Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tillämpa Live Cell Imaging och Cryo-Electron Tomografi för att lösa Spatiotemporal Funktioner i Legionella pneumophila Dot / Icm Sekretion System

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60693
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,2, 1
1Department of Microbial Pathogenesis, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University School of Medicine, 2Microbial Sciences Institute, Yale University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Bildbehandling av bakterieceller är en framväxande systembiologi strategi inriktad på att definiera statiska och dynamiska processer som dikterar funktionen av stora makromolekylära maskiner. Här används integrering av kvantitativ levande cellavbildning och kryoelektrontomografi för att studera Legionella pneumophila typ IV sekretion system arkitektur och funktioner.

Abstract

Dot/Icm sekretionsystem av Legionella pneumophila är en komplex typ IV sekretion system (T4SS) nanomaskin som lokaliserar vid bakteriepolen och förmedlar leverans av protein och DNA substrat för att rikta celler, en process som i allmänhet kräver direkt cell-till-cell kontakt. Vi har nyligen löst strukturen på Dot / Icm apparaten genom cryo-elektrontomografi (cryo-ET) och visade att den bildar en cell kuvert-spänner kanal som ansluter till en cytoplasmatisk komplex. Tillämpa två kompletterande metoder som bevarar den inhemska strukturen av exemplaret, fluorescerande mikroskopi i levande celler och cryo-ET, möjliggör in situ visualisering av proteiner och assimilering av stoichiometry och tidpunkten för produktionen av varje maskinkomponent i förhållande till andra Dot / Icm underenheter. För att undersöka kraven för polarpositionering och att karakterisera dynamiska funktioner i samband med T4SS maskin biogenesis, har vi smält en gen kodning supermapp grönt fluorescerande protein till Dot / Icm ATPase gener på sina inhemska positioner på kromosomen. Följande metod integrerar kvantitativ fluorescensmikroskopi av levande celler och cryo-ET för att kvantifiera polarlokalisering, dynamik och struktur av dessa proteiner i intakta bakterieceller. Tillämpa dessa metoder för att studera Legionella pneumophila T4SS är användbart för att karakterisera funktionen av Dot / Icm systemet och kan anpassas för att studera en mängd olika bakteriella patogener som använder T4SS eller andra typer av bakteriell sekretion komplex.

Introduction

Legionella pneumophila (L. pneumophila), det etiologiska medlet för legionärssjuka, bebor sötvattenreservoarer, där bakterierna propagerar genom att infektera och replikera inom vattenlevande frisimning protozoer. L. pneumophila orsakar sjukdomsutbrott hos människor när inandning av aerosoliserade bakterier från dricksvattenkällor uppstår. I infekterade celler, subversion av värdvägar tillåter L. pneumophila att fördröja endocytic mognad av vacuole där den bor och att främja biogenes av ett cellulärt fack som stöder bakteriell replikering. Denna process drivs av en specialiserad bakteriell typ IVB sekret system (T4BSS) känd som Dot / Icm och dess repertoar av över 300 "effector" proteiner som transplaceras i värden cytosol under infektion för att underlätta manipulation av cellulära funktioner1,2,3,4,5. Mutanter som saknar en funktionell Dot/Icm-apparat misslyckas med att leverera effektorer till värden cytosol, är defekta för intracellulär replikering och är avirulent i djurmodeller av sjukdom6,7.

Många bakteriearter har utvecklat extremt komplexa och dynamiska multikomponentmaskiner som krävs för infektionsprocesser. Andra T4BSS som Dot / Icm systemet är också viktigt för intracellulär replikering av bakteriella patogener som Coxiella burnetii och Rickettsiella grylli. Även om T4BSS är evolutionärt relaterade till prototypiska typ IVA-system, som förmedlar DNA-överföring och kan leverera en begränsad repertoar av effektorproteiner, har Dot/Icm-systemet nästan dubbelt så många maskinkomponenter och levererar en mängd olika effektorer. Förmodligen har denna expansion i antalet komponenter gjort det möjligt för Dot / Icm apparaten att rymma och integrera nya effektorer lätt8,9.

Vi använde nyligen kryoelektrontomografi (cryo-ET) för att lösa strukturen på Dot / Icm apparaten på plats och visade att den bildar en cell kuvert-spänner kanal som ansluter till en cytoplasmatisk komplex. Ytterligare analys visade att cytosolic ATPase DotB associerar med Dot / Icm systemet vid L. pneumophila cellpolen genom interaktioner med cytosolic ATPase DotO. Vi har upptäckt att DotB visar en cyklisk rörelse i de flesta bakterieceller, vilket tyder på att denna ATPase finns i en dynamisk cyklisk population men också associerar med polardot/Icm-komplexen. Dessutom bildar DotO en hexameric montering av DotO dimers i samband med det inre membrankomplexet, och en DotB hexamer ansluter sig till basen av detta cytoplasmatiska komplex. Monteringen av DotB-DotO energikomplex skapar en cytoplasmatisk kanal som leder flyttningen av substrat genom T4SS(figur 1)10.

Trots dessa senaste framsteg, är lite känt om hur Dot / Icm systemet fungerar och hur varje protein monteras för att bilda en aktiv apparat8. Att upptäcka de regulatoriska kretsarna i Dot/Icm T4SS är grundläggande för att förstå de molekylära mekanismerna för värdpatogena interaktioner. Därför diskuterar vi hur man använder levande cellmikroskopi och cryo-ET för att upptäcka och karakterisera viktiga L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter som är märkta med super-mapp GFP (sfGFP). Med kvantitativ fluorescensmikroskopi definieras polarlokaliseringen av DotB i en bakgrund av vild typ eller när typ IV-systemet tas bort. Time-lapse mikroskopi kommer att användas för att kvantifiera skillnader i lokalisering och dynamik mellan Dot / Icm cykliska ATPases.

Den kombinerade tillämpningen av två kompletterande metoder såsom live imaging och cryo-ET ger en fördel jämfört med andra in vitro-system. Båda metoderna utförs i intakta celler och bevarar den naturliga miljön i T4BSS, vilket minimerar störningar i den inhemska strukturen under provberedningen. Eftersom överuttryck av proteiner kan försämra sekretapparatens stoichiometry returneras sfGFP-fusioner via allelisk utbyte till Legionellakromosomen så att varje fusion kodas i ett enda exemplar och uttrycket drivs av den endogena promotorn. Visualisering av kromosomallykodade fusioner möjliggör kvantifiering av den exakta proteinnivån som uttrycks vid en definierad tidpunkt. Cryo-ET har också många fördelar för att bestämma strukturen av sekretsystem. Den mest anmärkningsvärda fördelen är att cryo-ET prover består av frysta intakta celler som bevarar inhemska komplex i samband med bakteriell cell arkitektur. Följaktligen kan cryo-ET vara att föredra framför biokemiska reningsmetoder, som extraherar membrankomplex och kan ta bort perifera proteiner från kärnapparaten eller ändra den övergripande strukturen. Dessutom lägger märkning ett protein av intresse med ett skrymmande protein som sfGFP en massa som kan detekteras genom cryo-ET och kan hjälpa till med att kartlägga de olika underkomplex av Dot / Icm apparaten på den struktur som erhålls genom cryo-ET.

Detta tillvägagångssätt är ett kraftfullt verktyg för att avslöja strukturell information om multimolekylära komplex som monteras i bakteriecellmembranet. Tolkningen av strukturer som klarlagts med hjälp av dessa tekniker kommer att hjälpa fältet att förstå hur T4BSS-komponenter fungerar, varför så många komponenter krävs för funktion, hur komponenterna interagerar inom det större komplexet och vilka funktioner dessa underenheter utförs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla förfaranden som innebär tillväxt, manipulering och avbildning av L. pneumophila bör utföras i ett biologiskt säkerhetsnivå 2-laboratorium i enlighet med lokala riktlinjer.

1. Införande av sfGFP i L. pneumophila kromosom med hjälp av allelisk utbyte och dubbel urvalsstrategi(figur 2, figur 3)

  1. Klona in i genersättningsvektorn pSR47S11 följande sekvens: 1 000 bp:n uppströms för intresseplatsen, sedan sfGFP-sekvensen, därefter 1 000 bp nedströms intresseplatsen (figur 2). SfGFP-sekvensen ska placeras i ramen till N-ändstationen eller C-ändstationen slutar med en länkare som innehåller fyra till åtta aminosyror. Omvandla den resulterande vektorn till E. coli DH5αλpir. Senare, streck L. pneumophila (mottagaren) för enstaka kolonier på koljäst extrakt (CYE) agar12 innehåller 100 μg/ml streptomycin och växa i 5 dagar vid 37 °C(figur 3).
  2. Streak L. pneumophila på CYE-agar-streptomycin och växa i 2 dagar vid 37 °C (tunga patch)10. Streak E. coli DH5α omvandlas med pRK600 helper plasmid (hjälpare)13 på LB agar som innehåller 25 μg/mL kloramfenanis. Streck E. coli DH5αλpir (givare) på LB agar som innehåller 50 μg/mL kanamycin.
  3. Utför parning med triföräldrarna: inkubera en koloni av hjälpare, en koloni av givaren, och mottagaren genom att överlagra fläckar av de tre stammarna på en CYE agar platta utan urval och inkubering för 4-8 h vid 37 °C. Som negativa kontroller ruva en hjälpare + mottagare stam mix och en givare + mottagare stam mix under samma tidsperioder.
  4. Återupphäng av parningsreaktionerna i 500 μL ddH2O. Platta 20 μL och 50 μL av reaktionerna på CYE agar som innehåller 100 μg/ml streptomycin och 10 μg/mL kanamycin och växa i 5 dagar vid 37 °C. Streck fyra av de resulterande klonerna på CYE agar som innehåller 100 μg/ml streptomycin och växa i 5 dagar vid 37 °C.
  5. Streak 16 kloner på CYE agar som innehåller 5% sackaros och 100 μg/ml streptomycin och växa i 5 dagar vid 37 °C. Sedan, streck 32 av dessa kloner på CYE agar innehåller 100 μg/mL streptomycin och på CYE agar innehåller 100 μg/ml streptomycin och 10 μg/mL kanamycin och växa i 5 dagar vid 37 °C.

2. Isolering av kloner som integrerade sfGFP i L. pneumophila kromosom

  1. Streak kloner som var känsliga för kanamycin på CYE-agar-streptomycin plattor och bekräfta införandet av sfGFP i kromosomen med koloni PCR. Använd primers som kompletterar sfGFP-genen och till kromosomregionen av intresse för att förstärka insättningspunkten.
    1. Blanda 0,5 μL av var och en av de 10 μM primerlösningarna och en koloni till en slutlig volym av 12,5 μL och denaturering i 10 min vid 95 °C. Kyl på is i 10 min, tillsätt 12,5 μL 2x PCR master mix lösning och utföra en PCR-analys.
  2. Odla tunga fläckar av de isolerade kolonierna på CYE-agar-streptomycinplattor i 2 dagar vid 37 °C. Undersök uttrycksnivåerna och stabiliteten hos sfGFP-fusionerna genom att immunblotta med en anti-GFP-antikropp.

3. Live Cell Imaging av L. pneumophila med fluorescerande taggade Dot / Icm Komponenter

  1. Beredning av agarose kuddar
    1. Gör ca 30 ml av en 1% låg smält agarose lösning i vatten. Mikrovågsugn i en glaskolv i ca 90 s, virvlande ibland, tills agarose är helt upplöst.
    2. Placera två 22 x 22 x 0,15 mm3 glasglasbilder på kanten av en 25 x 75 x 1,1 mm3 glasbild, den ena ovanpå den andra. Stapla två mer 22 x 22 x 0,15 mm3 glasglasbilder på den andra kanten.
    3. Pipette ca 1 ml av smält agarose i mitten bilden mellan de två övre glasglasglas, sedan placera ytterligare 25 x 75 x 1,1 mm3 bild ovanpå den smälta agarose. Försök att undvika bildandet av luftbubblor. Kyl rutschkanorna vid 4 °C i 15 min.
    4. Med hjälp av en skalpell eller rakblad skär duförsiktigt dynan i små rutor, ~5 x 5 mm2. Fäst ett dubbelsidigt lim 17 x 28 x 0,25 mm3 ram på en 25 x 75 x 1,1 mm3 glasbild och placera flera dynor på bilden.
  2. Bildförvärv
    Följande steg beskrivs för ett mikroskop som kontrolleras av SlideBook 6.0 och är utrustade med solid state-ljusare, CCD-monokrom kamera och en 100x objektiv (1,4 numerisk bländare). Om det behövs använder du alternativa mikroskopienheter med lämpliga maskinvaru- och programvarukonfigurationer som kan anpassas enligt protokollinställningarna.
    1. Lös upp ett tungt plåster av L. pneumophila i 1 ml ddH2O, virvel och pipet 2–3 μL av utspädningen på dynorna. Placera en 50 x 24 x 0,15 mm3 täcke försiktigt över den självhäftande ramen.
    2. Justera nd-180 i fångstfönstret. Justera binning till 2 × 2 och använd 488 nm kanal för att exponera provet mellan 500-1.000 ms. Validera fluorescenssignalens specificitet genom att avbilda otaggade L. pneumophila med samma parametrar(figur 4).

4. Kvantifiering av polarlokalisering och dynamik i dot/icm-komponenter

OBS: Följande steg är utformade för bilder med 0,129 μm per pixel som förvärvades med 2 x 2 binning.

  1. Kvantifiering av polaritet för sfGFP fusionsproteiner (figur 5)
    1. Justera bildkontrasten så att bakterierna syns tydligt. Använd regionverktyget för att placera en 0,25 x 1,3 μm2 rektangel som börjar vid polen och sträcker sig in i cytoplasman. Rektangeln måste ligga precis inom bakteriegränserna.
    2. Markera minst 200 bakterier och använd knappen Region för mask för att skapa masker till de områden som är av intresse. Välj Objektunder Maskstatistik och maskomfång. Sedan, under Funktioner och intensitet,markera Medelintensitet och varians.
    3. Exportera data och beräkna polaritetspoängen för varje bakterie som förhållandet mellan variansen och medelintensiteten.
    4. För applikationer med hög genomströmning använder du ett fasmål och en lämplig kondensatorinställning för att hämta bilder med fas- och 488 nm-kanalerna. Se till att välja synfält där bakterierna är helt separerade.
    5. Justera bildens faskanalkontrast till en nivå där bakterierna syns tydligt. Öppna bilden med dubbla kanaler, starta fönstret Skapa segmentmask och ändra kanalen till fas.
    6. Justera ett lämpligt tröskelvärde och ta bort små objekt med knappen Definiera objekt. Under Förfina mask väljer du Ta bort kanter objekt och senare separata masker av bakterier som ligger intill varandra.
    7. Beräkna signalens polaritetspoäng i 488-kanalen för varje cell som tidigare beskrevs i steg 4.1.2–4.1.3.
  2. Kvantifiering av dynamik för sfGFP fusionsproteiner (figur 6)
    FÖLJ instruktionerna i avsnitt 3 för att förbereda ett prov för bildanskaffning. Dynamikdefinieras som förändringar i intensitet över tiden och följande steg är utformade för korta avbildningsperioder (dvs. flera minuter). Lägg till i dynan lämpliga kosttillskott om längre bildperioder önskas.
    1. Markera Timelapsei fönstret Bildinspelning, ange tidsintervall i intervallrutan och ange 2 i rutan Antal tidspoäng. Förvärva två på varandra följande bilder av L. pneumophila uttrycker fluorescerande protein av intresse.
    2. Justera bildkontrasten tills cellerna är tydligt synliga. Följ figur 6A och beskrivningarna nedan för att placera tre olika masker. Använd regionverktyget för att placera en 0,25 x 0,25 μm kvadrat i mitten av minst 400 celler.
    3. Använd knappen Region för mask för att skapa en mask (mask 1) på kvadraterna av intresse. Skapa en ny tom mask (mask 2) och använd pixelverktyget eller polygonverktyget för att markera hela cellområdet i minst 25 slumpmässiga celler, som kommer att användas för att beräkna blekning av fluorescens. Skapa en ny tom mask (mask 3) och använd det stora penselverktyget för att markera områden mellan cellerna, som kommer att användas för subtraktion i bakgrunden.
    4. Under Maskstatistik och maskomfångväljer du Objekt för mask 1 och mask 2. Välj sedan medelintensitet under Funktioner och intensitetoch exportera data från de två maskerna. För mask 3 exporterar du medelintensiteten för hela masken.
    5. Beräkna ändringen av fluorescensintensiteten för varje objekt i mask 1 med hjälp av följande formler:

Equation 1

Equation 2

där mask 1 är en kvadrat på 0,25 μm × 0,25 μm placerad vid cellcentret, mask 2 täcker hela cellen, mask 3 är bakgrunden mellan cellerna, t1 är medelintensiteten i den första tidpunkten och t2 är medelintensiteten i den andra tidpunkten.

5. Upptäckt av sfGFP massdensitet med Cryo-ET

  1. Provberedning, datainsamling och rekonstruktion
    1. Odla en tung fläck av L. pneumophila uttrycker ett fluorescerande märkt Dot / Icm protein på CYE-agar-streptomycin plattor i 48 timmar vid 37 °C. Återupphäng cellerna i ddH2O till OD600 ~0,7. Tillsätt 5 μL kolloidala guldpartiklar (BSA Tracer, 10 nm) till 20 μL av cellsuspensionen.
    2. Pipett5 μL av cellblandningen på nyglödande hålkolgaller (R 2/1 på Cu 200 mesh) och låt stå i 1 min. Blot med filterpapper och frysa i flytande etan med hjälp av en gravitationsdriven kolvapparat enligt beskrivningen tidigare14,15.
    3. Bild de frysta hydrerade exemplaren med ett 300 kV-transmissionselektronmikroskop utrustat med ett fältutsläppspistol, ett energifilter, Volta fasplatta och en direkt detekteringsanordning. Samla enaxlig lutningsserie på 26 000 x respektive 42 000x förstoringar, vilket resulterar i pixelstorlekar på provnivån 5,4 Å/pixel respektive 3,4 Å/pixel.
    4. Använd tomographic paketet SerialEM för att samla bildstackar vid ~ 0 μm defocus, med en rad lutningsvinklar mellan -60° och +60° med 3° stegsökning och ackumulerad dos på ~60 e-/Å2,16. Justera dosfraktionerade filmbilder i varje stapel med MotionCor217. Montera driftkorrigerade stackar med TOMOAUTO14.
    5. Justera driftkorrigerade staplar med IMOD-markörberoende justering18. Rekonstruera tomogram med SIRT-metoden19 för segmenteringar och direkt bildanalys och WBP-metoden20.
  2. Subtomogram analys av sfGFP fusioner prover
    1. Använd tomografiska paketet I3 (0.9.9.3) för subtomogram analys14,21,22.
      OBS: Justeringen fortsätter iterativt, med varje iteration som består av tre delar där referenser och klassificeringmasker genereras, subtomogram är justerade och klassificerade, och klassgenomsnitt är anpassade till varandra.
    2. Använd 4 x 4 x 4 binned subtomograms för en första justering. Sammanfoga partiklar som tillhör klassgenomsnitt och visar elektrontäthet som motsvarar sfGFP. Efter sortering av partiklar med sfGFP-fusioner, använd 2 x 2 x 2 binned subtomograms för en fokuserad anpassning av en region av intresse (som Dot/Icm cytoplasmatiska ATPase-komplexet) för att få en högupplöst struktur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Homolog rekombination med dubbelval i två steg användes för att konstruera den definierade insättningen av sfGFP. I det första steget utfördes triparental parning, där pRK600 konjugativplasmid (en IncP plasmid) från E. coli helper stam MT616 mobiliserades till givaren E. coli stam med självmord vektor pSR47S som innehåller sfGFP genen flankerad av de två homologa regionerna, ursprunget till överföring oriT och Bacillus subtilis counterselection gensacB. Därefter assisterade konjugationssystemet från pRK600 mobilisering av pSR47S-derivatet till L. pneumophila (Lp01, figur 2A). Kloner som framgångsrikt integrerade pSR47S av en enda crossover händelse valdes på grund av antibiotikaresistens genen KanR och förökades för att tillåta en andra crossover. Kloner som förlorade sakbensgenen under den andra crossovern valdes genom att pladska cellerna på det kontraselektiva medlet(figur 2, figur 3). Immunoblot-analys med en anti-GFP-antikropp (α-GFP) utfördes för att avgöra om sfGFP var klyvrad och för att bedöma fusionsproteinets stabilitet soch uttrycksnivå i en vild typ eller i en komplett punkt/icm borttagningsmutant. Innan du fortsätter till mikroskopi bekräftades dessutom korrekt integrering av genen sfGFP i kromosomen av PCR (figur 3). När stabilitet och integration av fusionerna bekräftades utfördes levande cellfluorescerande mikroskopi och den fluorescerande signalklonens specificitet jämfördes med en föräldrasfGFP-negativ stam. Dessutom användes dubbel bildbehandling med ljusfält eller fasmikroskopi för att undersöka andelen celler som hade en specifik fluorescerande signal (figur 4).

Endast en bråkdel av de celler som producerade DotB-sfGFP visade polarlokalisering av fusionsproteinet (figur 5A). För att karakterisera fördelningen av DotB-fluorescenssignal kvantifierades intensiteten i DotB-sfGFP längs den längsgående axeln i dessa celler. DotB intensitet vid polerna var ca 2x högre än i cytosol (figur 5B). Eftersom det är viktigt att avgöra om lokaliseringen av fluorescerande taggade fusionsproteiner har biologisk relevans, frågade vi om DotB-sfGFP-polarlokalisering var beroende av en fullt monterad T4BSS. Därför fastställdes polaritetspoängen för DotB-sfGFP som anger förhållandet mellan genomsnittlig fluorescens mätt vid polerna jämfört med fluorescens mätt nära mitten av cellen för enskilda celler i en vild typ och i en T4BSS-mutant (figur 5C–E). Faktum är att strykningar av hela Dot / Icm systemet upphävde polar positionering av DotB-sfGFP, bekräftar att polar puncta representerar associering av DotB med T4SS och vikten av Dot / Icm maskin för rekrytering av denna ATPase. I de flesta L. pneumophila celler, DotB-sfGFP visade också cykliska rörelse, vilket tyder på att det finns i en dynamisk cytosolic population men kan också associera med polardot/Icm komplex. För att kvantifiera skillnader i dynamisk rörelse mellan DotO och DotB ATPases förvärvades två på varandra följande bilder och förändringar i fluorescensintensiteten fastställdes och jämfördes med sfGFP (figur 6A). Medan sfGFP och DotO-sfGFP visade liten eller ingen dynamiska mönster, DotB-sfGFP intensitet förändringar i cytosol skiftadeoch var betydligt högre. Dessa observationer visar att DotB ATPase var närvarande i en dynamisk cytosolic population och vid en sen monteringreaktion rekryterades den rumsligt dynamiska DotB ATPase till den polarlokaliserade Dot/Icm T4SS (figur 6B).

För att definiera dotb-maskinens rumsliga placering i förhållande till Dot/Icm-maskinen användes cryo-ET för att visualisera den intakta T4BSS-apparaten i en L. pneumophila-stam som uttrycker DotB-sfGFP. Först utfördes rekonstruktion av en L. pneumophila cell som uttrycker DotB-sfGFP och visade typiska flera konformade komplex inbäddade i cellkuvertet (Figur 7A, B). Vi demonstrerade tidigare med hjälp av epistatiska experiment med en mängd dot/icm mutanter, fluorescerande mikroskopi och cryo-ET att DotB är rumsligt beläget under en unik montering av ATPase DotO10. Subtomogram genomsnitt av stammen uttrycker DotB-sfGFP bestäms den övergripande placeringen av DotB i förhållande till intakt T4BSS maskin. Denna analys visade en extra densitet korrelerar med den extra massan av sfGFP (figur 7C). Slutligen anger tredimensionella ytrenderingar av hela Dot/Icm T4SS att sfGFP är placerat under DotB-hexamern, som monteras som en skiva vid basen av det cytoplasmatiska ATPase-komplexet (figur 8)10.

Figure 1
Bild 1: Tredimensionella ytrenderingar av L. pneumophila Dot/Icm T4SS. OM = yttre membran, IM = inre membran, PG = peptidoglycan. Bilden ändrades från Chetrit D. et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk översikt över homolog rekombination och allelisk utbyte som används för att infoga sfGFP i L. pneumophila kromosom. (A)Triparental parning utförs mellan en E. coli MT616 hjälpare stam som hyser konjukanativplasmid pRK600 (en IncP plasmid), en givare E. coli stam som omvandlas med självmord vektor pSR47S, och L. pneumophila som mottagare. (B)Schematisk modell som visar de steg som krävs för att föra in sfGFP i L. pneumophilakromosomen för att generera C-terminals sfGFP-fusionsproteiner. Val av allelska utbyte mutanter genomfördes i två steg, med kanamycin och räknaren valbara markör sacB. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Arbetsflödet för allelic exchange assay. L. pneumophila var streckad på lämpliga val och utväxter gånger (se protokollet avsnittet för detaljer). Senare bekräftades införandet av sfGFP i kromosomen med koloni-PCR med hjälp av grundfärger som kompletterar sfGFP-genen och till kromosomregionen som flankerade insättningsstället. Stabiliteten hos fusionsproteinet undersöktes genom immunoblot analys med hjälp av en anti-GFP antikroppar. Nedre vänstra paneler: Lane 1 = otaggade Lp01, Lane2 = sfGFP uttryckt från dotB operon, Lane 3 = DotB-sfGFP uttryckt i en komplett punkt /icm borttagning mutant, Lane 4 = DotB-sfGFP uttryckt i en vild typ bakgrund. WB = västra blot. Antalet kloner som analyseras i varje steg anges inom parentes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Levande cellavbildning av L. pneumophila som uttrycker fluorescerande taggade Dot/Icm-underenheter. (A) L. pneumophila från en två dagars tung patch återupphölls i ddH2O och placeras ovanpå 1% låg smältande agarose kuddar. (B)Fluorescenssignalens specificitet av en stam som kromosomally kodar DotB-sfGFP jämfördes med den föräldranegativa Lp01-stammen. Skalstång = 3 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Kvantifiering av polarlokalisering av punkt-/Icm-systemunderenheter. (A)Visualisering i realtid av DotB-sfGFP uttryckt i Lp01 visade polarlokalisering. DotB-sfGFP visade ett diffust mönster när det uttrycktes i en stam där hela matrisklustret för punkt/icm togs bort (∆T4SS). Ofunderade sfGFP uttryckt från dotB operon visade en diffus cytosolic mönster och fungerade som en kontroll. Skalstång = 3 μm. (B)Kvantifiering av DotB-sfGFP-fluorescensintensitet längs cellers längsgående axel med polära eller diffusa mönster. Urvalsstorlekarna var n = 20 celler för polära och icke-polära celler. *p = 0,02, **p ≤ 0,0001. Betydelsen beräknades av tvåsidiga Students t-test och jämfördes med intensiteten vid stolpen. (C)Schematisk modell av de masker som används för att kvantifiera polariteten. (D)DotB-sfGFP enligt figur 5A med de masker som används för att kvantifiera polariteten. (E)Förekomsten av DotB-sfGFP vid polerna, när det uttrycks i en vilda bakgrund eller när hela matrisklustret för punkt/icm togs bort, visas som frekvenskurvor. Urvalsstorlekarna var n = 200 celler för varje stam. * p < 0,0001. Betydelsen beräknades av tvåsidiga Mann Whitney test och jämfört med sfGFP uttryckt från dotB operon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Kvantifiering av dynamiken i Dot/Icm fluorescerande fusioner. (A)En schematisk modell som visar de masker som används för att kvantifiera förändringar i fluorescensintensiteten för ett dynamiskt eller statiskt sfGFP-fusionsprotein. T1,2 är tiden för första och andra gången poäng och m1,2,3 är mask 1, mask 2 och mask 3. (B)Dynamiken i DotB-sfGFP, DotO-sfGFP och sfGFP uttryckt från dotB-operon visas som frekvenskurvor. Urvalsstorlekarna var n = 400 celler för varje stam. *p = 3,4 × 10-12, ***p = 1,0 × 10-147. Betydelsen beräknades av tvåsidiga Students t-test jämfört med sfGFP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Subtomogram genomsnitt används för att bestämma sfGFP densitet DotB-sfGFP. (A)En tomografisk skiva som förvärvats med 26 000 x förstoring från en representativ L. pneumophilacell som uttrycker DotB-sfGFP och som visar flera Dot/Icm-maskiner inbäddade i cellkuvertet. (B)En tomografisk skiva som förvärvats med en förstoring på 42 000 x av samma L. pneumophilacellpol som visas i A. OM = yttre membran, IM = inre membran. (C)En rekonstruktion från en stam som uttrycker DotB-sfGFP visar tätheter som motsvarar DotB och sfGFP (gula pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Bild 8: Tredimensionella ytrenderingar av dot/icm cykliska komplex. Tredimensionella ytrenderingar av hela Dot-Icm T4SS från ∆dotB (A), vild typ (B) och dotB-gfp (C) L. pneumophila stammar. (D)Det cytosolickomplexets struktur visar placeringen av DotB (lila) och sfGFP (grön). Röntgenstrukturen i DotB (PDB: 6GEB23) dockades till DotB-kartan. IM = inre membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att klargöra funktionerna i bakteriellsekret system är nyckeln till en fullständig förståelse av värdpatogena interaktioner. Sekretsystem är komplexa maskiner som kan injicera effektorproteiner i värdceller, och i vissa fall främja inrättandet av en subcellulär nisch som stöder bakteriell replikering. Ovanstående metod ger viktiga nya verktyg för att studera Dot / Icm sekret systemet av luftvägarna bakteriell patogen Legionella pneumophila, ger ledtrådar till mekanismer för effektor flyttning som är avgörande för dess patogenicitet. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på andra sekretsystem genom att använda levande bakteriell cellavbildning och strukturella studier för att dissekera deras aktivitet på molekylär nivå. Detta kan åstadkommas genom att studera spatiotemporal dynamiken i fluorescerande taggade sekretion systemkomponenter med time-lapse videomikroskopi.

Vi konstruerade rena och omärkta mutationer, där en gen var taggade eller ersättas av en modifierad allel, vilket är en grundläggande metod för att förstå patogenicitet på molekylär nivå samt för definitionen av struktur-funktion relationer som kan leda till produktion av läkemedelsbehandlingar24,25. Stammar av L. pneumophila som har modifierats genetiskt för att eliminera enskilda Dot och Icm proteiner kan användas för att bestämma strukturen på Dot / Icm systemet genom cryo-ET. Ett viktigt steg i protokollet är att jämföra funktionaliteten hos N-ändstation och C-ändstation taggade proteiner. Därför bör stammar som kodar fusionerna testas för replikering i eukaryota värdceller, visualiseras med mikroskopi för att avgöra om taggade proteinlokalisering i bakteriecellen är beroende av en helt monterad sekretionmaskin, och bedömas för stabilitet av proteiner uttryckta från uppströms och nedströms gener.

Detta protokoll använder levande cellmikroskopi experiment, som ofta används för att studera komplexa biologiska processer såsom signal transduktion, självmontering, aktiv handel och genreglering. Att förstå dynamik, banor och interaktioner mellan enskilda partiklar i celler representerar en grundläggande metod i cellbiologi26. Med tanke på att spårning av enstaka partiklar kanske inte alltid är möjliga på grund av snabb molekylär rörelse eller lågt signal-brusförhållande, kan det dock fungera som en enkel metod för att kvantifiera skillnader i dynamikmönster. Eftersom det krävs endast två tidpunkter för analysen garanterar denna metod dessutom endast minimal exponering av provet för lysrör och förhindrar därmed större blekning av fluorescensintensiteten i SfGFP. Eftersom agarose kuddar inte innehåller någon källa till näringsämnen, är det viktigt att notera att levande avbildning bör utföras omedelbart efter att ha tagit cellerna från CYE agar plattor. Om längre perioder av bildbehandling tid krävs, sedan kosttillskott som stöder L. pneumophila överlevnad och tillväxt bör läggas till kuddar. Bestämma polaritet lysrör taggade proteiner kan också ändras för hög genomströmning applikationer. Om dessa behövs bör ett fasmål och en lämplig kondensatorinställning användas för att hämta bilder med dubbla kanaler (dvs. fas- och lysrörskanaler). Det är viktigt att välja fält där bakterierna är helt separerade. Använd faskanalen för att maskera hela celler och kvantifiera förhållandet mellan intensiteter enligt beskrivningen ovan.

Kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) och cryo-ET erbjuder robust visualisering av nanopartiklar. Dessa tekniker innebär avbildning av provet i ett fryst hydratiserat tillstånd, vilket gör att visualisering av nanopartiklar i huvudsak eftersom de finns i sin cellulära miljö27. Eftersom upplösningen begränsas av provets tjocklek har strukturer som erhålls genom cryo-ET lägre upplösning än de som erhålls genom cryo-EM. Men eftersom i varje bild tomogram typ IV maskinskolor finns i flera kopior, ökad upplösning kan erhållas genom att öka provstorleken för subtomogram genomsnitt. En stor fördel med cryo-ET är att visualisering av komplexa församlingar i intakta bakterieceller bättre kan bevara deras struktur, som kan genomgå drastiska förändringar vid utvinning från sin naturliga miljö.

Sammanfattningsvis är studiet av dynamiska processer och lokalisering av molekyler bland de första stegen mot att förstå funktionen hos biologiska system. Styrkan och fokusför den metod som beskrivs här är direkt visualisering av Dot/ Icm komponenter i levande bakterier, vilket ger möjlighet att avslöja dynamiska processer som styr funktionerna i typ IVB maskiner eller andra multiprotein enheter. Dessutom är koppling live imaging till cryo-ET en strategi som möjliggör karakterisering av viktiga komponenter i Dot / Icm maskinen i förhållande till den större strukturen i Legionella pneumophila sekretion systemet, och förståelse för hur de monterar och direkt konformationella förändringar i apparaten. En begränsning av fluorescerande protein taggar som används för att studera proteinbeteende i levande celler är deras relativt stora storlek, vilket kan påverka funktionen och egenskaperna hos det taggade proteinet. Därefter krävs bedömning av stabilitet och funktionalitet. En annan begränsning av detta tillvägagångssätt är att atomstrukturer för närvarande inte kan erhållas på grund av den begränsade upplösning som följer av provets tjocklek. Modellering och montering kan vara ett effektivt sätt att analysera tätheter, vilket möjliggör lokalisering av underenheter eller utvärdering av konformationella förändringar. Framtida utredningar och ytterligare fulländning av detta tillvägagångssätt kommer att leda till en bättre förståelse för hur olika underenheter utgör en funktionell apparat av typ IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

D.C. och C.R.R. stöddes av NIH (R37AI041699 och R21AI130671). D.P., B.H., och J.L stöddes av National Institutes of Health (R01AI087946 och R01GM107629).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 nm colloidal gold particles Aurion 25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA) Nikon
ACES Sigma-Aldrich A9758
Activated charcoal Sigma-Aldrich C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt American bioanalytical AB00981
Bacto dehydrated agar BD 214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera Photometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL Fisher Scientific AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh Quantifoil Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 216828
K2 Summit camera for cryo-EM GATAN
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352
Microscope cover slides 22x22 mm Fisher Scientific 12-542B
Microscope cover slides 24x50 mm Fisher Scientific 12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm Globe Scientific 1380
SlideBook 6.0 Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine Lumencor
Taq 2X Master Mix New England BioLabs M0270
Titan Krios Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract BD 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
  2. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
  3. Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
  4. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  5. Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
  6. Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
  7. Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
  8. Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
  9. Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
  10. Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
  11. Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
  12. Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
  13. Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
  14. Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
  15. Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
  16. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  17. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  18. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
  19. Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
  20. Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
  21. Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
  22. Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
  23. Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
  24. Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
  25. Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
  26. Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
  27. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).

Tags

Immunologi och infektion Legionella pneumophila Legionärssjuka luftvägsinfektion intracellulära bakteriella patogener typ IV sekretsystem Dot/ Icm sekretion system levande cell avbildning spatiotemporal dynamik kvantitativ fluorescensmikroskopi cryo-elektrontomografi cellulära strukturer allelisk utbyte
Tillämpa Live Cell Imaging och Cryo-Electron Tomografi för att lösa Spatiotemporal Funktioner i <em>Legionella pneumophila</em> Dot / Icm Sekretion System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu,… More

Chetrit, D., Park, D., Hu, B., Liu, J., Roy, C. R. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (157), e60693, doi:10.3791/60693 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter