes pour déterminer la signification statistique.

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Representative Results

Pour démontrer l'approche ci-dessus, nous avons effectué une expérience de preuve de concept dans laquelle un facteur critique de réplication, RPA3 a été renversé dans une lignée métastatique de cellules de carcinome mammaire de souris (4T122). Alors que le protocole décrit l'étiquetage des cellules avec des protéines à la fois luciferase et fluorescente avant la manipulation génétique, nous avons utilisé une approche modifiée parce que les vecteurs RNAi fournissent également ZsGreen (Figure 2A). Tout d'abord, les cellules 4T1 ont été transdulées de façon stable avec une construction lentivirale codant la luciférase de luciférase et la résistance à l'hygromycine (pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro). Après la sélection de l'hygromycine, un essai de luciferase a été effectué pour confirmer l'expression stable de la luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase (figure 2A). Ensuite, les cellules 4T1-Luciferase ont été stabilisées avec des vecteurs rétroviraux qui expriment ZsGreen et soit un contrôle miR30 à base de shRNA, ou un shRNA miR30-basé précédemment montré pour cibler efficacement la souris RPA316,23,24. Les cellules ont ensuite été injectées dans les souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue et le signal bioluminescent in vivo a été mesuré deux fois par semaine pour surveiller la charge métastatique (Figure 2B,C). Le signal transformé du journal10 pour chaque souris a été tracé comme fardeau métastatique au fil du temps (figure 2D) et les pentes de chaque parcelle ont été déterminées (Figure 2E). Ces données montrent que le taux de changement dans la charge métastatique est considérablement réduit avec RPA3 knockdown par rapport aux cellules témoins. Bien que les différences soient frappantes, ces données à elles seules ne nous permettent pas de déterminer si la charge métastatique réduite est le résultat de moins de métastases ou en raison d'une croissance plus lente des métastases. Par conséquent, les métastases étiquetées ZsGreen dans les poumons ont également été analysées à la fin de l'expérience. Les souris injectées avec des cellules de knockdown RPA3 n'avaient presque aucune métastase dans les poumons, tandis que les souris témoins avaient de nombreuses grandes métastases (Figure 3). De plus, les métastases qui se sont former à partir des cellules de renversement RPA3 étaient clairement plus petites que les métastases de contrôle 4T1(figure 3A). Conformément à nos comptes manuels (Figure 3B), le logiciel d'analyse d'images a compté beaucoup moins de métastases chez les souris RPA3 knockdown (Figure 3C). En outre, le fardeau métastatique total dans les poumons (somme des zones de chaque métastase en millimètres) a également été considérablement réduit par RPA3 knockdown (Figure 3D). Enfin, la taille des métastases individuelles qui se sont formées chez les souris knockdown RPA3 étaient généralement beaucoup plus petites que celles des souris témoins (Figure 3E). En plus des grandes métastases chez les souris témoins, nous avons observé de nombreuses petites métastases ainsi, mais ne peut pas déterminer si ce sont des cellules tumorales qui ont ensemoir le poumon et n'a pas grandi ou si elles sont des cellules tumorales jetées de l'une des plus grandes métastases qui ont re-ensebré le poumon dans un nouvel endroit (Figure 3E). Collectivement ces données montrent que RPA3 est nécessaire pour la formation de métastes par les cellules 4T1. Ces résultats étaient attendus parce que nos travaux précédents ont prouvé que les cellules de renversement de RPA3 avaient sensiblement réduit la capacité de former des métastases dans les poumons suivant l'injection de veine de queue16. Cependant, cette expérience démontre comment l'utilisation de l'imagerie animale vivante et de la quantification fluorescente du nombre et de la taille des métastases peut être utilisée pour déterminer si les changements dans la charge métastatique sont dus à des différences dans la colonisation ou la croissance métastatique.

Pour démontrer comment cette approche peut être utilisée pour répondre à une question plus pertinente sur le plan biologique, nous avons demandé si le PJJ et le TAZ sont nécessaires pour la colonisation métastatique et la croissance subséquente de ce modèle syngénique du cancer du sein. L'expression et l'activité de YAP ou TAZ sont augmentés dans de nombreux cancers par rapport aux tissus normaux et c'est prédictif de mauvais résultats pour les patients25,26,27,28,29. En outre, plusieurs études ont impliqué YAP, TAZ, ou TEADs, les partenaires critiques YAP/TAZ-contraignant, dans la métasse15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Compte tenu de ces données, nous avons utilisé notre approche pour tester si YAP et TAZ sont nécessaires pour la formation et la croissance des métastes. Pour cela, nous utilisons un vecteur rétroviral exprimant des shRNAs à base de tandem miR30 ciblant à la fois YAP et TAZ. Comme indiqué, ce tandem shRNA réduit efficacement l'expression des protéines YAP et TAZ et l'activité transcriptionnelle dans les cellules 4T1 (Figure 4A,B). Les cellules 4T1-Luciferase ont été transdulées de façon stable avec une version ZsGreen-exprimant de ce vecteur de shRNA tandem YAP/TAZ ou d'un shRNA miR30 de contrôle(figure 4C) et ensuite admis par des injections de veine de queue chez des souris syngénéiques de BALB/c. Comme le montre la figure 4, la vitesse à laquelle la charge métastatique augmentait était significativement plus rapide chez les souris injectées avec des cellules témoins par rapport aux souris injectées avec des cellules knockdown YAP/TAZ (Figure 4D-F). Significativement moins de métastases formées chez les souris injectées avec des cellules de renversement YAP/TAZ par rapport aux souris avec des cellules témoins qu'elles soient comptées manuellement(figure 5A,B) ou utilisant le logiciel d'analyse d'image (Figure 5C). Non seulement beaucoup plus de métastases se sont former chez les souris témoins, mais elles étaient généralement plus grandes(figure 5E). De façon constante, la charge métastatique dans les poumons (zone totale de métastase en mm) a également été considérablement réduite par yAP/TAZ knockdown (Figure 5D). Il est important de noter que lorsque les métastases sont grandes et proches les unes des autres, le logiciel peut être incapable de différencier les métastases distinctes. Ce fut le cas pour quelques métastases chez les souris témoins (souris 3 et souris 7). Ainsi, il est important de vérifier la sortie du logiciel d'analyse d'image pour s'assurer qu'il mesure avec précision la zone des tumeurs simples. C'est aussi pourquoi il est important d'optimiser le nombre de cellules injectées et la durée de l'expérience. Collectivement, ces données montrent que YAP et TAZ sont nécessaires pour maintenir la vitesse à laquelle la charge métastatique augmente dans un modèle murine syngénique du cancer du sein métastatique et que cela est dû à l'incapacité des métastases à former et à la croissance réduite des quelques métastases qui se sont former.

Figure 1
Figure 1 : Schéma du protocole. Tous les virus nécessaires sont d'abord emballés dans des cellules HEK-293FT. Les cellules désirées pour l'étude sont alors simultanément infectées par des virus de luciferase et fluorescents qui expriment chacun un gène unique de sélection de drogue de mammifères. Les cellules infectées sont ensuite étendues dans le support approprié contenant les deux médicaments pour sélectionner pour les cellules transductrices stable exprimant à la fois la luciferase et la protéine fluorescente. L'expression des deux étiquettes est confirmée comme décrit dans le protocole. Les cellules étiquetées sont ensuite transducées avec un troisième virus contenant une manipulation génétique (miR30 shRNA) et un troisième gène unique de sélection de médicaments. Après sélection avec le troisième médicament, les cellules sont injectées dans les souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue. La charge métastatique est surveillée chez les souris tout au long de l'expérience avec un système d'imagerie animale vivante in vivo. À la fin de l'expérience, les souris sont euthanasiées, et des images des poumons entiers sont prises à l'aide d'un microscope fluorescent de dissection, puis utilisées pour mesurer le nombre et la taille des métastases. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : L'imagerie animale vivante in vivo à base de Luciferase montre que le renversement du RPA3 réduit le fardeau métastatique du cancer du sein. (A) Schématisme montrant comment les cellules ont été générées pour cette étude in vivo. Les cellules 4T1 ont été transdulées de façon stable avec un lentivirus codant la luciferase et la résistance à l'hygromycine. Les cellules infectées ont été sélectionnées avec 600 g/mL d'hygromycine B pendant une semaine, puis l'activité de la luciferase a été mesurée dans les cellules parentales ou 4T1-luciferase à l'aide d'un kit de journaliste de luciferase et d'un lecteur de plaques (n - 1 expérience avec des puits de repli en moyenne). Les cellules 4T1-Luciferase ont ensuite été infectées par le rétrovirus qui délivrez des shARN ZsGreen et miR30 ciblant soit mCherry (contrôle) ou mRPA3. La sélection de puromycine (2,5 g/mL) pendant 3 jours a été utilisée pour sélectionner pour une intégration stable du virus. (B-E) 4T1-luciferase cellules exprimant de façon stable ZsGreen et le contrôle (sh-mCherry) ou mRPA3 (sh-mRPA3-431) shARN ont été injectés chez les souris et photographiés pour la bioluminescence sur les jours indiqués comme décrit dans le protocole. (B et C) Images bioluminescentes pour une souris représentative de chaque groupe sur l'injection de jour indiquée(D) Parcelle du journal10 signal de luciferase transformé mesuré pour chaque souris au cours de l'expérience. (E) Scatter plot with mean (solid line) for the slopes of each mouse in D (n - 6 pour sh-control and 8 for sh-mRPA3-431). L'importance statistique a été testée à l'aide du test t d'un étudiant; 0,05 euros. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : La quantification des métastases fluorescentes révèle que le renversement de RPA3 empêche la colonisation métastatique et la croissance subséquente des cellules cancéreuses du sein. (A) Images fluorescentes (à gauche) et brightfield (à droite) de lobes représentatifs de chaque souris injectées à la figure 2 21 jours après l'injection. Les astérisques (MD) indiquaient des bronches autofluorescentes vertes. (C-E) Le logiciel d'analyse d'images (voir Tableau des matériaux)a été utilisé pour identifier et mesurer les objets à l'aide d'un seuil d'intensité de 25 à 100 et d'un seuil de taille de 0,01 mm2 à l'infini. (B et C) Scatter parcelle avec la moyenne (barre solide) du nombre total de métastases dans les poumons de chaque souris lorsqu'il est compté (B) par logiciel d'analyse d'image (C). (D) La superficie totale (mm) du poumon qui a été mesurée avec un logiciel d'analyse d'image est tracée comme charge métastatique avec le moyen indiqué par une barre solide. (E) La taille de chaque métastes est tracée pour chaque souris. Les souris témoins sont indiquées par les points bleus et les souris knockdown mRPA3 par les points rouges. Notez que la barre d'échelle est séparée à 1 mm pour faciliter la visualisation de la taille et du nombre de petites métastases (n -6 sh-control, 8 sh-mRPA3-431). L'importance statistique a été testée à l'aide du test t d'un étudiant; p 0,06; p 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Le renversement du ponctueux YAP/TAZ réduit le fardeau métastatique du cancer du sein. (A et B) les cellules 4T1 exprimant de façon stable le contrôle miR30 (mCherry) ou le tandem YAP/TAZ shRNAs (sh-mYAP1/mTAZ6) ont été analysées par analyse de tache occidentale (A) ou transfec avec un journaliste de luciferase YAP/TAZ-TEAD construit et a évalué pour yAP/TAZ-TEAD activité transcriptionnelle comme décrit précédemment15,16 (B) (n ' 5 pour le contrôle et 4 pour YAP1/TAZ6). (C) Schématisme montrant comment les cellules ont été générées pour l'étude in vivo. Les cellules 4T1-Luciferase ont été infectées par des rétrovirus qui fournissent ZsGreen et soit un shRNA miR30 ciblant mCherry (contrôle) ou tandem miR30 shRNAs ciblant à la fois mYAP et mTAZ. Les cellules infectées ont été sélectionnées dans la puromycine (2,5 g/mL) pendant 3 jours. Les cellules 4T1-luciferase exprimant de façon stable ZsGreen et control (sh-mCherry) ou YAP/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ1) ont ensuite été injectées chez des souris et représentées pour la bioluminescence par les jours injectés. (D et E) Images bioluminescentes pour une souris représentative de chaque groupe sur l'injection indiquée de jour.après. (F) Terrain du journal10 signal de luciferase transformé mesuré pour chaque souris au cours de l'expérience. (G) Scatter plot with Mean (barre solide) pour les pentes de chaque souris en F (n 7 pour sh-control et 8 pour sh-mRPA3-431). La moyenne est indiquée par une ligne solide. L'importance statistique a été testée à l'aide du test t d'un étudiant; p 0,06; p . 0,01; ***. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Le PJM et le ZAT sont nécessaires pour que les cellules cancéreuses métastatiques du sein colonisent les poumons. (A) Images fluorescentes (à gauche) et brightfield (à droite) de lobes représentatifs de chaque souris injectées à la figure 4 21 jours après l'injection. (C-E) Les images ont été traitées à l'égard d'un logiciel d'analyse d'images tel que décrit dans la figure 3. (B et C) Scatter parcelle avec la moyenne (barre solide) du nombre total de métastases dans les poumons de chaque souris lorsqu'il est compté manuellement (B) ou par un logiciel d'analyse d'image (C). (D) La superficie totale de toutes les métastases (mm) a été mesurée à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images et tracée comme une charge métastatique avec la moyenne (barre solide). (E) La taille de chaque métastes est tracée pour chaque souris. Les souris témoins sont indiquées par les points bleus et les souris sh-mYAP1/mTAZ6 knockdown par les points rouges. Notez que la barre d'échelle est séparée à 1 mm pour mieux visualiser la taille et le nombre de petites métastases (n 7 sh-control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). La moyenne est indiquée par une ligne solide. L'importance statistique a été testée à l'aide du test t d'un étudiant; p 0,05, p 0,01; **. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau supplémentaire 1 : Tableau des vecteurs. Tous les vecteurs utilisés sont répertoriés et de nouveaux vecteurs sont décrits. Des techniques standard de biologie moléculaire ont été utilisées pour cloner de nouveaux vecteurs et des séquences pour les shRNA 97-mer nouvellement décrits sont inclus. Citations se réfèrent à: [1]53, [2]16, [3]54S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 2 : Exemple de traitement et d'analyse de données d'imagerie animale vivante in vivo. Feuille de calcul montrant comment les données brutes des images animales vivantes in vivo sont converties pour analyse telles que décrites dans les étapes 6.7 et 6.8. Les données brutes acquises à partir de l'imagerie animale vivante in vivo transformé à l'aide d'une transformation du journal10. Le taux de variation de la charge métastatique est calculé pour chaque souris en calculant la pente générée par le journal10 données transformées. Par exemple, l'analyse de la luciferase de la figure 2. Les colonnes sont codées en couleur pour indiquer quelles données ont été utilisées pour générer chaque valeur de pente et les formules sont imbondites dans la feuille de calcul. Le double clic du puits révélera la formule utilisée pour traiter les données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Étapes critiques de la méthode
Il est essentiel d'optimiser le nombre de cellules injectées (étape 3) pour une lignée cellulaire donnée et une souche de souris, car cela peut grandement influencer le nombre de métastases qui se forment et la durée de l'expérience. Si trop de cellules sont injectées ou si les métastases se développent trop longtemps, les métastases peuvent être difficiles à compter, ce qui rend les effets de la manipulation génétique difficiles à évaluer. Cependant, si trop peu de cellules sont injectées, peu ou pas de métastases peuvent se former. Ainsi, une expérience préliminaire devrait être faite en utilisant différents nombres de cellules pour déterminer le nombre optimal et la durée de croissance des métastases. Pour assurer un nombre constant de métastases au sein d'un groupe, il est important d'injecter un nombre égal de cellules viables dans chaque souris. Étant donné que les cellules peuvent s'installer dans le tube et la seringue, les cellules doivent être délicatement remises en suspension avant de charger la seringue, et les suspensions cellulaires ne doivent pas être laissées dans la seringue trop longtemps (étape 4.3.2). La viabilité cellulaire diminue plus les cellules sont en suspension, de sorte que la quantité de temps entre la trypsinisation et l'injection des cellules ne devrait pas être plus d'une heure (étape 4.2.5). Les bulles d'air et les gros amas de cellules ne doivent pas être injectés car ceux-ci peuvent causer des embolies qui tuent la souris. En outre, le dessin des cellules à travers l'aiguille peut les cisailler, de sorte que la seringue doit être chargée sans l'aiguille. Pour confirmer qu'un nombre relativement égal de cellules a été injectée, des images d'animaux vivants in vivo peuvent être prises peu de temps après l'injection (Figure 2B, Figure 4D).

La quantification précise et cohérente du signal bioluminescent est importante et dépendante des cellules qui prennent et métabolisent le D-luciferin. Cela peut être influencé par de nombreuses variables, y compris, la dose de D-luciferin, le moment de l'injection, la température corporelle de la souris, comment anesthésié la souris est lorsqu'il est injecté, et comment une souris est positionnée dans la chambre d'anesthésie avant l'imagerie. Par conséquent, il est essentiel de garder ces étapes cohérentes pour toutes les souris et les séances d'imagerie. Nous avons utilisé un coussin chauffant pour maintenir la température constante du corps de la souris dans la chambre d'anesthésie. Étant donné que le signal doit pénétrer dans le tissu pour la détection bioluminescente et fluorescente, il est également essentiel de garder la position de la souris cohérente pour chaque image (plat sur son dos fonctionne mieux pour l'imagerie des poumons). La quantification des images fluorescentes de l'imagerie animale vivante in vivo doit toujours se faire en utilisant les unités d'efficacité % car cela permet une comparaison appropriée entre les images. De même, le flux total (photons/seconde) doit toujours être utilisé lors de la quantification des images bioluminescentes. Pour l'analyse de la charge métastatique, la transformation du journal10 convertit la courbe de croissance (avant que le signal maximal ne soit atteint) en une parcelle linéaire, ce qui était nécessaire pour l'analyse de la pente.

Modifications et dépannage de la méthode
Dans le protocole présenté, une population de cellules est d'abord transducée de façon stable avec une protéine fluorescente et la luciférase, puis cette population est transdulée avec un vecteur de contrôle ou un vecteur ciblant le gène d'intérêt. Cela garantit que les deux populations cellulaires ont la même expression de protéines fluorescentes et de luciférase. Cependant, comme alternative, les vecteurs viraux qui livrent simultanément deux de ces composants pourraient être utilisés. En effet, dans les expériences représentatives, nous avons utilisé ZsGreen exprimant des vecteurs rétroviraux pour exprimer les shARN dans les cellules 4T1-luciférase. Il est recommandé que l'expression de la luciferase et de la protéine fluorescente soit astoyue dans tous les groupes cellulaires après que le gène d'intérêt a été modifié. Différents niveaux d'expression entre les groupes peuvent compliquer l'interprétation des données, il est donc préférable que les différents groupes aient une expression similaire de la protéine fluorescente et de la luciferase. En outre, les globules rouges peuvent être autofluorescents et peuvent rendre difficile de visualiser les métastases fluorescentes dans les poumons. Si tel est le cas, les globules rouges peuvent être éliminés des poumons par perfusion de PBS pendant l'euthanasie afin de réduire le fond autofluorescent (les techniques et les directives appropriées d'euthanasie doivent être suivies). Bien que les différences entre les groupes témoins et les groupes de renversement dans nos expériences représentatives soient dramatiques, la variabilité inhérente de la souris à la souris qui existe souvent dans les essais de métastes in vivo est évidente chez les souris témoins(figure 3B et figure 5B). Lorsque cette variabilité est élevée, il peut être difficile de déterminer l'ampleur de l'effet de renversement. Une autre approche qui pourrait être utilisée pour réduire cette variabilité est d'étiqueter les cellules témoins et les cellules knockdown avec des protéines fluorescentes distinctes et des enzymes de luciferase distinctes, puis mélanger les deux populations en nombres égaux et d'injecter le mélange. Par exemple, les cellules de contrôle exprimant de façon stable la tomate et la renilla luciferase pourraient être mélangées à des cellules knockdown exprimant ZsGreen et luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase. Les dispositifs d'imagerie animale vivants in vivo peuvent distinguer la luciferase de renilla de la luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase, et de la tomate de ZsGreen, ainsi la fluorescence ou la luminescence peut être employée pour quantifier indépendamment chaque population de cellules. En effet, l'imagerie biluciferase des cellules 4T1 se développant comme tumeurs primaires chez les animaux vivants a été démontrée utilisant un dispositif d'imagerie animale vivante in vivo4. Cependant, il est important de noter qu'il peut y avoir chevauchement dans le signal fluorescent, donc une étape spectrale de démélangement (voir les lignes directrices des fabricants) devrait être incluse dans cette approche. En outre, la luciferase renilla et la luciferase de luciferase de luciferase de feu devraient être images séparément avec un délai proportionné qui permet au premier signal de luciferase de ne plus être détectable avant l'imagerie la seconde. L'utilisation de fluorophores distincts permet encore de quantifier le nombre et la taille des métastes dans les poumons16. Pour tester la colonisation métastatique et la croissance dans d'autres organes en dehors des poumons ce protocole peut être modifié et utilisé pour les injections intracardiaques et veines portail9,10.

Limites de la méthode
L'utilisation d'un dispositif d'imagerie animale vivante in vivo pour acquérir un fardeau métastatique en temps réel en conjonction avec des cellules cancéreuses étiquetées fluorescentes fournit une méthode puissante pour essayer la colonisation métastatique et la croissance subséquente; toutefois, cette approche limite. Certains gènes peuvent être nécessaires pour la prolifération cellulaire innée plutôt que des rôles spécifiques dans la métaste. Des tests de prolifération cellulaire in vitro pourraient être effectués avant l'expérience in vivo pour déterminer si le gène perturbe la croissance in vitro. Lors de l'imagerie d'un animal vivant, le signal bioluminescent ou fluorescent des métastases doit être assez fort pour passer à travers le tissu. En outre, les propriétés optiques (c.-à-d., absorption et diffusion) du tissu influencent également la détection55. La source de lumière d'excitation doit pouvoir passer par le tissu pour exciter les cellules cancéreuses fluorescentes étiquetées et la bioluminescence a une plus grande gamme dynamique que la fluorescence. Ainsi, bien que la fluorescence puisse être utilisée pour l'imagerie animale vivante, la bioluminescence est préférable pour détecter le signal dans les organes internes. En outre, certaines souches de souris immunocompétentes peuvent rejeter les cellules exprimant des protéines fluorescentes. En effet, nous avons constaté que les cellules exprimant la tomate, Le GFP ou le mCherry ont été rejetées ou ont régulé le fluorophore lors de la croissance chez les souris BALB/c (données non montrées et15). Cependant, comme démontré ici (Figure 3 et Figure 5) et précédemment15,16, les cellules étiquetées ZsGreen sont détectables chez ces souris. Dans les cas où l'expression des protéines fluorescentes devient indétectable, une autre façon de quantifier la colonisation métastatique relative est d'utiliser qPCR pour quantifier soit le gène fluorescent ou un autre gène dans le vecteur viral intégré15. Bien qu'un dispositif d'imagerie animale vivante in vivo vous permette de détecter les changements dans la charge métastatique, il ne permet pas de déterminer si ces changements sont dus à une taille ou un nombre modifié de métastases. Il ne fournit pas non plus d'informations spatiales sur l'emplacement des métastases. En outre, la force du signal peut être influencée par la profondeur du tissu.

L'importance de la méthode et des applications futures potentielles
Il existe de nombreuses façons de modifier cette approche pour obtenir des informations plus ou différentes. Une variété de lignées de cellules cancéreuses, y compris les lignées cellulaires cancéreuses humaines ou les xénogreffes dérivées du patient, pourrait être utilisée dans cet état d'œil. D'autres modèles de souris pourraient également être utilisés, y compris des souris transgéniques ou knock-out conçues pour tester comment le ciblage des protéines faites par les cellules stromales influence la colonisation métastatique et la croissance des cellules cancéreuses injectées. S'il y a plusieurs gènes candidats à tester, cette approche peut être multiplexée parce que les dispositifs d'imagerie animale vivante in vivo peuvent détecter et distinguer un large éventail de fluorophores. Cela réduirait le nombre de souris nécessaires et augmenterait le nombre de cibles qui peuvent être testées. L'imagerie animale vivante in vivo peut également être combinée à l'imagerie par rayons X ou CT9 pour fournir beaucoup plus d'informations spatiales sur l'emplacement des métastases. Enfin, cette approche peut être modifiée pour mettre en œue des étapes plus spécifiques au sein de la cascade de colonisation métastatique. Par exemple, les étapes impliquées dans l'ensemencement des cellules tumorales (survie intravasculaire, extravasation et survie après extravasation) peuvent être distinguées en quantifiant le nombre de cellules tumorales dans les poumons à plusieurs moments dans les 3 premiers jours suivant l'injection (comme cela a été fait ici16). Dans ce cas, les poumons peuvent également être tachés avec des marqueurs vasculaires et image ex vivo pour déterminer le pourcentage de cellules cancéreuses qui ont extravasé à chaque point de temps56,57.

En résumé, l'utilisation de l'imagerie animale vivante en temps in vivo des cellules cancéreuses fluorescentes et luminescentes suivant l'injection de veine de queue permet une analyse plus détaillée de la façon dont un gène ou des gènes candidats influence la colonisation métastatique et la croissance ultérieure. Cette approche est plus rapide et moins coûteuse que les modèles de souris autochthonous et évite certaines des mises en garde des modèles de métastes spontanées. L'utilisation de la fluorescence et de la luminescence comme moyen de détecter et de quantifier les métastases donne aux chercheurs des résultats indépendants qui améliorent la confiance dans les résultats et permettent une flexibilité dans la conception expérimentale. L'utilisation de la fluorescence pour quantifier la taille et le nombre des métastes évite la nécessité d'un traitement et d'une analyse histologiques longs et potentiellement coûteux, et permet une utilisation supplémentaire des tissus entiers. Le protocole peut être utilisé avec un certain nombre de techniques différentes pour manipuler l'expression ou la fonction du gène candidat, tels que l'ARNi, l'expression transgène, ou l'édition CRISPR/Cas-mediated, et peut également être employé pour tester de petites molécules, des anticorps de blocage de fonction, ou d'autres composés thérapeutiques potentiels. Comme mentionné ci-dessus, plusieurs modifications simples peuvent être apportées pour améliorer l'analyse et fournir des informations supplémentaires. Cette approche est un moyen idéal d'identifier et de tester les gènes pro-métastatiques qui ont un potentiel thérapeutique pour le traitement du cancer.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions Emily Norton d'avoir aidé à l'aide aux infections virales et à la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également Ryan Kanai pour son aide dans l'acquisition d'images des poumons et Kate E. Tubbesing pour l'aide à l'analyse de l'image des métastases vertes dans les poumons. Nous remercions le personnel des installations de recherche animale pour leur soutien et leur aide dans la préparation de cette vidéo. Ce travail a été soutenu par une subvention Susan G. Komen Catalyseur de carrière qui a été accordée à J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

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References

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Recherche sur le cancer numéro 154 cellules 4T1 modèle de souris syngénéique métastase colonisation métastatique cancer du sein souris imagerie animale vivante métastase de veine de queue YAP TAZ
Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons
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Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

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