Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bruke Live Cell Imaging og Cryo-Electron Tomography for å løse spatiotemporal funksjoner av Legionella pneumophila Dot / Icm Sekresjon System

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60693
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,2, 1
1Department of Microbial Pathogenesis, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University School of Medicine, 2Microbial Sciences Institute, Yale University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Avbildning av bakterielle celler er en voksende systembiologi tilnærming fokusert på å definere statiske og dynamiske prosesser som dikterer funksjonen til store makromolekylære maskiner. Her brukes integrering av kvantitativ levende celleavbildning og kryoelektrontomografi til å studere Legionella pneumophila type IV sekresjonssystemarkitektur og funksjoner.

Abstract

Dot / Icm sekresjonssystemet legionella pneumophila er en kompleks type IV sekresjonssystem (T4SS) nanomaskin som lokaliserer på bakteriepolen og medierer levering av protein- og DNA-substrater for å målrette celler, en prosess som vanligvis krever direkte celle-til-celle-kontakt. Vi har nylig løst strukturen til Dot / Icm-apparatet ved kryoelektrontomografi (cryo-ET) og viste at den danner en cellekonvoluttskkende kanal som kobles til et cytoplasmatisk kompleks. Bruk av to komplementære tilnærminger som bevarer den opprinnelige strukturen i prøven, fluorescerende mikroskopi i levende celler og cryo-ET, tillater in situ visualisering av proteiner og assimilering av stoichiometry og tidspunktet for produksjonen av hver maskinkomponent i forhold til andre Dot / Icm underenheter. For å undersøke kravene til polar posisjonering og karakterisere dynamiske funksjoner forbundet med T4SS-maskinbiogenese, har vi smeltet sammen et genkoding av supermappe grønt fluorescerende protein til Dot/Icm ATPase-gener i sine opprinnelige posisjoner på kromosomet. Følgende metode integrerer kvantitativ fluorescensmikroskopi av levende celler og cryo-ET for å kvantifisere polar lokalisering, dynamikk og struktur av disse proteinene i intakte bakterielle celler. Bruk av disse tilnærmingene for å studere Legionella pneumophila T4SS er nyttig for å karakterisere funksjonen til Dot / Icm-systemet og kan tilpasses for å studere et bredt utvalg av bakterielle patogener som bruker T4SS eller andre typer bakteriellsekresjonskomplekser.

Introduction

Legionella pneumophila (L. pneumophila), etiologisk middel for Legionærsykdom, bor i ferskvannsreservoarer, hvor bakteriene forplanter seg ved å infisere og replikere i akvatiske frittsvømmende protozoer. L. pneumofila forårsaker sykdomsutbrudd hos mennesker når innånding av aerosoliserte bakterier fra drikkevannskilder oppstår. I infiserte celler gjør undergraving av vertsveier L. pneumofila å forsinke endocytisk modning av vacuole der den befinner seg og for å fremme biogenesis av et cellulært rom som støtter bakteriell replikering. Denne prosessen er drevet av en spesialisert bakteriell type IVB sekresjon system (T4BSS) kjent som Dot / Icm og dens repertoar av over 300 "effector" proteiner som er translocated til verten cytosol under infeksjon for å lette manipulering av cellulære funksjoner1,2,3,4,5. Mutanter som mangler et funksjonelt Dot / Icm-apparat ikke klarer å levere effektorer inn i vertencytosol, er defekte for intracellulær replikering, og er avirulent i dyremodeller av sykdom6,7.

Mange bakterielle arter har utviklet ekstremt komplekse og dynamiske multikomponentmaskiner som kreves for infeksjonsprosesser. Andre T4BSS som Dot / Icm systemet er også avgjørende for intracellulær replikering av bakterielle patogener som Coxiella burnetii og Rickettsiella grylli. Selv om T4BSS er evolusjonært relatert til prototypiske type IVA-systemer, som medierer DNA-overføring og kan levere et begrenset repertoar av effektorproteiner, har Dot / Icm-systemet nesten dobbelt så mange maskinkomponenter og leverer et bredt utvalg av effektorer. Formodentlig har denne utvidelsen i antall komponenter gjort det mulig for Dot/Icm-apparatet å imøtekomme og integrere nye effektorer enkelt8,9.

Vi brukte nylig kryoelektrontomografi (cryo-ET) for å løse strukturen til Dot/Icm-apparatet in situ og viste at den danner en cellekonvoluttskkende kanal som kobles til et cytoplasmatisk kompleks. Videre analyse viste at den cytosolic ATPase DotB forbinder med Dot / Icm systemet på L. pneumophila cellepol gjennom interaksjoner med cytosolic ATPase DotO. Vi har oppdaget at DotB viser en cytosolic bevegelse i de fleste bakterielle celler, noe som indikerer at denne ATPase er til stede i en dynamisk cytosolic populasjon, men også forbinder med polardot / Icm komplekser. I tillegg danner DotO en hexameric montering av DotO-dimers forbundet med det indre membrankomplekset, og en DotB-hexamer slutter seg til bunnen av dette cytoplasmatiske komplekset. Monteringen av DotB-DotO energikompleks skaper en cytoplasmatisk kanal som styrer translokasjonen av underlag gjennom T4SS (Figur 1)10.

Til tross for disse siste fremskrittene, er lite kjent om hvordan Dot / Icm-systemet fungerer og hvordan hvert protein monteres for å danne et aktivt apparat8. Avdekke regulatoriske kretser av Dot / Icm T4SS er grunnleggende for å forstå de molekylære mekanismene for vertspatogen interaksjoner. Derfor diskuterer vi hvordan du bruker levende cellemikroskopi og cryo-ET for å oppdage og karakterisere essensielle L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter som er merket med super-mappe GFP (sfGFP). Ved hjelp av kvantitativ fluorescensmikroskopi vil polarlokaliseringen av DotB defineres i en vill typebakgrunn eller når type IV-systemet slettes. Tidsforløpmikroskopi vil bli brukt til å kvantifisere forskjeller i lokalisering og dynamikk mellom Dot / Icm cytosolic ATPases.

Den kombinerte anvendelsen av to komplementære tilnærminger som live imaging og cryo-ET gir en fordel i forhold til andre in vitro systemer. Begge metodene utføres i intakte celler og bevare det naturlige miljøet i T4BSS, og dermed minimere avbrudd av den opprinnelige strukturen under prøveforberedelse. Fordi overuttrykk av proteiner kan svekke stoichiometry av sekresjonsapparatet, returneres sfGFP-fusjoner via allelisk utveksling til Legionella-kromosomet slik at hver fusjon er kodet i enkelt kopi og uttrykket drives av den endogene arrangøren. Visualisering av kromosomalt kodet fusjoner gjør det mulig å kvantifisere det nøyaktige proteinnivået som uttrykkes på et definert tidspunkt. Cryo-ET har også mange fordeler for å bestemme strukturen av sekresjonssystemer. Den mest bemerkelsesverdige fordelen er at kryo-ET prøver består av frosne intakte celler som bevarer innfødte komplekser i sammenheng med bakteriell cellearkitektur. Derfor kan cryo-ET være å foretrekke fremfor biokjemiske rensemetoder, som trekker ut membrankomplekser og kan fjerne perifere proteiner fra kjerneapparatet eller endre den generelle strukturen. I tillegg, tagging et protein av interesse med en klumpete protein som sfGFP legger en masse som er påviselig av cryo-ET og kan bistå med å kartlegge de ulike subkomplekser av Dot / Icm apparatet på strukturen oppnådd av cryo-ET.

Denne tilnærmingen er et kraftig verktøy for å avdekke strukturell informasjon om multimolekylære komplekser som monteres i bakteriecellemembranen. Tolkningen av strukturer som er belyst ved hjelp av disse teknikkene, vil hjelpe feltet med å forstå hvordan T4BSS-komponenter fungerer, hvorfor så mange komponenter er nødvendige for funksjon, hvordan komponentene samhandler innenfor det større komplekse, og hvilke funksjoner disse subassemblies utføre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer som involverer vekst, manipulering og bildebehandling av L. pneumofila bør utføres i et biologisk sikkerhetsnivå 2-laboratorium i samsvar med lokale retningslinjer.

1. Innsetting av sfGFP i L. pneumophila kromosom ved hjelp av allelic Exchange og Double Selection Strategy (Figur 2, Figur 3)

  1. Klone inn i generstatningsvektoren pSR47S11 følgende sekvens: 1000 bp oppstrøms av interessestedet, deretter sfGFP-sekvensen, deretter 1000 bp nedstrøms av interessestedet (Figur 2). SfGFP-sekvensen skal plasseres i rammen til N-terminus eller C-terminus slutter med en linker som inneholder fire til åtte aminosyrer. Forvandle den resulterende vektoren til E. coli DH5αλpir. Senere, strek L. pneumophila (mottakeren) for enkeltkolonier på kull-gjær ekstrakt (CYE) agar12 som inneholder 100 μg/ml streptomycin og vokse i 5 dager ved 37 °C (Figur 3).
  2. Strek L. pneumophila på CYE-agar-streptomycin og vokse i 2 dager ved 37 °C (tung lapp)10. Streak E. coli DH5α forvandlet med pRK600 hjelper plasmid (hjelper)13 på LB agar som inneholder 25 μg/ ml klorampenkol. Strek E. coli DH5αλpir (donor) på LB agar som inneholder 50 μg/ml kanamycin.
  3. Utfør triparental parring: inkuber en koloni av hjelperen, en koloni av donor, og mottakeren ved å overlegge flekker av de tre stammene på en CYE agar plate uten valg og inkubere for 4-8 timer ved 37 °C. Som negative kontroller inkuberer en hjelper + mottaker stamme blanding og en donor + mottaker belastning blanding for samme perioder.
  4. Resuspender parringsreaksjonene i 500 μL ddH2O. Plate 20 μL og 50 μL av reaksjonene på CYE agar som inneholder 100 μg/ml streptomycin og 10 μg/ml kanamycin og vokser i 5 dager ved 37 °C. Strek fire av de resulterende klonene på CYE agar som inneholder 100 μg/ml streptomycin og vokser i 5 dager ved 37 °C.
  5. Strek 16 kloner på CYE agar som inneholder 5% sukrose og 100 μg/ml streptomycin og vokser i 5 dager ved 37 °C. Deretter kan 32 av disse klonene på CYE agar som inneholder 100 μg/ml streptomycin og cye agar som inneholder 100 μg/ml streptomycin og 10 μg/ml kanamycin og vokser i 5 dager ved 37 °C.

2. Isolering av kloner som integrert sfGFP i L. pneumophila kromosom

  1. Strekkloner som var følsomme for kanamycin på CYE-agar-streptomycin plater og bekrefte innsetting av sfGFP i kromosomet med koloni PCR. Bruk primere som er komplementære til sfGFP genet og til kromosomområdet av interesse for å forsterke innsettingskrysset.
    1. Bland 0,5 μL av hver av de 10 μM primere løsningene og en koloni til et endelig volum på 12,5 μL og denature i 10 min ved 95 °C. Avkjøl på is i 10 min, tilsett 12,5 μL av 2x PCR master mix løsning, og utføre en PCR analyse.
  2. Dyrke tunge flekker av de isolerte koloniene på CYE-agar-streptomycin plater i 2 dager ved 37 °C. Undersøk uttrykksnivåene og stabiliteten til sfGFP-fusjonene ved å immunblotting med et anti-GFP-antistoff.

3. Live Cell Imaging av L. pneumophila med fluorescerende merket dot / icm komponenter

  1. Utarbeidelse av agarose pads
    1. Lag ca 30 ml av en 1% lavsmelteagaroseløsning i vann. Mikrobølgeovn i en glasskolbe i ca 90 s, virvlende av og til, til agarose er helt oppløst.
    2. Plasser to 22 x 22 x 0,15 mm3 glasssklier på kanten av et 25 x 75 x 1,1 mm3 glasslysbilde, en oppå den andre. Stable to mer 22 x 22 x 0,15 mm3 glass lysbilder på den andre kanten.
    3. Pipette ca 1 ml av smeltet agarose inn i sentrum lysbildet mellom de to øvre glass lysbilder, deretter plassere en annen 25 x 75 x 1,1 mm3 lysbilde på toppen av smeltet agarose. Prøv å unngå dannelse av luftbobler. Avkjøl skliene ved 4 °C i 15 min.
    4. Bruk en skalpell eller barberblad, forsiktig kutte puten i små firkanter, ~ 5 x 5 mm2. Fest et dobbeltsidig klebemiddel 17 x 28 x 0,25 mm3 på et 25 x 75 x 1,1 mm3 glasslysbilde og plasser flere pads på lysbildet.
  2. Bildeoppkjøp
    MERK: Følgende trinn er beskrevet for et mikroskop som er under kontroll av SlideBook 6.0 og utstyrt med solid state-belysning, CCD-monokromkamera og et målobjektiv på 100 x (1,4 numerisk blenderåpning). Bruk eventuelt alternative mikroskopienheter med passende maskinvare- og programvarekonfigurasjoner som kan tilpasses i henhold til protokollinnstillingene.
    1. Oppløs en tung flekk av L. pneumophila i 1 ml ddH2O, vortex og rør 2–3 μL av fortynningen på putene. Plasser en 50 x 24 x 0,15 mm3 dekselslip forsiktig over klebemiddelrammen.
    2. Juster ND til 180 i opptaksvinduet. Juster binning til 2 × 2 og bruk 488 nm kanal for å utsette prøven mellom 500-1000 ms. Valider spesifisiteten av fluorescenssignalet ved å bildeutagged L. pneumophila med de samme parametrene (Figur 4).

4. Kvantifisering av polarlokalisering og dynamikk av dot/ Icm komponenter

MERK: Følgende trinn er utformet for bilder med 0,129 μm per piksel som ble anskaffet med 2 x 2 binning.

  1. Kvantifisering av polaritet for sfGFP fusjonsproteiner (Figur 5)
    1. Juster bildekontrasten slik at bakteriene er godt synlige. Bruk regionverktøyet til å plassere et rektangel på 0,25 x 1,3 μmsom starter på stangen og strekker seg inn i cytoplasma. Rektangelet må forbli nøyaktig innenfor bakteriegrensene.
    2. Merk minst 200 bakterier og bruk Region til maske-knappen for å lage masker til regionene av interesse. Velg Objekt under Maskestatistikk og maskeomfang. Deretter, under Funksjoner og intensitet, markerer gjennomsnittlig intensitet og varians.
    3. Eksporter dataene og beregn polaritetspoengene for hver bakterie som forholdet mellom variansen til gjennomsnittlig intensitet.
    4. For bruksområder med høy gjennomstrømning bruker du et fasemål og et passende kondensatoroppsett for å skaffe bilder med fase- og 488 NM-kanaler. Sørg for å velge synsfelt der bakteriene er helt separert.
    5. Juster fasekanalkontrasten på bildet til et nivå der bakteriene er tydelig synlige. Åpne det tokanalsbildet, start vinduet Opprett segmentmaske og endre kanalen til fase.
    6. Juster en passende terskel og fjern små objekter med Definer objekter-knappen. Under Avgrensemaske velger du Fjern kanter objekter og senere separate masker av bakterier som ligger ved siden av hverandre.
    7. Beregn polaritetspoengene til signalet i 488-kanalen for hver celle som tidligere ble beskrevet i trinn 4.1.2-4.1.3.
  2. Kvantifisering av dynamikk for sfGFP fusjonproteiner (Figur 6)
    MERK: Følg instruksjonene i avsnitt 3 for å klargjøre et eksempel for bildeinnhenting. Dynamics defineres som intensitetsendringer over tid, og følgende trinn er utformet for korte bildeperioder (dvs. flere minutter). Legg til puten de riktige kosttilskuddene hvis lengre bildeperioder er ønsket.
    1. Merk Timelapsei Vinduet Bilderegistrering , angi intervalltidspunktet i intervallboksen, og skriv inn 2 i Boksen # med tidspoeng. Få to påfølgende bilder av L. pneumophila som uttrykker fluorescerende protein av interesse.
    2. Juster bildekontrasten til cellene er tydelig synlige. Følg figur 6A og beskrivelsene nedenfor for å plassere tre forskjellige masker. Bruk regionverktøyet til å plassere en 0,25 x 0,25 μm kvadrat i midten av minst 400 celler.
    3. Bruk Knappen Region til maske til å opprette en maske (maske 1) av kvadratene av interesse. Opprett en ny tom maske (maske 2) og bruk pikselverktøyet eller polygoneverktøyet til å markere hele celleområdet på minst 25 tilfeldige celler, som vil bli brukt til å beregne fluorescensbleking. Opprett en ny tom maske (maske 3) og bruk det store børsteverktøyet til å markere områder mellom cellene, som skal brukes til bakgrunnssubtraksjon.
    4. Velg Objekt for maske 1 og maske 2 under Maskestatistikk og maskeomfang. Deretter velger du Gjennomsnittlig intensitet under Funksjoner og intensitetog eksporterer dataene til de to maskene. For maske 3, eksporter den gjennomsnittlige intensiteten av hele masken.
    5. Beregn endringen i fluorescensintensitet for hvert objekt i maske 1 ved hjelp av følgende formler:

Equation 1

Equation 2

der maske 1 er en 0,25 μm × 0,25 μm kvadrat plassert på cellesenteret, maske 2 dekker hele cellen, maske 3 er bakgrunnen mellom cellene, t1 er gjennomsnittlig intensitet i første gang, og t2 er gjennomsnittlig intensitet i andre tidspunkt.

5. Påvisning av sfGFP-massetetthet med Cryo-ET

  1. Prøveklargjøring, datainnsamling og rekonstruksjon
    1. Vokse en tung av L. pneumophila uttrykker en fluorescerende merket Dot / Icm protein på CYE-agar-streptomycin plater i 48 timer ved 37 °C. Resuspender cellene i ddH2O til OD600 ~ 0,7. Tilsett 5 μL kolloidale gullpartikler (BSA Tracer, 10 nm) til 20 μL av cellesuspensjonen.
    2. Pipette 5 μL av celleblandingen på ferskt glødeladet hullholdig karbonnett (R 2/1 på Cu 200 mesh) og la stå i 1 min. Blot med filterpapir og fryse i flytende etan ved hjelp av et gravitasjonsdrevet stempelapparat som beskrevet tidligere14,15.
    3. Bilde de frosne-hydrerte prøvene med et 300 kV-transmisjonselektronmikroskop utstyrt med feltutslippspistol, et energifilter, Volta faseplate og en direkte deteksjonsenhet. Samle enakse tilt-serien på henholdsvis 26 000 x og 42 000 x forstørrelser, noe som resulterer i pikselstørrelser på prøvenivå på henholdsvis 5,4 Å/piksel eller 3,4 Å/piksel.
    4. Bruk tomografisk pakke SerialEM til å samle bildestabler ved ~0 μm defokus, med en rekke vippevinkler mellom -60° og +60° med 3° trinnøkning og akkumulert dose på ~60 e-/Å2,16. Juster filmbilder med dosefraksjonert i hver stabel ved hjelp av MotionCor217. Monter driftkorrigerte stabler ved hjelp av TOMOAUTO14.
    5. Juster driftkorrigerte stabler etter IMOD-markøravhengig justering18. Rekonstruere tomogrammer med SIRT-metoden19 for segmenteringer og direkte bildeanalyse og WBP-metoden20.
  2. Subtomogramanalyse av sfGFP-fusjonsprøver
    1. Bruk den tomografiske pakken I3 (0.9.9.3) for subtomogramanalyse14,21,22.
      MERK: Justeringen fortsetter iterativt, med hver iterasjon bestående av tre deler der referanser og klassifiseringmasker genereres, subtomogrammer er justert og klassifisert, og klassegjennomsnitt er justert til hverandre.
    2. Bruk 4 x 4 x 4 binned subtomogrammer for en innledende justering. Slå sammen partikler som tilhører klassegjennomsnitt og viser elektrontetthet som tilsvarer sfGFP. Etter sortering av partikler med sfGFP-fusjoner, bruk 2 x 2 x 2 binned subtomogrammer for en fokusert justering av en interesseregion (som Dot/Icm cytoplasmatisk ATPase-kompleks) for å oppnå en høyoppløsningsstruktur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Homolog rekombinasjon med dobbeltvalg i to trinn ble brukt til å konstruere den definerte innsettingen av sfGFP. I det første trinnet ble triparental parring utført, hvor pRK600 konjugativ plasmid (en IncP plasmid) fra E. coli helper stamme MT616 ble mobilisert til donor E. coli belastning med selvmordvektor pSR47S som inneholder sfGFP genet flankert av de to homologe regioner, opprinnelsen til overføring oriT og Bacillus til subis counterselection gene sacB. Deretter konjugeringssystemet fra pRK600 assistert mobilisering av pSR47S derivat til L. pneumophila (Lp01, Figur 2A). Kloner som vellykket integrert pSR47S av en enkelt crossover hendelse ble valgt på grunn av antibiotikaresistens genet KanR og ble spredt for å tillate en andre crossover. Kloner som mistet sacB genet under den andre crossover ble valgt ved plating cellene på counterselective agent sukrose (Figur 2, Figur 3). Immunoblot analyse med en anti-GFP antistoff (α-GFP) ble utført for å avgjøre om sfGFP ble spaltet og for å vurdere stabilitetog uttrykk nivå av fusjonsprotein i en vill type eller i en komplett prikk / icm sletting mutant. I tillegg, før du går videre til mikroskopi, ble riktig integrering av SFGFP-genet i kromosomet bekreftet av PCR (Figur 3). Når stabilitet og integrering av fusjonene ble bekreftet, ble levende cellefluorescerende mikroskopi utført, og spesifisitet av fluorescerende signalklone ble sammenlignet med en foreldres sfGFP-negativ belastning. I tillegg ble dobbel bildebehandling ved hjelp av lysfelt eller fasemikroskopi brukt til å undersøke andelen celler som hadde et bestemt fluorescerende signal (Figur 4).

Bare en brøkdel av cellene som produserte DotB-sfGFP viste polar lokalisering av fusjonsproteinet (Figur 5A). For å karakterisere fordelingen av DotB fluorescenssignal, ble intensiteten av DotB-sfGFP langs langsgående akse i disse cellene kvantifisert. DotB intensitet på polene var ca 2x høyere enn i cytosol (Figur 5B). Fordi det er viktig å avgjøre om lokaliseringen av fluorescerende merkede fusjonsproteiner har biologisk relevans, spurte vi om DotB-sfGFP polar lokalisering var avhengig av en ferdig montert T4BSS. Polaritetsscorene til DotB-sfGFP som indikerer forholdet mellom gjennomsnittlig fluorescens målt ved polene sammenlignet med fluorescens målt nær midten av cellen, ble derfor bestemt for individuelle celler i vill type og i en T4BSS-mutant (figur 5C–E). Faktisk, slettinger av hele Dot / Icm systemet opphevet polar posisjonering av DotB-sfGFP, bekrefter at polar puncta representerer foreningen av DotB med T4SS og viktigheten av Dot / Icm maskin for rekruttering av denne ATPase. I de fleste L. pneumophila celler, DotB-sfGFP også vist cytosolic bevegelse, noe som indikerer at det er til stede i en dynamisk cytosolic populasjon, men er også i stand til å knytte seg til polar Dot / Icm kompleks. For å kvantifisere forskjeller i dynamisk bevegelse mellom DotO og DotB ATPases, ble to påfølgende bilder anskaffet og endringer i fluorescensintensiteten ble bestemt og sammenlignet med sfGFP (figur 6A). Mens sfGFP og DotO-sfGFP viste lite eller ingen dynamiske mønstre, ble DotB-sfGFP intensitetsendringer i cytosolforskjøvet og var betydelig høyere. Disse observasjonene indikerer at DotB ATPase var tilstede i en dynamisk cytosolsk populasjon, og ved en sen monteringsreaksjon ble den romlig dynamiske DotB ATPase rekruttert til den polarlokaliserte Dot/Icm T4SS (figur 6B).

For å definere den romlige plasseringen av DotB i forhold til Dot / Icm-maskinen, ble høy gjennomstrømning cryo-ET brukt til å visualisere det intakte T4BSS-apparatet i en L. pneumofilastamme som uttrykker DotB-sfGFP. Først ble rekonstruksjon av en L. pneumofilacelle som uttrykker DotB-sfGFP utført og avslørt typiske flere kjegleformede komplekser innebygd i cellekonvolutten (Figur 7A, B). Vi demonstrerte tidligere ved hjelp av epistatiske eksperimenter med en rekke Dot / Icm mutanter, fluorescerende mikroskopi og cryo-ET at DotB er romlig plassert under en unik montering av ATPase DotO10. Subtomogram i snitt av belastningen som uttrykker DotB-sfGFP fastslått den totale plasseringen av DotB i forhold til den intakte T4BSS-maskinen. Denne analysen viste en ekstra tetthet korrelert med den ekstra massen av sfGFP (Figur 7C). Til slutt indikerer tredimensjonale overflategjengivelser av hele Dot/Icm T4SS at sfGFP er plassert under DotB-hexameren, som monteres som en plate ved foten av det cytoplasmatiske ATPase-komplekset (Figur 8)10.

Figure 1
Figur 1: Tredimensjonale overflategjengivelser av L. pneumophila Dot/Icm T4SS. OM = ytre membran, IM = indre membran, PG = peptidoglykan. Bildet ble endret fra Chetrit D. et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oversikt over homolog rekombinasjon og allelsyreutveksling som brukes til å sette sfGFP inn i L. pneumofilkromosom. (A) Triparental parring utført mellom en E. coli MT616 hjelper stamme som havner konjugativ plasmid pRK600 (en IncP plasmid), en donor E. coli stamme som er forvandlet med selvmord vektor pSR47S, og L. pneumophila som mottaker. (B) Skjematisk modell som viser trinnene som kreves for å sette sfGFP inn i L. pneumophila kromosom for å generere C-terminal sfGFP fusjonproteiner. Valg av alleliske utvekslingmutanter ble oppnådd i to trinn, ved hjelp av kanamycin og telleren valgbar markør sacB. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Arbeidsflyten for allelisk utvekslingsanalyse. L. pneumophila ble stripete på de riktige valg og veksttider (se protokollseksjonen for detaljer). Senere ble innsetting av sfGFP i kromosomet bekreftet med koloni-PCR ved hjelp av primere komplementære til sfGFP-genet og til kromosomområdet som flankerer innsettingsstedet. Stabiliteten til fusjonsproteinet ble undersøkt ved immunoblotanalyse ved hjelp av et anti-GFP-antistoff. Nederste venstre paneler: Lane 1 = untagged Lp01, Lane2 = sfGFP uttrykt fra dotB operon, Lane 3 = DotB-sfGFP uttrykt i en komplett prikk / icm sletting mutant, Lane 4 = DotB-sfGFP uttrykt i en vill type bakgrunn. WB = vestlig blot. Antall kloner som analyseres i hvert trinn, er angitt i parenteser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Levende celleavbildning av L. pneumofila som uttrykker fluorescerende merkede Dot/Icm-underenheter. (A) L. pneumophila fra en to dagers tung patch ble resuspendert i ddH2O og plassert på toppen av 1% lav smeltende agarose pads. (B) Spesifisiteten til fluorescenssignalet til en stamme som kromosomalt koder DotB-sfGFP ble sammenlignet med den foreldre GFP-negative Lp01-stammen. Skalabar = 3 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Kvantifisering av polar lokalisering av dot/icm systemunderenheter. (A) Real-time visualisering av DotB-sfGFP uttrykt i Lp01 viste polar lokalisering. DotB-sfGFP viste et diffust mønster når det uttrykkes i en stamme der hele dot/icm genklyngen ble slettet (T4SS). Unfused sfGFP uttrykt fra dotB operon viste et diffust cytosolsk mønster og fungerte som en kontroll. Skalabar = 3 μm. (B) Kvantifisering av DotB-sfGFP fluorescensintensitet langs langsgående aksen av celler med polare eller diffuse mønstre. Prøvestørrelsene var n = 20 celler for polare og ikke-polare celler. *p = 0,02, **p ≤ 0,0001. Betydningen ble beregnet av to-tailed Student t-test og sammenlignet med intensiteten på polet. (C) Skjematisk modell av maskene som brukes til å kvantifisere polaritet. (D) DotB-sfGFP som vist i figur 5A med maskene som brukes til å kvantifisere polaritet. (E) Overflodav DotB-sfGFP på polene, når den uttrykkes i en vill type bakgrunn eller når hele dot / icm genklyngen ble slettet, vises som frekvenskurver. Prøvestørrelsene var n = 200 celler for hver stamme. * p < 0.0001. Betydningen ble beregnet av to-tailed Mann Whitney test og sammenlignet med sfGFP uttrykt fra dotB operon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Kvantifisering av dynamikken i Dot/Icm fluorescerende fusjoner. (A) En skjematisk modell som viser maskene som brukes til å kvantifisere endringene i fluorescensintensitet for et dynamisk eller statisk sfGFP fusjonsprotein. T1,2 er tidspunktet for første og andre gang poeng og m1,2,3 er maske 1, maske 2, og maske 3. (B) Dynamikken i DotB-sfGFP, DotO-sfGFP og sfGFP uttrykt fra dotB operon vises som frekvenskurver. Prøvestørrelsene var n = 400 celler for hver stamme. *p = 3,4 × 10-12, ***p = 1,0 × 10-147. Betydningen ble beregnet av to-tailed Student t-test sammenlignet med sfGFP. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Subtomogram snitt brukes til å bestemme sfGFP tetthet av DotB-sfGFP. (A) En tomografisk skive kjøpt med 26 000 x forstørrelse fra en representativ L. pneumophilacelle som uttrykker DotB-sfGFP, som viser flere Dot/Icm-maskiner innebygd i cellekonvolutten. (B) En tomografisk skive kjøpt med en 42 000x forstørrelse av samme L. pneumophila cellepol vist i A. OM = ytre membran, IM = indre membran. (C) En rekonstruksjon fra en stamme som uttrykker DotB-sfGFP viser tettheter som tilsvarer DotB og sfGFP (gule piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Tredimensjonale overflategjengivelser av Dot/Icm cytosolic-komplekset. Tredimensjonale overflategjengivelser av hele Dot-Icm T4SS fra ➞dotB (A), vill type (B) og dotB-gfp (C) L. pneumophila stammer. (D) Strukturen i det cytosolske komplekset viser plasseringen av DotB (lilla) og sfGFP (grønn). Røntgenstrukturen til DotB (PDB: 6GEB23) ble dokket til DotB-kartet. IM = indre membran. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Å belyse funksjonene til bakterielle sekresjonssystemer er nøkkelen til en fullstendig forståelse av vertspatogeninteraksjoner. Sekresjonssystemer er komplekse maskiner som kan injisere effektorer proteiner i vertsceller, og i noen tilfeller fremme etablering av en subcellulær nisje som støtter bakteriell replikering. Ovennevnte metode gir viktige nye verktøy for å studere Dot / Icm sekresjonssystemet til luftveisbakteriell patogen Legionella pneumophila, noe som gir ledetråder til mekanismene for effekteller translokasjon som er avgjørende for sin patogenitet. Denne tilnærmingen kan brukes på andre sekresjonssystemer ved å bruke levende bakteriell celleavbildning og strukturelle studier for å dissekere aktiviteten på molekylært nivå. Dette kan oppnås ved å studere spatiotemporal dynamikken i fluorescerende merket sekresjon systemkomponenter ved hjelp av time-lapse video mikroskopi.

Vi konstruerte rene og umerkede mutasjoner, hvor et gen ble tagget eller erstattet av en modifisert allele, som er en grunnleggende tilnærming for forståelse av patogene på molekylært nivå, samt for definisjonen av struktur-funksjon relasjoner som kan føre til produksjon av narkotika terapi24,25. Stammer av L. pneumophila som har blitt genetisk modifisert for å eliminere individuelle Dot og Icm proteiner kan brukes til å bestemme strukturen i Dot / Icm systemet ved cryo-ET. Et viktig skritt i protokollen er å sammenligne funksjonaliteten til N-terminus og C-terminus merkede proteiner. Derfor, stammer koding fusjoner bør testes for replikering i eukaryyotiske vertsceller, visualisert av mikroskopi for å avgjøre om merket protein lokalisering i bakteriell celle er avhengig av en fullt montert sekresjon maskin, og vurderes for stabilitet av proteiner uttrykt fra oppstrøms og nedstrøms gener.

Denne protokollen benytter levende cellemikroskopieksperimenter, som er mye brukt til å studere komplekse biologiske prosesser som signaltransduksjon, selvmontering, aktiv handel og genregulering. Å forstå dynamikken, banene og interaksjonene til enkeltpartikler i celler representerer en grunnleggende tilnærming i cellebiologi26. Gitt at sporing av enkeltpartikler ikke alltid kan være mulig på grunn av rask molekylær bevegelse eller lavt signal-til-støy-forhold, kan evaluering av endringer i fluorescensintensitet tjene som en enkel tilnærming for å kvantifisere forskjeller i dynamikkmønstre. I tillegg, fordi bare to tidspunkter er nødvendig for analysen, garanterer denne metoden bare minimal eksponering av prøven for fluorescerende lys og dermed forhindrer stor bleking av sfGFP fluorescensintensiteten. Fordi agarose pads ikke inneholder noen kilde til næringsstoffer, er det viktig å merke seg at levende bildebehandling skal utføres umiddelbart etter å ha tatt cellene fra CYE agar plater. Hvis lengre perioder med bildetid er nødvendig, bør kosttilskudd som støtter L. pneumophila overlevelse og vekst legges til pads. Bestemme polariteten av fluorescerende merkede proteiner kan også endres for høy gjennomstrømning applikasjoner. Hvis disse er nødvendige, bør et fasemål og et passende kondensatoroppsett brukes til å skaffe tokanalsbilder (dvs. fase- og fluorescerende kanaler). Det er avgjørende å velge felt der bakteriene er helt separert. Bruk fasekanalen til å maskere hele celler og kvantifiserforholdet mellom intensiteter som beskrevet ovenfor.

Kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) og cryo-ET tilbyr robust visualisering av nanopartikler. Disse teknikkene involverer avbildning av prøven i en frossen-hydrert tilstand, slik at visualisering av nanopartikler i hovedsak som de eksisterer i deres cellulære miljø27. Fordi oppløsningen er begrenset av tykkelsen på prøven, har strukturer oppnådd ved cryo-ET lavere oppløsning enn de som oppnås av cryo-EM. Likevel, fordi i hvert bilde tomogram type IV maskiner er til stede i flere kopier, kan økt oppløsning oppnås ved å øke prøvestørrelsen for subtomogram snitt. En stor fordel med cryo-ET er at visualisering av komplekse forsamlinger i intakte bakterielle celler bedre kan bevare strukturen, noe som kan gjennomgå drastiske endringer ved utvinning fra deres naturlige miljø.

Til slutt er studiet av dynamiske prosesser og lokalisering av molekyler blant de første skrittene mot å forstå funksjonen til biologiske systemer. Styrken og fokuset på metoden som er beskrevet her er direkte visualisering av Dot / Icm komponenter i levende bakterier, noe som gir mulighet til å avdekke dynamiske prosesser som styrer funksjonene til type IVB-maskiner eller andre multiprotein samlinger. I tillegg er kobling av levende avbildning til cryo-ET en strategi som gjør det mulig å karakterisere viktige komponenter i Dot/Icm-maskinen i forhold til den større strukturen i Legionella pneumophila sekresjonssystemet, og forståelse av hvordan de monterer og direkte konformasjonsendringer i apparatet. En begrensning av fluorescerende proteinkoder som brukes til å studere proteinatferd i levende celler, er deres relativt store størrelse, noe som kan påvirke funksjonen og egenskapene til det kodede proteinet. Deretter er det nødvendig med vurdering av stabilitet og funksjonalitet. En annen begrensning av denne tilnærmingen er at for tiden atomstrukturer ikke kan oppnås på grunn av den begrensede oppløsningen som følge av tykkelsen på prøven. Modellering og tilpasning kan være en effektiv måte å analysere tetthetene på, og dermed tillate lokalisering av underenheter eller evaluering av konformasjonsendringer. Fremtidige undersøkelser og ytterligere perfeksjonering av denne tilnærmingen vil føre til en bedre forståelse av hvordan ulike subassemblies utgjør en funksjonell type IV apparat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

D.C. og C.R.R. ble støttet av NIH (R37AI041699 og R21AI130671). D.P., B.H., og J.L ble støttet av National Institutes of Health (R01AI087946 og R01GM107629).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 nm colloidal gold particles Aurion 25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA) Nikon
ACES Sigma-Aldrich A9758
Activated charcoal Sigma-Aldrich C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt American bioanalytical AB00981
Bacto dehydrated agar BD 214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera Photometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL Fisher Scientific AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh Quantifoil Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 216828
K2 Summit camera for cryo-EM GATAN
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352
Microscope cover slides 22x22 mm Fisher Scientific 12-542B
Microscope cover slides 24x50 mm Fisher Scientific 12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm Globe Scientific 1380
SlideBook 6.0 Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine Lumencor
Taq 2X Master Mix New England BioLabs M0270
Titan Krios Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract BD 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
  2. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
  3. Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
  4. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  5. Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
  6. Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
  7. Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
  8. Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
  9. Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
  10. Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
  11. Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
  12. Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
  13. Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
  14. Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
  15. Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
  16. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  17. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  18. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
  19. Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
  20. Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
  21. Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
  22. Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
  23. Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
  24. Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
  25. Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
  26. Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
  27. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 157 Legionella pneumophila Legionærsykdom luftveisinfeksjon intracellulære bakterielle patogener type IV sekresjonssystem Dot/Icm sekresjonssystem levende celleavbildning spatiotemporal dynamikk kvantitativ fluorescensmikroskopi kryoelektrontomografi cellulære strukturer allelsyreutveksling
Bruke Live Cell Imaging og Cryo-Electron Tomography for å løse spatiotemporal funksjoner av <em>Legionella pneumophila</em> Dot / Icm Sekresjon System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu,… More

Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu, J., Roy, C. R. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (157), e60693, doi:10.3791/60693 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter