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Immunology and Infection

Appliquer l’imagerie cellulaire en direct et la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion Legionella pneumophila Dot/Icm

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60693
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,2, 1
1Department of Microbial Pathogenesis, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University School of Medicine, 2Microbial Sciences Institute, Yale University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

L’imagerie des cellules bactériennes est une approche émergente de biologie des systèmes axée sur la définition de processus statiques et dynamiques qui dictent la fonction de grandes machines macromoléculaires. Ici, l’intégration de l’imagerie cellulaire vivante quantitative et de la tomographie cryo-électronique est utilisée pour étudier l’architecture et les fonctions du système de sécrétion de type IV de Legionella pneumophila.

Abstract

Le système de sécrétion Dot/Icm de Legionella pneumophila est une nanomachine complexe du système de sécrétion DE type IV (T4SS) qui localise au pôle bactérien et favorise la livraison de protéines et de substrats d’ADN aux cellules cibles, un processus nécessitant généralement un contact direct de cellule à cellule. Nous avons récemment résolu la structure de l’appareil Dot/Icm par la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) et avons montré qu’il forme un canal de cellule qui s’étend sur une enveloppe cellulaire qui se connecte à un complexe cytoplasmique. L’application de deux approches complémentaires qui préservent la structure indigène du spécimen, la microscopie fluorescente dans les cellules vivantes et cryo-ET, permet la visualisation in situ des protéines et l’assimilation de la stoichiométrie et le moment de production de chaque composant de machine par rapport à d’autres sous-unités Dot/Icm. Pour étudier les exigences en matière de positionnement polaire et pour caractériser les caractéristiques dynamiques associées à la biogenèse de la machine T4SS, nous avons fusionné un gène codant des protéines fluorescentes vertes superpliantes aux gènes Dot/Icm ATPase à leurs positions indigènes sur le chromosome. La méthode suivante intègre la microscopie quantitative de fluorescence des cellules vivantes et cryo-ET pour quantifier la localisation polaire, la dynamique et la structure de ces protéines dans les cellules bactériennes intactes. L’application de ces approches pour étudier le Legionella pneumophila T4SS est utile pour caractériser la fonction du système Dot/Icm et peut être adaptée pour étudier une grande variété d’agents pathogènes bactériens qui utilisent le T4SS ou d’autres types de complexes de sécrétion bactérienne.

Introduction

Legionella pneumophila (L. pneumophila), l’agent éétiologique de la maladie des légionnaires, habite les réservoirs d’eau douce, où les bactéries se propagent en infectant et en se reproduisant dans les protozoaires aquatiques nageant librement. L. pneumophila provoque des éclosions de maladie chez l’homme lorsque l’inhalation de bactéries aérosolisées provenant de sources d’eau potable se produit. Dans les cellules infectées, la subversion des voies hôtes permet à L. pneumophila de retarder la maturation endocytique du vacuole dans lequel elle réside et de promouvoir la biogenèse d’un compartiment cellulaire qui soutient la réplication bactérienne. Ce processus est piloté par un système spécialisé de sécrétion de type bactérien IVB (T4BSS) connu sous le nom de Dot/Icm et son répertoire de plus de 300 protéines « effecteurs » qui sont translocalisés dans le cytosol hôte pendant l’infection pour faciliter la manipulation des fonctions cellulaires1,2,3,4,5. Les mutants dépourvus d’un appareil fonctionnel Dot/Icm ne parviennent pas à délivrer des effecteurs dans le cytosol hôte, sont défectueux pour la réplication intracellulaire, et sont avirulents dans les modèles animaux de la maladie6,7.

De nombreuses espèces bactériennes ont mis au point des machines multicomposantes extrêmement complexes et dynamiques qui sont nécessaires pour les processus d’infection. D’autres T4BSS comme le système Dot/Icm sont également essentiels pour la réplication intracellulaire d’agents pathogènes bactériens tels que Coxiella burnetii et Rickettsiella grylli. Bien que les T4BSS soient évolutivement liés aux systèmes IVA de type prototypique, qui servent de médiateur au transfert d’ADN et peuvent fournir un répertoire limité de protéines effectrices, le système Dot/Icm a presque deux fois plus de composants de machine et offre une grande variété d’effecteurs. Vraisemblablement, cette expansion du nombre de composants a permis à l’appareil Dot/Icm d’accueillir et d’intégrer facilement de nouveaux effecteurs8,9.

Nous avons récemment utilisé la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) pour résoudre la structure de l’appareil Dot/Icm in situ et avons montré qu’il forme un canal de cellule qui s’étend sur une enveloppe cellulaire qui se connecte à un complexe cytoplasmique. Une analyse plus approfondie a révélé que le cytosolic ATPase DotB s’associe au système Dot/Icm au pôle cellulaire L. pneumophila par des interactions avec le cytosolic ATPase DotO. Nous avons découvert que DotB affiche un mouvement cytosolique dans la plupart des cellules bactériennes, ce qui indique que cet ATPase est présent dans une population cytosolique dynamique, mais s’associe également avec les complexes polar Dot/Icm. En outre, DotO forme un assemblage hexamerique de dimers DotO associés au complexe interne de membrane, et un hexamer DotB se joint à la base de ce complexe cytoplasmique. L’assemblage du complexe énergétique DotB-DotO crée un canal cytoplasmique qui dirige la translocation des substrats à travers le T4SS(figure 1)10.

Malgré ces progrès récents, on sait peu de choses sur le fonctionnement du système Dot/Icm et sur la façon dont chaque protéine s’assemble pour former un appareil actif8. La découverte des circuits réglementaires du T4SS Dot/Icm est fondamentale pour comprendre les mécanismes moléculaires des interactions hôte-pathogène. Par conséquent, nous discutons de la façon d’utiliser la microscopie cellulaire vivante et cryo-ET pour détecter et caractériser les composants essentiels du système L. pneumophila Dot/Icm qui sont étiquetés avec le super-folder GFP (sfGFP). À l’aide de la microscopie quantitative de fluorescence, la localisation polaire de DotB sera définie dans un fond de type sauvage ou lorsque le système de type IV est supprimé. La microscopie en accéléré sera utilisée pour quantifier les différences de localisation et de dynamique entre les ATPases cytosoliques Dot/Icm.

L’application combinée de deux approches complémentaires telles que l’imagerie en direct et le cryo-ET offre un avantage par rapport à d’autres systèmes in vitro. Les deux méthodes sont effectuées dans des cellules intactes et préservent l’environnement naturel du T4BSS, minimisant ainsi la perturbation de la structure indigène pendant la préparation de l’échantillon. Parce que la surexpression des protéines peut altérer la stoichiométrie de l’appareil de sécrétion, les fusions sfGFP sont retournées par échange allélique au chromosome Legionella de sorte que chaque fusion est codée en une seule copie et l’expression est conduite par le promoteur endogène. La visualisation des fusions codées chromosomalement permet de quantifier le niveau exact de protéines exprimés à un moment défini. Cryo-ET a également de nombreux avantages pour déterminer la structure des systèmes de sécrétion. L’avantage le plus notable est que les échantillons cryo-ET sont composés de cellules intactes congelées qui préservent les complexes indigènes dans le contexte de l’architecture des cellules bactériennes. Par conséquent, le cryo-ET peut être préférable aux approches de purification biochimique, qui extraient des complexes membranaires et peuvent dépouiller les protéines périphériques de l’appareil de base ou modifier la structure globale. En outre, le marquage d’une protéine d’intérêt avec une protéine encombrante comme le sfGFP ajoute une masse qui est détectable par cryo-ET et peut aider à cartographier les différents sous-modèles de l’appareil Dot/Icm sur la structure obtenue par cryo-ET.

Cette approche est un outil puissant pour découvrir des informations structurelles sur les complexes multimoléculaires qui s’assemblent dans la membrane cellulaire bactérienne. L’interprétation des structures élucidées à l’aide de ces techniques aidera le terrain à comprendre comment fonctionnent les composants T4BSS, pourquoi tant de composants sont nécessaires pour fonctionner, comment les composants interagissent dans le plus grand complexe, et quelles fonctions ces sous-assemblages effectuer.

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Protocol

REMARQUE : Toutes les procédures impliquant la croissance, la manipulation et l’imagerie de L. pneumophila doivent être effectuées dans un laboratoire biologique de niveau de sécurité 2 conformément aux directives locales.

1. Insertion de sfGFP dans le chromosome L. pneumophila à l’aide de la stratégie d’échange allégique et de sélection double (figure 2, figure 3)

  1. Clonez dans le vecteur de remplacement génétique pSR47S11 la séquence suivante : les 1 000 bp en amont du site d’intérêt, puis la séquence sfGFP, puis les 1 000 pb en aval du site d’intérêt(figure 2). La séquence sfGFP doit être placée dans le cadre du N-terminus ou du C-terminus se termine par un lien contenant quatre à huit acides aminés. Transformez le vecteur résultant en E. coli DH5-pir. Plus tard, strie L. pneumophila (le receveur) pour les colonies individuelles sur l’extrait de charbon de bois-levure (CYE) agar12 contenant 100 g/mL streptomycine et se développent pendant 5 jours à 37 oC(figure 3).
  2. Streak L. pneumophila sur CYE-agar-streptomycin et se développer pendant 2 jours à 37 oC (patch lourd)10. Streak E. coli DH5MD transformé avec pRK600 aide plasmid (aide)13 sur LB agar contenant 25 g/mL chloramphenicol. Streak l’E. coli DH5 -pir (donneur) sur l’agar LB contenant 50 g/mL kanamycine.
  3. Effectuer l’accouplement triparental : incuber une colonie de l’aide, une colonie du donneur, et le receveur en superposant les plaques des trois souches sur une plaque d’agar CYE sans sélection et incuber pendant 4 à 8 h à 37 oC. Au fur et à mesure que les contrôles négatifs couvent un mélange de souches aide-bénéficiaire et un mélange de souches donneurs-bénéficiaires pendant les mêmes périodes.
  4. Resuspendez les réactions d’accouplement dans 500 l’utérus de ddH2O. Plaque 20 L et 50 l des réactions sur CYE agar contenant 100 g/mL streptomycine et 10 g/mL kanamycin et poussent pendant 5 jours à 37 oC. Streak quatre des clones résultant sur L’agar CYE contenant 100 g/mL streptomycine et se développent pendant 5 jours à 37 oC.
  5. Streak 16 clones sur CYE agar contenant 5% de saccharose et 100 g/mL streptomycine et se développent pendant 5 jours à 37 oC. Ensuite, stries 32 de ces clones sur l’agar CYE contenant 100 g/mL streptomycine et sur l’agar CYE contenant 100 g/mL streptomycine et 10 g/mL kanamycine et poussent pendant 5 jours à 37 oC.

2. Isolation des clones qui ont intégré le sfGFP dans le chromosome de L. pneumophila

  1. Clones de streak qui étaient sensibles à la kanamycine sur les plaques de CYE-agar-streptomycine et confirment l’insertion du sfGFP dans le chromosome avec la colonie PCR. Utilisez des amorces complémentaires au gène sfGFP et à la région chromosomique d’intérêt pour amplifier la jonction d’insertion.
    1. Mélanger 0,5 L de chacune des solutions d’amorce de 10 M et une colonie à un volume final de 12,5 L et à la dénature pendant 10 min à 95 oC. Laisser refroidir sur la glace pendant 10 min, ajouter 12,5 L de la solution de mélange principal PCR 2x et effectuer une analyse PCR.
  2. Cultivez de lourdes parcelles des colonies isolées sur des plaques CYE-agar-streptomycine pendant 2 jours à 37 oC. Examinez les niveaux d’expression et la stabilité des fusions de sfGFP en immunoblotting avec un anticorps anti-GFP.

3. Imagerie cellulaire en direct de L. pneumophila avec des composants fluorescents Tagged Dot/Icm

  1. Préparation de tampons agaroses
    1. Faire environ 30 ml d’une solution d’agarose à faible fondre de 1 % dans l’eau. Cuire au micro-ondes dans un flacon de verre pendant environ 90 s, tourbillonnant de temps en temps, jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
    2. Placez deux 22 x 22 x 0,15 mm3 toboggans en verre sur le bord d’une glissière en verre de 25 x 75 x 1,1 mm3, l’une sur l’autre. Empilez deux autres 22 x 22 x 0,15 mm3 toboggans en verre sur l’autre bord.
    3. Pipette environ 1 mL de l’agarose fondue dans la glissière centrale entre les deux toboggans en verre supérieur, puis placez une autre glissade de 25 x 75 x 1,1 mm3 sur le dessus de l’agarose fondue. Essayez d’éviter la formation de bulles d’air. Refroidir les lames à 4 oC pendant 15 min.
    4. À l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir, coupez délicatement le tampon en petits carrés, soit 5 x 5 mm2. Fixez un adhésif recôtit à double face 17 x 28 x 0,25 mm3 sur une glissière en verre de 25 x 75 x 1,1 mm3 et placez plusieurs garnitures sur la glissière.
  2. Acquisition d’images
    REMARQUE : Les étapes suivantes sont décrites pour un microscope qui est sous le contrôle du SlideBook 6.0 et équipé d’enlumineurs à l’état solide, d’une caméra monochrome CCD et d’une lentille objective 100x (1,4 ouverture numérique). Si nécessaire, utilisez d’autres appareils de microscopie avec des configurations matérielles et logicielles appropriées qui peuvent être personnalisées en fonction des paramètres du protocole.
    1. Dissoudre une lourde parcelle de L. pneumophila dans 1 ml de ddH2O, vortex et pipet 2-3 'L de la dilution sur les garnitures. Placer un 50 x 24 x 0,15 mm3 couverture doucement sur le cadre adhésif.
    2. Dans la fenêtre de capture ajuster le ND à 180. Ajustez le binning à 2/2 et utilisez le canal de 488 nm pour exposer l’échantillon entre 500 et 1 000 ms. Valider la spécificité du signal de fluorescence en imagerie L. pneumophila non étiqueté avec les mêmes paramètres(figure 4).

4. Quantification de la localisation polaire et de la dynamique des composants Dot/Icm

REMARQUE : Les étapes suivantes sont conçues pour les images de 0,129 m par pixel qui ont été acquises avec 2 x 2 binning.

  1. Quantification de la polarité pour les protéines de fusion sfGFP (figure 5)
    1. Ajustez le contraste d’image de sorte que les bactéries sont clairement visibles. Utilisez l’outil de la région pour placer un rectangle de 0,25 x 1,3 m2 à partir du pôle et s’étendant dans le cytoplasme. Le rectangle doit rester précisément à l’intérieur des frontières bactériennes.
    2. Marquez au moins 200 bactéries et utilisez le bouton Région pour masquer pour créer des masques dans les régions d’intérêt. Sous les statistiques de masque et la portée de masque, choisissez l’objet. Puis, sous les caractéristiques et l’intensité, marquez l’intensité moyenne et la variance.
    3. Exporter les données et calculer les scores de polarité de chaque bactérie comme le rapport entre l’écart à l’intensité moyenne.
    4. Pour les applications à haut débit, utilisez un objectif de phase et une configuration de condensateur appropriée pour acquérir des images avec les canaux de phase et 488 nm. Assurez-vous de choisir les champs de vision où les bactéries sont entièrement séparées.
    5. Ajuster le contraste du canal de phase de l’image à un niveau où les bactéries sont clairement visibles. Ouvrez l’image double canal, lancez la fenêtre Create Segment Mask et changez le canal en phase.
    6. Ajustez un seuil approprié et supprimez les petits objets avec le bouton Définir les objets. Sous le masque de raffinage, choisissez des objets supprimer les bords et plus tard séparer les masques de bactéries qui sont adjacents les uns aux autres.
    7. Calculez les scores de polarité du signal dans le canal 488 pour chaque cellule comme cela a été décrit précédemment dans les étapes 4.1.2-4.1.3.
  2. Quantification de la dynamique des protéines de fusion sfGFP(figure 6)
    REMARQUE : Suivez les instructions de la section 3 pour préparer un échantillon pour l’acquisition d’images. La dynamique est définie comme des changements d’intensité au fil du temps et les étapes suivantes sont conçues pour de courtes périodes d’imagerie (c.-à-d. plusieurs minutes). Ajouter à la garniture les suppléments appropriés si de plus longues périodes d’imagerie sont désirées.
    1. Dans la fenêtre Image Capture, marquez Timelapse,entrez le temps des intervalles dans la boîte d’intervalle, et entrez 2 dans la boîte de points de temps. Acquérir deux images successives de L. pneumophila exprimant la protéine fluorescente d’intérêt.
    2. Ajuster le contraste d’image jusqu’à ce que les cellules soient clairement visibles. Suivez la figure 6A et les descriptions ci-dessous pour placer trois masques différents. Utilisez l’outil de la région pour placer un carré de 0,25 x 0,25 m au milieu d’au moins 400 cellules.
    3. Utilisez le bouton Région pour masquer pour créer un masque (masque 1) des carrés d’intérêt. Créez un nouveau masque vide (masque 2) et utilisez l’outil pixel ou l’outil polygone pour marquer l’ensemble de la zone cellulaire d’au moins 25 cellules aléatoires, qui seront utilisées pour calculer le blanchiment de fluorescence. Créez un nouveau masque vide (masque 3) et utilisez le grand outil de brosse pour marquer les zones entre les cellules, qui seront utilisées pour la soustraction de fond.
    4. Sous les statistiques de masque et la portée de masque,choisissez l’objet pour le masque 1 et masque 2. Ensuite, sous Les caractéristiques et l’intensité, choisissez l’intensité moyenne et exportez les données des deux masques. Pour le masque 3, exportez l’intensité moyenne de l’ensemble du masque.
    5. Calculer le changement d’intensité de fluorescence pour chaque objet dans le masque 1 à l’aide des formules suivantes :

Equation 1

Equation 2

où le masque 1 est un carré de 0,25 m à 0,25 m placé au centre cellulaire, le masque 2 couvre toute la cellule, le masque 3 est l’arrière-plan entre les cellules, t1 est l’intensité moyenne dans le premier point de temps, et t2 est l’intensité moyenne dans le deuxième point de temps.

5. Détection de la densité de masse sfGFP avec Cryo-ET

  1. Préparation des échantillons, collecte de données et reconstruction
    1. Cultivez une lourde parcelle de L. pneumophila exprimant une protéine Point/Icm étiquetée fluorescente sur des plaques CYE-agar-streptomycine pendant 48 heures à 37 oC. Résuspendez les cellules dans ddH2O à600 OD 0,7. Ajouter 5 L de particules d’or colloïdales (BSA Tracer, 10 nm) à 20 l de la suspension cellulaire.
    2. Pipette 5 L du mélange cellulaire sur le réseau de carbone troué fraîchement rougeoyé (R 2/1 sur le maillage Cu 200) et laisser reposer 1 min. Blot avec du papier filtre et congeler dans l’éthane liquide à l’aide d’un appareil de piston gravitationnel tel que décrit précédemment14,15.
    3. Imagez les spécimens hydratés congelés avec un microscope électronique de transmission de 300 kV équipé d’un pistolet à émission de champ, d’un filtre d’énergie, d’une plaque de phase Volta et d’un dispositif de détection directe. Recueillir des séries d’inclinaison à axe unique à 26 000x et 42 000x grossissements, qui se traduisent par des pixels de taille au niveau du spécimen de 5,4 euros/pixel ou 3,4 euros/pixel, respectivement.
    4. Utilisez le paquet tomographique SerialEM pour collecter des piles d’images à 0 m defocus, avec une gamme d’angles d’inclinaison entre -60 et 60 euros avec une augmentation de 3 degrés et une dose cumulative de 60 e-/2,16. Alignez les images de films fractionnées de dose dans chaque pile à l’aide de MotionCor217. Assembler les piles corrigées à la dérive à l’aide de TOMOAUTO14.
    5. Alignez les piles corrigées de la dérive par l’alignement IMOD dépendant des marqueurs18. Reconstruire les tomogrammes avec la méthode SIRT19 pour les segmentations et l’analyse directe de l’image et la méthode WBP20.
  2. Analyse de sous-tomogrammes des échantillons de fusions de sfGFP
    1. Utilisez le paquet tomographique I3 (0.9.9.3) pour l’analyse de sous-biogramme14,21,22.
      REMARQUE : L’alignement procède de façon itérative, à chaque itération composée de trois parties dans lesquelles des références et des masques de classification sont générés, des sous-biogrammes sont alignés et classifiés, et les moyennes de classe sont alignées les unes aux autres.
    2. Utilisez 4 x 4 x 4 sous-tomgrammes binned pour un alignement initial. Fusionner les particules qui appartiennent à des moyennes de classe et montrer la densité d’électrons correspondant à sfGFP. Après avoir trié des particules avec des fusions sfGFP, utilisez 2 sous-bigrammes binned 2 x 2 pour un alignement ciblé d’une région d’intérêt (comme le complexe ATPase cytoplasmique Dot/Icm) pour obtenir une structure haute résolution.

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Representative Results

La recombinaison homologue avec une double sélection en deux étapes a été utilisée pour construire l’insertion définie de sfGFP. Dans la première étape, l’accouplement triparental a été effectué, où le pRK600 plasmide conjugal (un plasmide IncP) de la souche d’aide E. coli MT616 a été mobilisé à la souche de donneur E. coli avec le vecteur suicide pSR47S contenant le gène SfGFP flanqué des deux régions homologues, l’origine du transfert oriT et le Bacillus subtilis contre-sacb. Ensuite, le système de conjugaison de pRK600 a aidé la mobilisation du dérivé pSR47S dans L. pneumophila (Lp01, Figure 2A). Les clones qui ont intégré avec succès le pSR47S par un seul événement de croisement ont été sélectionnés en raison du gène de résistance aux antibiotiques KanR et ont été propagés pour permettre un deuxième croisement. Les clones qui ont perdu le gène sacB lors du deuxième croisement ont été sélectionnés en placageant les cellules sur le saccharose de l’agent antiélectif (figure 2, figure 3). L’analyse d’immunoblot avec un anticorps anti-GFP (GFP) a été effectuée pour déterminer si le sfGFP a été clivé et pour évaluer la stabilité et le niveau d’expression de la protéine de fusion dans un type sauvage ou dans un mutant complet de suppression de point/icm. En outre, avant de procéder à la microscopie, l’intégration correcte du gène sfGFP dans le chromosome a été confirmée par PCR(figure 3). Une fois que la stabilité et l’intégration des fusions ont été confirmées, la microscopie fluorescente de cellules vivantes a été exécutée, et la spécificité du clone fluorescent de signal a été comparée à une souche parentale sfGFP-négative. De plus, la double imagerie utilisant la microscopie au champ lumineux ou en phase a été utilisée pour examiner la proportion de cellules qui possédaient un signal fluorescent spécifique(figure 4).

Seule une fraction des cellules qui ont produit DotB-sfGFP a montré la localisation polaire de la protéine de fusion(figure 5A). Pour caractériser la distribution du signal de fluorescence DotB, l’intensité de DotB-sfGFP le long de l’axe longitudinal dans ces cellules a été quantifiée. L’intensité du pointB aux poteaux était d’environ 2 fois plus élevée que dans le cytosol(figure 5B). Parce qu’il est important de déterminer si la localisation des protéines de fusion étiquetées fluorescentes a une pertinence biologique, nous avons demandé si la localisation polaire DotB-sfGFP dépendait d’un T4BSS entièrement assemblé. Par conséquent, des scores de polarité de DotB-sfGFP indiquant le rapport de fluorescence moyenne mesuré aux pôles par rapport à la fluorescence mesurée près du milieu de la cellule ont été déterminés pour des cellules individuelles dans un type sauvage et dans un mutant T4BSS(figure 5C-E). En effet, les suppressions de l’ensemble du système Dot/Icm ont abrogé le positionnement polaire de DotB-sfGFP, confirmant que la puncta polaire représente l’association de DotB avec le T4SS et l’importance de la machine Dot/Icm pour le recrutement de cet ATPase. Dans la plupart des cellules de L. pneumophila, DotB-sfGFP a également montré le mouvement cytosolique, indiquant qu’il est présent dans une population cytosolique dynamique mais qu’il est également capable de s’associer au complexe polar Dot/Icm. Pour quantifier les différences de mouvement dynamique entre les DOTO et dotB ATPases, deux images successives ont été acquises et des changements dans l’intensité de fluorescence ont été déterminés et comparés au sfGFP(figure 6A). Tandis que le sfGFP et dotO-sfGFP ont montré peu ou pas de modèles dynamiques, les changements d’intensité de DotB-sfGFP dans le cytosol ont été décalés et étaient sensiblement plus élevés. Ces observations indiquent que le DotB ATPase était présent dans une population cytosolique dynamique et qu’à un stade avancé, le DotB ATPase, dynamique spatialement dynamique, a été recruté au Dot/Icm T4SS(figure 6B).

Pour définir l’emplacement spatial de DotB par rapport à la machine Dot/Icm, cryo-ET à haut débit a été utilisé pour visualiser l’appareil T4BSS intact dans une souche L. pneumophila exprimant DotB-sfGFP. Tout d’abord, la reconstruction d’une cellule de L. pneumophila exprimant DotB-sfGFP a été effectuée et a révélé des complexes typiques en forme de cône multiple intégrés dans l’enveloppe cellulaire (figure 7A, B). Nous avons démontré précédemment en utilisant des expériences épistatiques avec une variété de mutants Dot/Icm, microscopie fluorescente, et cryo-ET que DotB est spatialement situé en dessous d’un assemblage unique de l’ATPase DotO10. La moyenne de subtomogramme de la souche exprimant DotB-sfGFP a déterminé le positionnement global de DotB par rapport à la machine T4BSS intacte. Cette analyse a révélé une densité supplémentaire corrélée avec la masse supplémentaire de sfGFP(figure 7C). Enfin, les rendus tridimensionnels de surface de l’ensemble du T4SS Dot/Icm indique que le sfGFP est placé sous l’hexamer DotB, qui s’assemble comme disque à la base du complexe cytoplasmique ATPase(figure 8)10.

Figure 1
Figure 1 : Rendus de surface tridimensionnels de L. pneumophila Dot/Icm T4SS. OM - membrane externe, IM - membrane intérieure, PG et peptidoglycan. L’image a été modifiée à partir de Chetrit D. et al.10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Aperçu schématique de la recombinaison homologue et de l’échange allélique utilisé pour insérer le sfGFP dans le chromosome de L. pneumophila. (A) l’accouplement triparental effectué entre une souche d’aide E. coli MT616 qui abrite le pRK600 plasmide conjugal (un plasmide IncP), une souche de donneur E. coli qui se transforme avec le vecteur de suicide pSR47S, et L. pneumophila en tant que receveur. (B) Modèle schématique représentant les étapes nécessaires pour insérer le sfGFP dans le chromosome L. pneumophila afin de générer des protéines de fusion sfGFP C-terminal. La sélection des mutants d’échange allélique a été accomplie en deux étapes, en utilisant la kanamycine et le contre-marqueur sélectionnable sacB. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Le flux de travail d’échange allélique d’essai. L. pneumophila a été rayé sur les sélections appropriées et les temps de croissance (voir la section du protocole pour plus de détails). Plus tard, l’insertion du sfGFP dans le chromosome a été confirmée avec le PCR de colonie utilisant des amorces complémentaires au gène de sfGFP et à la région chromosomique flanquant le site d’insertion. La stabilité de la protéine de fusion a été examinée par l’analyse d’immunoblot utilisant un anticorps anti-GFP. Panneaux en bas gauche: Lane 1 - untagged Lp01, Lane2 - sfGFP exprimé à partir de pointB operon, Lane 3 - DotB-sfGFP exprimé dans un parfait point / icm mutant de suppression, Lane 4 - DotB-sfGFP exprimé dans un fond de type sauvage. WB - tache occidentale. Le nombre de clones analysés à chaque étape est indiqué entre parenthèses. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Imagerie cellulaire vivante de L. pneumophila exprimant des sous-unités pointées fluorescentes dot/Icm. (A) L. pneumophila d’un patch lourd de deux jours a été résuspendé en ddH2O et placé sur le dessus de 1% de bas garnitures d’agarose fondante. (B) La spécificité du signal de fluorescence d’une souche qui code chromosomalement DotB-sfGFP a été comparée à la souche Lp01 GFP-négative parentale. Barre d’échelle de 3 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Quantification de la localisation polaire des sous-unités du système Dot/Icm. (A) La visualisation en temps réel de DotB-sfGFP exprimée dans Lp01 a montré la localisation polaire. DotB-sfGFP a montré un motif diffus lorsqu’il est exprimé dans une souche où l’ensemble du faisceau de gènes point/icm a été supprimé(T4SS). Le sfGFP non fusionné exprimé de l’opéon de pointB a montré un modèle cytosolique diffus et a servi de contrôle. Barre d’échelle de 3 m. (B) Quantification de l’intensité de fluorescence DotB-sfGFP le long de l’axe longitudinal des cellules aux motifs polaires ou diffus. Les tailles d’échantillons étaient n 20 cellules pour les cellules polaires et non polaires. p 0,02,p 0,0001. L’importance a été calculée par le t-test de l’étudiant à deux queues et comparée à l’intensité au poteau. (C) Modèle schématique des masques utilisés pour quantifier la polarité. (D) DotB-sfGFP comme indiqué dans la figure 5A avec les masques utilisés pour quantifier la polarité. (E) L’abondance de DotB-sfGFP aux pôles, quand il est exprimé dans un fond sauvage de type ou quand l’ensemble de l’amas de gène point/icm a été supprimé, est affiché sous forme de courbes de fréquence. Les tailles d’échantillons étaient de n 200 cellules pour chaque souche. p et lt; 0,0001. L’importance a été calculée par le test de Mann Whitney à deux queues et comparée au sfGFP exprimé de l’opéon pointB. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Quantification de la dynamique des fusions fluorescentes Dot/Icm. (A) Un modèle schématique représentant les masques utilisés pour quantifier les changements dans l’intensité de fluorescence pour une protéine de fusion sfGFP dynamique ou statique. T1,2 sont le temps des premier et deuxième points de temps et m1,2,3 sont masque 1, masque 2, et masque 3. (B) La dynamique de DotB-sfGFP, DotO-sfGFP, et sfGFP exprimée à partir de l’opéon pointB sont affichés sous forme de courbes de fréquence. Les tailles d’échantillons étaient n 400 cellules pour chaque souche. p 3,4 à 10-12,p 1,0 à 10-147. L’importance a été calculée par le t-test de l’étudiant à deux queues par rapport au sfGFP. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : La moyenne du sous-tomogramme est utilisée pour déterminer la densité de fpS de DotB-sfGFP. (A) Une tranche tomographique acquise avec un grossissement de 26 000x provenant d’une cellule représentative de L. pneumophila exprimant DotB-sfGFP, montrant plusieurs machines Dot/Icm intégrées dans l’enveloppe cellulaire. (B) Une tranche tomographique acquise avec un grossissement de 42 000x du même pôle cellulaire L. pneumophila montré dans A. OM - membrane externe, IM et membrane intérieure. (C) Une reconstruction d’une souche exprimant DotB-sfGFP montre des densités correspondant à DotB et sfGFP (flèches jaunes). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Rendus de surface tridimensionnels du complexe cytosolique Dot/Icm. Rendus de surface tridimensionnels de l’ensemble du Dot-Icm T4SS dedotB (A), type sauvage (B), et dotB-gfp (C) L. pneumophila souches. (D) La structure du complexe cytosolique montre le positionnement de DotB (violet) et sfGFP (vert). La structure aux rayons X de DotB (PDB: 6GEB23) a été amarré à la carte DotB. IM et membrane intérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L’élucidation des fonctions des systèmes de sécrétion bactérienne est la clé d’une compréhension complète des interactions hôte-pathogène. Les systèmes de sécrétion sont des machines complexes qui peuvent injecter des protéines effecteurs dans les cellules hôtes, et dans certains cas promouvoir l’établissement d’une niche subcellulaire qui soutient la réplication bactérienne. La méthode ci-dessus fournit de nouveaux outils importants pour étudier le système de sécrétion Dot/Icm de l’agent pathogène bactérien respiratoire Legionella pneumophila, donnant des indices aux mécanismes de translocation effecteur qui sont essentiels à sa pathogénétique. Cette approche peut être appliquée à d’autres systèmes de sécrétion en utilisant l’imagerie bactérienne vivante et des études structurelles pour disséquer leur activité au niveau moléculaire. Ceci peut être accompli en étudiant la dynamique spatiotemporal des composants fluorescents de système de sécrétion à l’aide de la microscopie vidéo en time-lapse.

Nous avons construit des mutations propres et non marquées, où un gène a été étiqueté ou remplacé par un allèle modifié, qui est une approche fondamentale pour la compréhension de la pathogénétique au niveau moléculaire ainsi que pour la définition des relations structure-fonction qui peuvent conduire à la production de pharmacothérapies24,25. Les souches de L. pneumophila qui ont été génétiquement modifiées pour éliminer les protéines individuelles dot et Icm peuvent être utilisées pour déterminer la structure du système Dot/Icm par cryo-ET. Une étape importante dans le protocole est de comparer la fonctionnalité des protéines N-terminus et C-terminus marqués. Par conséquent, les souches codant les fusions devraient être testées pour la réplication dans les cellules hôtes eucaryote, visualisées par microscopie pour déterminer si la localisation des protéines étiquetées dans la cellule bactérienne dépend d’une machine de sécrétion entièrement assemblée, et évaluée pour la stabilité des protéines exprimées à partir des gènes en amont et en aval.

Ce protocole utilise des expériences de microscopie cellulaire vivante, qui sont largement utilisées pour étudier des processus biologiques complexes tels que la transduction du signal, l’auto-assemblage, le trafic actif et la régulation des gènes. Comprendre la dynamique, les trajectoires et les interactions des particules uniques dans les cellules représente une approche fondamentale dans la biologie cellulaire26. Cependant, étant donné que le suivi des particules simples peut ne pas toujours être possible en raison du mouvement moléculaire rapide ou d’un faible rapport signal-bruit, l’évaluation des changements dans l’intensité de la fluorescence peut servir d’approche simple pour quantifier les différences dans les modèles de dynamique. De plus, comme seulement deux points de temps sont nécessaires pour l’analyse, cette méthodologie ne garantit qu’une exposition minimale de l’échantillon à la lumière fluorescente et empêche ainsi le blanchiment majeur de l’intensité de fluorescence du fpSF. Étant donné que les tampons d’agarose ne contiennent aucune source d’éléments nutritifs, il est important de noter que l’imagerie vivante doit être effectuée immédiatement après avoir pris les cellules des plaques d’agar CYE. Si de plus longues périodes de temps d’imagerie sont nécessaires, des suppléments qui soutiennent la survie et la croissance de L. pneumophila devraient être ajoutés aux tampons. La détermination de la polarité des protéines étiquetées fluorescentes peut également être modifiée pour les applications à haut débit. Si cela est nécessaire, un objectif de phase et une configuration de condensateur appropriée doivent être utilisés pour acquérir des images à deux canaux (c.-à-d. des canaux de phase et fluorescents). Il est crucial de choisir des champs où les bactéries sont entièrement séparées. Utilisez le canal de phase pour masquer des cellules entières et quantifier le rapport d’intensité tel que décrit ci-dessus.

La microscopie cryo-électronique (cryo-EM) et le cryo-ET offrent une visualisation robuste des nanoparticules. Ces techniques impliquent l’imagerie de l’échantillon dans un état hydraté congelé, permettant la visualisation des nanoparticules essentiellement comme ils existent dans leur environnement cellulaire27. Parce que la résolution est limitée par l’épaisseur de l’échantillon, les structures obtenues par cryo-ET ont une résolution inférieure à celles qui sont obtenues par cryo-EM. Néanmoins, parce que dans chaque image tomogram type IV machineries sont présents dans plusieurs copies, une résolution accrue peut être obtenue en augmentant la taille de l’échantillon pour la moyenne de sous-tomogrammes. Un avantage majeur de cryo-ET est que la visualisation d’assemblages complexes dans des cellules bactériennes intactes peut mieux préserver leur structure, qui peut subir des changements drastiques lors de l’extraction de leur environnement naturel.

En conclusion, l’étude des processus dynamiques et la localisation des molécules sont parmi les premières étapes vers la compréhension de la fonction des systèmes biologiques. La force et l’orientation de la méthode décrite ici est la visualisation directe des composants Dot/Icm chez les bactéries vivantes, ce qui offre la possibilité de découvrir des processus dynamiques régissant les fonctions des machines IVB de type ou d’autres assemblages multiprotéins. En outre, le couplage de l’imagerie en direct à cryo-ET est une stratégie qui permet la caractérisation des composants clés de la machine Dot/Icm par rapport à la plus grande structure du système de sécrétion de pneumophila Legionella, et la compréhension de la façon dont ils assemblent et directement les changements conformationnels dans l’appareil. Une limitation des étiquettes de protéines fluorescentes utilisées pour étudier le comportement protéique dans les cellules vivantes est leur taille relativement grande, qui pourrait influencer la fonction et les propriétés de la protéine étiquetée. Par la suite, l’évaluation de la stabilité et de la fonctionnalité est nécessaire. Une autre limite de cette approche est que les structures atomiques ne peuvent actuellement être obtenues en raison de la résolution limitée résultant de l’épaisseur de l’échantillon. La modélisation et l’ajustement peuvent être un moyen efficace d’analyser les densités, permettant ainsi la localisation des sous-unités ou l’évaluation des changements conformationnels. Les enquêtes futures et la perfection de cette approche permettront de mieux comprendre comment les différents sous-ensembles constituent un appareil fonctionnel de type IV.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

D.C. et C.R.R. ont été soutenus par les NIH (R37AI041699 et R21AI130671). D.P., B.H., et J.L. ont été soutenus par les National Institutes of Health (R01AI087946 et R01GM107629).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 nm colloidal gold particles Aurion 25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA) Nikon
ACES Sigma-Aldrich A9758
Activated charcoal Sigma-Aldrich C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt American bioanalytical AB00981
Bacto dehydrated agar BD 214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera Photometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL Fisher Scientific AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh Quantifoil Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 216828
K2 Summit camera for cryo-EM GATAN
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352
Microscope cover slides 22x22 mm Fisher Scientific 12-542B
Microscope cover slides 24x50 mm Fisher Scientific 12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm Globe Scientific 1380
SlideBook 6.0 Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine Lumencor
Taq 2X Master Mix New England BioLabs M0270
Titan Krios Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract BD 212750

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References

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Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu, J., Roy, C. R. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (157), e60693, doi:10.3791/60693 (2020).

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