Summary
تعد منحنيات الاختراق (BTCs) أدوات فعالة لدراسة نقل البكتيريا في وسائل الإعلام المسامية. هنا نقدم الأدوات القائمة على الأجهزة المائعة في تركيبة مع المجهر والفرز تدفق cytometric للحصول على BTCs.
Abstract
إن فهم نقل الكائنات الدقيقة وتشتتها وترسبها في وسائل الإعلام المسامية مهمة علمية معقدة تضم مواضيع متنوعة مثل الديناميكا المائية والإيكولوجيا والهندسة البيئية. إن نميجة النقل البكتيري في بيئات مسامية على نطاقات مكانية مختلفة أمر بالغ الأهمية للتنبؤ بشكل أفضل بعواقب النقل البكتيري، ومع ذلك فإن النماذج الحالية غالباً ما تفشل في الارتقاء من المختبر إلى الظروف الميدانية. هنا، نقدم أدوات تجريبية لدراسة النقل البكتيري في وسائل الإعلام المسامية على مقياسين مكانيين. والهدف من هذه الأدوات هو الحصول على الملاحظة العيانية (مثل منحنيات الاختراق أو ملامح الترسب) من البكتيريا المحقونة في مصفوفات مسامية شفافة. على نطاق صغير (10-1000 ميكرومتر)، يتم الجمع بين الأجهزة microfluidic مع البصرية البصرية مجهرية الفيديو ومعالجة الصور للحصول على منحنيات اختراق، وفي الوقت نفسه، لتتبع الخلايا البكتيرية الفردية على مقياس المسام. على نطاق أوسع، يتم الجمع بين قياس التدفق مع موزع الروبوتية عصامي للحصول على منحنيات اختراق. نحن نوضح فائدة هذه الأدوات لفهم أفضل لكيفية نقل البكتيريا في وسائل الإعلام المسامية المعقدة مثل منطقة hyporheic من تيارات. وبما أن هذه الأدوات توفر قياسات متزامنة عبر المقاييس، فإنها تمهد الطريق لنماذج قائمة على الآلية، وهي ذات أهمية حاسمة للارتقاء. وتطبيق هذه الأدوات قد لا يسهم في تطوير تطبيقات جديدة في مجال الإصلاح البيولوجي فحسب، بل قد يلقي أيضاً ضوءاً جديداً على الاستراتيجيات الإيكولوجية للكائنات المجهرية التي تستعمر الركائز المسامية.
Introduction
وقد دفعت أساسا الدراسات التي تهدف إلى فهم نقل الميكروبات عبر وسائل مسامية من المخاوف من التلوث1, انتقال المرض2 والعلاج الحيوي3. وفي هذا الصدد، تم التعامل مع البكتيريا في الغالب كجزيئات في نماذج النقل4، وقد تم تحديد عمليات مثل الترشيح أو الإجهاد أو تسوية الجاذبية أو إعادة التعبئة من الأغشية الحيوية كمحركات للاحتفاظ بالميكروبات أو نقلها5. ومع ذلك، فإن دراسة نقل البكتيريا عبر المناظر الطبيعية المسامية يمكن أن تطلعنا أيضًا على الاستراتيجيات البيئية التي تدعم نجاحها في هذه البيئات المعقدة. ومع ذلك، يتطلب هذا تجارب جديدة ونماذج رياضية تعمل على مستوى الخلية المفردة أو السكان أو المجتمع المحلي الميكروبي.
البيئات الطبيعية المسامية، مثل تلك الموجودة في منطقة ما هوة تحت الأرض من الجداول والأنهار، هي مستعمرة بكثافة من قبل مجتمعات متنوعة من الميكروبات التي تشكل بيو فيلم6. الأغشية الحيوية تشكل هياكل تعديل تدفق وبالتالي نقل وتشتت البكتيريا في المرحلة السائلة7,8. ويتوقف نقل البكتيريا على مقياس المسام على محدودية توافر المساحة في المصفوفة المسامية والتشتت المرتبط بالحركية، وقد يكون وسيلة فعالة لزيادة اللياقة البدنية الفردية من خلال تقليل المنافسة على الموارد في المناطق الأقل كثافة سكانية. ومن ناحية أخرى، يمكن أن تصل بكتيريا الضباب أيضا إلى مناطق أكثر عزلة من المصفوفة المسامية، وقد يوفر الاستكشاف الموسع لهذه المناطق فرصا إيكولوجية للسكان من الأراضي المُخرَسة10. في نطاقات مكانية أكبر، يحول نمو الغشاء الحيوي مسارات التدفق المؤدية أيضاً إلى انسداد (جزئي) للمسام، وبالتالي، إلى إنشاء ظروف تدفق أكثر قناة وغير متجانسة11. وهذا له عواقب على إمدادات المغذيات والقدرة على التشتت والتردد والمسافة. التدفق التفضيلي، على سبيل المثال، يمكن أن تولد ما يسمى "المسارات السريعة" والبكتيريا المتحركة يمكن أن تحقق سرعات أعلى من التدفق المحلي على طول هذه المسارات12. وهذه طريقة فعالة لزيادة استكشاف الموائل الجديدة.
مجموعة متنوعة من الأدوات الاستفادة من لدراسة نقل البكتيريا المتحركة وغير المتحركة (والجسيمات) في وسائل الإعلام المسامية. النماذج العددية لديها قدرات تنبؤية كبيرة مهمة للتطبيقات ، ولكن غالبا ما تكون محدودة من الافتراضات المتأصلة4. وقد قدمت التجارب على نطاق مختبر13،14 جنبا إلى جنب مع منحنى اختراق (BTC) النمذجة رؤى هامة في أهمية خصائص سطح الخلايا البكتيرية للكفاءة الشائكة15. وعادة ما يتم الحصول على الـ BTCs (أي سلسلة مرات تركيز الجسيمات في موقع ثابت) عن طريق إطلاقات ثابتة وقياس أرقام الخلايا عند تدفق الجهاز التجريبي. وفي هذا السياق، تعكس الـ BTCs ديناميات تشتت البكتيريا في المصفوفة المسامية ويمكن تمديدها بواسطة مصطلح بالوعة حسابي للمرفق. غير أن نمـي نمـيـة الـ BTCs وحدها لا تحل دور التنظيم المكاني للركيزة المسامية أو البيوفيلم لعمليات النقل. وقد ثبت أن أدوات المراقبة العيانية الأخرى مثل التشتت أو الترسبات تقدم معلومات هامة عن التوزيع المكاني أو الجسيمات المحتفظ بها أو المجتمعات المتنامية. Microfluidics هي التكنولوجيا التي تسمح لدراسة النقل في وسائل الإعلام المسامية عن طريق التحقيق المجهري9،12،16، وباستثناء العمل الأخير10، وعادة ما تكون مقيدة النظم التجريبية لمقياس طول واحد من القرار ، وهذا هو ، مقياس المسام أو مقياس الجهاز السائل بأكمله.
هنا، نقدم مجموعة من الطرق المشتركة لدراسة نقل البكتيريا المتحركة وغير المتحركة في المناظر الطبيعية المسامية على موازين مختلفة. نحن نجمع بين ملاحظات النقل البكتيري على مقياس المسام مع المعلومات على نطاق أوسع، عن طريق تحليل BTC. الأجهزة Microfluidic بنيت من الطباعة الحجرية لينة باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) هي متوافقة بيولوجيا، ومقاومة لمجموعة من المواد الكيميائية، والسماح للتكرار بتكلفة منخفضة وتوفير شفافية بصرية ممتازة، فضلا عن ضعف الفلوروسكينية الحيوية للمراقبة المجهرية. Microfluidics استنادا إلى PDMS وقد سبق استخدامها لدراسة نقل الميكروبات في قنوات بسيطة17 أو في هندستها أكثر تعقيدا12. ومع ذلك، تركز تجارب ميكروفليديس عادة على الآفاق قصيرة الأجل، وعادة ما تقتصر المراقبة المجهرية للغلاية الفلورية على السلالات المعدلة وراثيا (مثل السلالات الموسومة بـ GFP). هنا نقدم أدوات لدراسة النقل البكتيري باستخدام أجهزة microfluidic المستندة إلى PDMS في تركيبة مع أجهزة المجهر وأكبر ملفقة من بولي (ميثيل ميتكريلات) (PMMA، المعروف أيضا باسم زجاج شبكي) في تركيبة مع تدفق cytometry. يختلف نظام إدارة المواد البكترية (PDMS) وMMA في نفاذية الغاز وخصائص السطح، مما يوفر فرصًا تكميلية لدراسة النقل البكتيري. في حين أن الجهاز microfluidic يوفر بيئة أكثر سيطرة ، فإن الجهاز الأكبر يسمح بالتجارب على مدى فترات طويلة من الزمن أو باستخدام المجتمعات البكتيرية الطبيعية. يتم استخدام العد المجهري بدقة زمنية عالية في منطقة مخصصة للحصول على BTC في جهاز microfluidic المستند إلى PDMS. للحصول على عدد الخلايا لـ BTC النمذجة من الجهاز القائم على PMMA، ونحن نقدم موزع السائل الآلي الذاتي شيدت في تركيبة مع عملية استئصال الخلايا تدفق. في هذا الإعداد، تمر الخلايا الجهاز المائع ويتم الاستغناء عنها على التوالي في 96 لوحة جيدا. يتم تقييد دقة الوقت بواسطة الحد الأدنى من حجم التي يمكن الاستغناء عنها بدقة وبالتالي معدل التدفق المتوسط من خلال الجهاز fluidic. المثبت في الآبار يمنع النمو ويسهل تلطيخ الحمض النووي لتعداد تدفق التقلبات الخلوية في المصب. لمنع النمو البكتيري أثناء تجارب النقل نستخدم الحد الأدنى من المتوسط (يطلق عليه حاجز الحركة).
وبما أن البروتوكولات لإعداد الأجهزة المائعة على مختلف المقاييس متاحة بسهولة، فإننا لا نقدم سوى بإيجاز تقنيات إنتاج هذه الأجهزة والتركيز بدلاً من ذلك على الإجراءات التجريبية لتسجيل BTCs. وبالمثل، توجد إجراءات روتينية مختلفة للعدّة السيتومترية لتدفق الميكروبات، ويتطلب المستخدمون معرفة الخبراء لتفسير النتائج التي يتم الحصول عليها عن طريق عملية استئصال الانسياب. نحن الإبلاغ عن استخدام رواية الأجهزة microfluidic في تركيبة مع التصوير المجهري لتسجيل BTCs من الخلايا الموسومة الفلورسنت. وعند مقياس المسام، يتم الحصول على السرعات والمسارات المحلية عن طريق معالجة الصور. علاوة على ذلك، نبرهن على استخدام جهاز سائل قائم على PMMA بالاقتران مع العد السيتري للتدفق لمراقبة النقل البكتيري للخلايا الضغيرية وغير المتحركة في بيئات مسامية مستعمر من قبل بيو فيلم حيوي أصلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ظروف الثقافة البكتيرية
- العمل تحت غطاء محرك تدفق لارينار، استخدم 100 ميكرولتر من مخزون من اليوزيموموناس الموسومة GFP KT2440 (1 × 107 مل-1،المخزنة في -80 درجة مئوية) لتطعيم 5 مل من لوريا-بيرتاني (LB) المتوسطة. احتضان في 30 درجة مئوية في حين تهتز في 250 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، resuspend 100 μL من ثقافة بين عشية وضحاها في 5 مل LB المتوسطة واحتضان تحت نفس الظروف ل5H (المرحلة الأسية). عينة aliquot 1 مل في أنبوب 2 مل، والسماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة (~ 15 دقيقة) والطرد المركزي (2300 × ز لمدة 5 دقائق).
- إزالة فائقة وإضافة 1 مل العازلة الحركة إلى بيليه. دوامة لفترة وجيزة لتجانس العينة. تخفيف للوصول إلى تركيز الخلية المطلوبة، على سبيل المثال، 5 × 105 مل-1.
- وفيما يتعلق بالتجارب التي تشمل المجتمعات المحلية الطبيعية، كتلك المستمدة من الجداول، أعدّ وسيلة زراعة غير انتقائية. على سبيل المثال، استخدم مياه الدفق المعقمة المصفاة والمُقلمة أو وسط مائي اصطناعي تم تعديله باستخدام مصدر كربون معقد (متوسط LB).
2. إعداد جهاز microfluidic في بوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS)
- تصميم الهندسة المسامية المطلوبة عن طريق صياغة بمساعدة الكمبيوتر (CAD) البرمجيات18، والذي يتكون من مصفوفة من الدوائر (وهذا هو عقبة غير قابلة للتدفق) ، وصفها حجم نصف قطرها وإحداثيات المركز.
ملاحظة: يتم توفير مثال على هندسة مسامية ذات أحجام عشوائية من الحبوب والمسام في الشكل 1A. وتيسر قناة المراقبة دون عوائق قريبة من المنفذ الحصول على اللجان الخاصة. - بناء على الهندسة المختارة، وإعداد قالب باستخدام معيار SU-8-photolithography18.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن تكون قوالب أمر من مرفق microfabrication مخصصة. من أجل الحصول على تدفق السوائل غير المتجانسة في المستوى الأفقي ، من المهم تصميم سمك غرفة microfluidics بنفس مقدار حجم متوسط حجم الحلق المسامية. ومع ذلك، تأكد من أن أبعاد الجهاز microfluidic هي مناسبة للمراقبة تحت المجهر (على سبيل المثال، العمل على شرائح المجهر). - إعداد 50 غرام من PDMS عن طريق إضافة 10٪ من الرابط عبر (ثنائيثيل، ميثيل الهيدوجين سيلوكسان copolymer) إلى 90٪ من الداستروم بالوزن، وذلك باستخدام حقنة دون إبرة. العمل في ظل ظروف نظيفة وتجنب الغبار قدر الإمكان. اخلط الكواشف اثنين في حاوية نظيفة يمكن التخلص منها وتطبيق فراغ (100 mbar) لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء المذاب والفقاعات من PDMS اللزجة.
- ضع القالب في طبق بيتري (قطره 100 مم ، ارتفاعه 15 مم). صب PDMS على القالب إلى الارتفاع المطلوب (على سبيل المثال، 2-5 ملم). تغطية طبق بتري والاحتفاظ بها في 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات (بين عشية وضحاها لطبقات أكثر سمكا) لعلاج.
ملاحظة: بالنسبة إلى غرض التصور، يجب أن يكون الضوء قادرًا على المرور عبر PDMS، وبالتالي، من المستحسن وجود طبقة رقيقة بين 2 مم إلى 5 مم. طبقات أكثر سمكا (> 5 ملم) تقليل شفافية الجهاز والأرق التي تتعرض للتشوهات أثناء التطبيق. - إزالة القالب من الفرن والسماح للجهاز microfluidic لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد تبريده ، قم بإزالة الجزء المطلوب من PDMS بعناية باستخدام مشرط.
ملاحظة: ضغوط قوية على نتيجة العفن في كسور العفن. لا تلمس PDMS بيدين، حيث أن بصمات الأصابع ستؤثر على الشفافية البصرية. - ختم مؤقتا الجزء السفلي من قناة PDMS (حيث تم نقش الهندسة المطلوبة) مع الشريط. مع 0.5 ملم خزعة قطرها اللكم، بيرس قناة microfluidic لإنشاء مدخل ومنفذ تركيب أنابيب 0.5 مم (القطر الداخلي).
ملاحظة: إن الطبيعة الناعمة لـ PDMS ستضمن ضيقًا بمجرد إدخال الأنبوب. لا يمكن إجراء قنوات مدخل ومنفذ بعد أن تم ختم PDMS إلى الزجاج. - ختم قناة microfluidic عبر ربط البلازما الأكسجين باستخدام مولد التردد العالي (بلازما بوندر، جدول المواد). لهذا، تنظيف شريحة الزجاج سيليكات (25 مم × 75 ملم) مع الإيثانول والسماح لها الجافة. قم بإزالة الشريط من قناة PDMS ووضع القناة مع الجانب المسامية التي تواجه لأعلى. علاج الشريحة الزجاجية سيليكات وأسطح PDMS مع البلازما لحوالي 45 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
- ضع قناة PDMS على الشريحة الزجاجية السيليكات والحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على لوحة ساخنة.
- قم بإزالة الجهاز microfluidic من لوحة ساخنة وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتوصيل مدخل قناة PDMS بالأنابيب. تطبيق فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة الهواء من PDMS، وهو غير قابل تقريبا للسوائل ولكن نفاذة للغاز.
- إعداد 100 مل من العازلة حركية (10 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.1 mM EDTA، تستكمل مع 1٪ ث / الخامس الجلوكوز، وhh 7.0) وحقن 1 مل منه في الجهاز microfluidic باستخدام مضخة حقنة تعمل في 10 ميكرولتر دقيقة-1.
ملاحظة: كما هو أقل من المشبعة PDMS في الغاز (بسبب الخطوة فراغ السابقة)، وسوف تختفي فقاعات داخل ~ 30 دقيقة.
3- إعداد جهاز سائل في بولي (ميثيل ميتكريلات)
- تصميم الهندسة المطلوبة مع برنامج CAD. إذا كان ذلك ممكنا، تأكد من أن الأبعاد مناسبة للمراقبة تحت المجهر (على سبيل المثال، أبعاد لوحة 96 البئر القياسية في تركيبة مع حامل مناسب). ويتكون الجهاز السائل من قاعدة (127 × 127 × 12 مم) وغطاء (127 × 127 × 12 مم) من PMMA.
ملاحظة: يوصى باستخدام برنامج CAD. مثال الرسم الفني هو الموردة في الشكل 1A. - لإنتاج حجرة المسام، عن طريق micromilling عالية الدقة (WF31SA، Mikron)، إزالة 0.5 مم من طبقة PMMA السفلي وطحن الأخدود (1.1 × 1.1 مم) لمطاط O-حلقة. حفر 12 ثقوب مترابطة (M5). هذا سيكون بمثابة قاعدة للجهاز السائل.
ملاحظة: يجب تعديل أبعاد الجهاز المائع لتتناسب مع مرحلة المجهر والمسافة البؤرية. يتم توفير رسم تقني في الشكل S1. - حفر اثنين من الثقوب مترابطة (نوع 1/4-28UNF) ل- في و منفذ في الجزء العلوي من الجهاز fluidic, و 12 ثقوب (5.5 مم) للمسامير. هذا سيكون بمثابة غطاء الجهاز السائل.
ملاحظة: من المستحسن الخبرة في مجال الطحن الدقيق؛ المؤلفين استخدام الدعم من ورشة عمل متخصصة. - من أجل تنظيف وتعقيم الجهاز السائل قبل وبعد كل استخدام، نقع قاعدة وغطاء الجهاز السائل في HCl 7٪ وشطف ثلاث مرات مع المياه الأيونية.
- قاعدة المسمار وغطاء معا باستخدام 12 الثقوب مترابطة.
4. إعداد موزع الآلي
ملاحظة: موزعات السائل المتاحة تجاريا مكلفة وغالبا ما لا توفر المرونة للاستغناء مباشرة من تدفق الجهاز السائل. لذلك، من المستحسن تجميع نظام موزع روبوتي رخيص ومرنة من روبوت XY Plotter (جدول المواد).
- من أجل الاستغناء عن تدفق من الجهاز السائل إلى 96 لوحات جيدا، تحميل موزع الروبوتية على لوحة PMMA وتجاويف طاحونة من 85.8 × 128 ملم مع عمق 1 ملم لعقد عدة 96 لوحات جيدا.
- قم بتوصيل أنبوب تدفق الجهاز السائل إلى الذراع الروبوتية للموزع.
- لتشغيل موزع الروبوتية تحميل bCNC من github: https://github.com/vlachoudis/bCNC واتبع التعليمات لتثبيت البرنامج.
- تنزيل dispenser.py من المواد الداعمة لهذه المقالة.
ملاحظة: يوفر رمز الثعبان هذا مكونًا إضافيًا لـ bCNC لتخطيط موزع روبوتي بسيط. - قم بتوصيل موزع الروبوتية بالكمبيوتر الذي يعمل bCNC ثم تحديد منفذ COM الصحيح.
- في bCNC، انقر فوق زر الصفحة الرئيسية لإرجاع موزع الروبوتية إلى موضع المنزل.
ملاحظة: Homing إرجاع موزع الروبوتية إلى موضع معروف (x = 0 ص = 0) وبالتالي تحسين دقة موزع. - قبل التجربة، أعد عدداً كافياً من 96 بئراً، مع آبار تحتوي على كمية مناسبة من المثبت (مثل التركيز النهائي 3.7٪ فورمالديهايد).
ملاحظة: على سبيل المثال، بمعدل تدفق 0.2 مل0-1،يتم صرف 100 ميكرولتر في كل بئر كل 30 s. لذلك، إضافة 10 ميكرولتر من 37٪ الفورمالديهايد إلى كل بئر للوصول إلى تركيز النهائي من الفورمالديهايد بين 2 و 4٪. وباستخدام ثماني صحون بئر 96 سيسمح بتشغيل التجربة لأكثر من 6 ساعات بإجمالي 768 نقطة بيانات. وعلاوة على ذلك، لاحظ أن الخلايا الموسومة بـ GFP قد تفقد الإشارة الفلورسنت بعد التثبيت باستخدام الفورمالديهايد.
5. تحليل النقل البكتيري باستخدام أجهزة PDMS microfluidic
- ضع جهاز PDMS microfluidic المشبعة سابقا مع العازلة حركية على مرحلة المجهر. استخدام الشريط لإصلاح الأنابيب للحد من اضطراب تدفق أثناء حركة المرحلة.
- نقل مرحلة المجهر إلى قناة المراقبة على مقربة من منفذ. باستخدام المجهر مجال مشرق أو المرحلة النقيض، والتركيز على مركز قناة المراقبة وضبط التكبير لتصور الخلايا البكتيرية الفردية.
- قم بتبديل إعدادات مسار الضوء إلى المجهر الفلوري وضبط وقت تعرض الكاميرا لحل الخلايا البكتيرية الفردية (مثل 100 مللي ثانية)، أو بحيث تكون إشارات الفلوريسنس للخلايا أقوى 3 أضعاف على الأقل من ضوضاء الخلفية.
- بعد ذلك، أدخل أنابيب المدخل في أنبوب 2 مل يحتوي على التعليق البكتيري. عكس اتجاه المضخة والبدء في سحب التعليق بمعدل تدفق 1 ميكرولتر دقيقة-1.
- مسح المقطع العرضي لقناة المراقبة بأكملها تسجيل صورة مركبة كل 2 دقيقة، على مدى كامل مدة التجربة.
6. معالجة الصور الأساسية
ملاحظة: الهدف من هذه الإجراءات الأساسية لمعالجة الصور هو حساب عدد البكتيريا في الصور المسجلة. تعتمد إجراءات المعالجة المثلى على المواصفات الفنية للمجهر والكاميرا ، وكذلك على خصائص الفلوريسنس للسلالات البكتيرية المستخدمة في التجربة ، وبالتالي تحتاج إلى تعديل.
- تصدير الصور الأولى في شكل .tiff.
- استيراد الصور إلى منصة البرمجيات المطلوبة (على سبيل المثال، MATLAB، ImageJ، R أو بيثون).
- إزالة الضوضاء الكاميرا، وهو الاختلاف عشوائية من كثافة بكسل في الصور وصحيح لانحراف بصري. ويمكن القيام بذلك تطبيق مرشح غاوسي على كل صورة: حجم مرشح يعتمد على نوعية جهاز استشعار الكاميرا (مثل CCD أو CMOS). يمكن إزالة الانحراف البصري عن طريق تطبيع كل صورة عن طريق صورة مرجعية جمعت في غياب العينة مع التكوين البصري نفسه.
- احصد الصور إلى منطقة ذات أهمية.
- تحديد قيمة الحد (كثافة البكسل)، بحيث تتضمن القيم التي تتجاوز العتبة الخلايا البكتيرية.
ملاحظة: في حالة إضاءة الصور بشكل غير متساو (بسبب الانحراف البصري أو الضوضاء) قد يكون من المفيد تطبيق عتبة التكيف، والتي تختار قيمة عتبة على أساس شدة الوسط المحلي. - اطرح من كل صورة العتبة المحددة أعلاه.
- Binarize الصورة الناتجة، بحيث تأخذ الخلايا البكتيرية قيمة 1، بينما الخلفية تأخذ قيمة 0.
- إزالة الكتل مع مساحة أصغر من أصغر حجم الخلية البكتيرية.
- جمع الصورة binarized للحصول على العدد الإجمالي للبكسل الكتل المتبقية. تقسيم عدد وحدات البكسل على متوسط حجم (بالبكسل) للخلية البكتيرية: وهذا يوفر تقديرًا للعدد الإجمالي للخلايا.
- معرفة عمق الرؤية ومنطقة التحقيق، وتحويل عدد إلى تركيز (الجسيمات مل-1).
- من الضروري تحديد تركيز تعليق البكتيريا المحقونة. للقيام بذلك، والحقن مع حقنة 1 مل من تعليق ثقافة البكتيريا في قناة المراقبة من جهاز microfluidic نظيفة. سجل الصورة واحسب تركيز البكتيريا المؤثرة (C0)كما هو موضح أعلاه (6.1 إلى 6.10).
- تحليل BTCs عن طريق تطبيع تركيز النفايات السائلة البكتيرية (C) مع تركيز البكتيريا المؤثرة (C0) ومؤامرة C / C0 مقابل الوقت.
7. تحليل النقل البكتيري على مقياس المسام
- من أجل تحليل السرعات المحلية ومسارات البكتيريا المنقولة من خلال مصفوفة مسامية، نقل مرحلة المجهر إلى المنطقة ذات الاهتمام وضبط التركيز على مركز الجهاز microfluidic.
- تعيين المجهر إلى حقل مشرق أو النقيض المرحلة.
ملاحظة: هذا فقط في حالة إشارة الفلوريسنس من الخلية البكتيرية لا يسمح تسجيل الصور في وقت التعرض أقصر من متوسط الوقت البكتيري، وإلا استخدم المجهر الفلوريسنس. - تسجيل الصور الفاصل الزمني، في وقت التعرض الذي يلتقط تشريد البكتيريا (أقصر من متوسط التشرد على عدد من وحدات البكسل أصغر من حجم الكائن)، وهذا يحسن الكشف عن الخلايا البكتيرية (مثل التعرض لل20 مللي ثانية والصور المسجلة كل 50 مللي ثانية). تسجيل الصور على مدى فترة زمنية كافية من أجل تسجيل ما يكفي (ليكون تمثيلياً إحصائياً) من المسارات الأبطأ (على سبيل المثال 3 دقائق).
ملاحظة: تأكد من أن الكمبيوتر يحتوي على مساحة كافية على القرص. - لإزالة الضوضاء الخلفية، اطرح من كل صورة متوسط كل الصور المسجلة. للقيام بذلك، قم بإنشاء مصفوفة تكون نتيجتها مجموع كثافة كل الصور، لكل بكسل، ثم قم بتقسيمها على عدد الصور.
- من الصورة المعالجة (Im) ، حدد معامل التدرج العددي
وتطبيعه بمقدار أقصى قيمة له (الحد الأقصى) ، كما هو محدد أدناه.
- Binarize المصفوفة B عبر عتبة كثافة، انظر الخطوات 6.7-6.8.
- لكل نقطة زمنية، تسجيل إحداثيات البكتيريا (x، ص في بكسل أو مم) ووقت الحصول على الصورة في ملف من ثلاثة أعمدة.
- وأخيراً، قم بتطبيق برنامج تتبع الجسيمات لمعالجة البيانات المسجلة وحساب مسارات البكتيريا. على سبيل المثال استخدام البروتوكول19المنشأة ، و حرة المتاحة Matlab الجسيمات تتبع رمز : (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
وتطبيعه بمقدار أقصى قيمة له (الحد الأقصى) ، كما هو محدد أدناه.
8. دراسة الترشيح البكتيري عن طريق ملامح ترسب
- للحصول على ملامح ترسب من GFP الموسومة P. putida KT2440 الخلايا عن طريق المجهر الفلوريسنس، تسجيل صورة مركبة للقناة كامل المسامية من قبل، وهذا هو الخلفية، وبعد حقن التعليق البكتيري من خلال الجهاز microfluidic. استخدام وقت التعرض الذي يسمح بالحصول على إشارة الفلورسنت البكتيرية (على سبيل المثال 100 مللي ثانية)، دون تبييض الإشارة.
- تصدير الصور والاستيراد في منصة البرمجيات المطلوبة (انظر 6.1-6.2).
- إزالة الخلفية من الصور المسجلة بعد الحقن البكتيري.
- دمج إشارة الفلورس للبكتريا المحتفظ بها على طول الأجزاء العرضية للقناة المسامية.
- من أجل حساب التشكيل الجانبي ترسب، رسم إشارة الفلوريسانس المتكاملة مقابل طول قناة مسامية.
9. تحليل النقل البكتيري باستخدام أجهزة مائعة PMMA و تدفق cytometry
- توصيل مضخة ال peristaltic مع مدخل باستخدام 50 سم (1 مم) أنابيب الداخلية، وتدفق مع موزع الآلي باستخدام نفس الأنابيب (50 سم، انظر القسم 4).
ملاحظة: استخدام مضخة لتوزيع وسائل الإعلام زراعة، وحقن الخلايا البكتيرية. استخدم موصلات Luer-lock وصمامات ثلاثية الاتجاه للانتقال بين التعليق المتوسط والبكتيري أثناء إصدار المعدل الثابت. - ضخ زراعة المتوسطة في الجهاز السائل. لاحظ وصول المتوسطة في أنابيب منفذ ثابت إلى موزع الروبوتية.
- بدء حقن تعليق البكتيرية من خلال جهاز مائع PMMA بمعدل تدفق 0.2 مل مين-1،
- عندما تصل البكتيريا إلى مدخل الجهاز السائل تشغيل موزع الآلي.
- من أجل جعل حقن النبض، حقن تعليق بكتيري لبعض أحجام المسام (على سبيل المثال 30)، ومن ثم تحويل الحقن إلى وسائل الإعلام زراعة حتى نهاية التجربة.
ملاحظة: حجم المسام من الجهاز fluidic هو حوالي 0.2 مل، وبالتالي في معدل تدفق prosed كل دقيقة يتم تبادل حجم المسام بأكمله. - بمجرد الانتهاء من لوحة 96 بئر، قم بتغطية اللوحة لتقليل التبخر وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
- تحليل وفرة البكتيريا عن طريق تدفق cytometry، بعد البروتوكولات20المعمول بها .
ملاحظة: على سبيل المثال، أضف 25 ميكرولتر من بقعة الحمض النووي الفلورية الخضراء (جدول المواد) عند 0.025 م م (في الماء فائق السخ) إلى كل بئر. أنه يلطخ الحمض النووي البكتيري، مما يسمح لتحديد كمية عن طريق تدفق cytometry وفرة البكتيريا. عينات احتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام ثم تحليل باستخدام جهاز قياس تدفق مجهزة ليزر 488 نانومتر وأجهزة الكشف في 515 نانومتر. - قبل تحليل BTC ، والنظر في تخفيف العينة بسبب إضافة تثبيت وصمة عار. صحة وفرة البكتيريا بمعامل 1.35 لحساب التثبيت وصمة عار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوضيح وظيفة سير العمل المعروضة، قمنا بإجراء تجارب باستخدام الـ Pseudomonas المعدلة وراثياً، وهي بكتيريا الغرام المتحركة السلبية المهمة للعلاج الحيوي والتكنولوجيا الحيوية. وتتوافر تجاريا نسخ معدلة وراثيا من هذه السلالة التي تعبر عن إنتاج GFP. سلالة غير motile من P. putida KT2440 التي تفتقر إلى الجينات الهيكلية والتنظيمية ذات الصلة لحركية هو متاح أيضا. باستخدام كل من, motile وغير motile GFP الموسومة P. putida KT2440, قمنا بإجراء تجارب متسلسلة في أجهزة microfluidic PDMS مع مجموعة عشوائية من الأعمدة(الشكل 1B)وسجلت BTCs (الشكل 2A). وقد تم تطبيع BTCs إلى تركيز الخلايا المحقونة (C0). في الوقت نفسه، تم تصور المسارات البكتيرية على مقياس المسام عن طريق معالجة الصور وتتبع الجسيمات كما هو موضح أعلاه(الشكل 2B).
بعد ذلك ، قمنا بإجراء تجارب مع أجهزة سائلة واسعة النطاق من PMMA (الشكل 1A). تم حقن Motile وغير motile P. putida KT2440 (غير الفلورسنت) في مصفوفة مسامية متباعدة بانتظام وتم الحصول على BTCs باستخدام موزع السائل والتدفق العد الصلوصي على النحو المبين أعلاه(الشكل 3A). ومن اللافت للنظر، في بيئة مسامية خالية من بيو فيلم، أظهر العلّم وغير المتحرك P. putida KT2440 سلوك نقل مختلف بشكل ملحوظ. في مصفوفة مسامية مستعمرة ل48h مع المجتمع بيو فيلم تيار معقدة، وهذه الاختلافات في BTC بين motile وغير motile P. KTida KT2440 اختفت(الشكل 3B.)
الشكل 1: أجهزة Fluidic لدراسة النقل الميكروبي في وسائل الإعلام المسامية (A) توضيح لجهاز سائل مطحون من PMMA. يتم طحن المصفوفة المسامية في الطبقة الأساسية للجهاز ، يتم إغلاق الغطاء باستخدام مسامير. يظهر المقطع العرضي ترتيب الأعمدة داخل الجهاز المائع. ويبين الإدراج مصفوفة مسامية مع شبكة منتظمة متباعدة من الأعمدة ومجال تدفق السرعة لكل منها. (ب) يتم تركيب جهاز PDMS على شريحة زجاجية مجهرية. تظهر في و الخارج، متصلة الخزان المتوسط ومضخة الحقنة، على التوالي. يتم وضع غرفة المراقبة للعد المجهري كغرفة منفصلة دون مصفوفة مسامية على شريحة المجهر نفسها. يُظهر الإدراج مصفوفة مسامية مع صفيف عشوائي من الأعمدة (في القطر والتباعد). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النقل البكتيري في القناة وحجم المسام في الجهاز السائل PDMS (A) BTCs من الظفر وغير المتحركة P. putida KT2440 (GFP الموسومة) التي تم الحصول عليها مع جهاز PDMS microfluidic والعد المجهري. (ب) مسارات الخلايا غير المتحركة على مقياس المسام. يتم اختيار الألوان لتعزيز التمايز من المسارات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:النقل البكتيري في القناة وحجم المسام فيجهاز PMMA fluidic (A) BTCs من motile وغير motile P. putida KT2440 (غير الموسومة) تم الحصول عليها باستخدام جهاز مائع PMMA والعد التدفقية. (ب) تم استعمار الجهاز السائل من قبل مجتمع تيار طبيعي لمدة يومين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: الرسومات التقنية للجهاز السائل PMMA. يتكون الجهاز من وحدة أساسية تحتوي على مصفوفة مسامية ووحدة غطاء تتميز بالثقوب للمدخل والمنفذ. يتم إغلاق الجهاز باستخدام 12 مسامير و O-حلقة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقترح طريقتين لدراسة نقل الميكروبات من خلال نظم مسامية على مستوى الخلية الواحدة والسكان. وفي حين أن دراسة ظواهر النقل باستخدام نمّام BTC قد وفرت رؤى قيّمة حول انتشار مسببات الأمراض أو الملوثات على نطاقات النظام الإيكولوجي، فإن الصعوبات التي تعترض المدى من التجارب المختبرية إلى الظروف الميدانية لا تزال قائمة. تسمح الأدوات الموصوفة هنا للباحثين بحل المقاييس المكانية والزمانية تجريبيًا من أجل فهم أفضل للاستراتيجيات الإيكولوجية للميكروبات ذات الصلة بالنقل في البيئات المسامية. وقد يستخدم المجربون هذه النظم أو يعدلونها لدراسة سمات ميكروبية أخرى غير حركية الخواص، مثل chemotaxis أو استشعار النصاب أو تعديل هندسة المصفوفة المسامية أو خصائص الموائل الأخرى. وعلاوة على ذلك، فإن سلوك النقل البكتيري، باستخدام هذه الأنظمة، يمكن أن يقترن بسهولة بملفات الترسب، التي توفر رؤى مهمة في أنماط الاستعمار، وهي بالغة الأهمية لفهم كيفية تعديل الأغشية الحيوية لحقول التدفق المحلية. ونتوقع أن يؤدي فهم أفضل للاستراتيجيات الميكروبية لتشتيت واستعمار الوسائط المسامية إلى تحسين التنبؤات النموذجية وبالتالي المساهمة في إدارة انتشار العوامل المسببة للأمراض أو احتواء الملوثات. وقد تسهم تعديلات أخرى للنظام أيضا في تطوير أجهزة ترشيح جديدة أو أدوات للتكنولوجيا الحيوية تحتاج فيها الخلايا إلى الفصل المادي.
نوصي بأجهزة قائمة على PMMA للتجارب الكبيرة والطويلة الأجل وأجهزة PDMS القائمة على أجهزة أصغر وأقصر أمدًا أو عندما تكون الدقة الزمنية العالية حرجة. يجب أن يوضع في الاعتبار أن هاتين المواد لهما خصائص مختلفة. على سبيل المثال PDMS هو نفاذية للغاز مثل الأكسجين، في حين أن PMMA هو الغاز ضيق. ويمكن استخدام هذا الاختلاف لدراسة استهلاك الغاز في سيناريو PMMA، في حين قد تكون PDMS أكثر ملاءمة للتجربة حيث تكون قيود الأكسجين المتعلقة بالتنفس البكتيري غير مرغوب فيها.
بشكل عام، البروتوكولات المذكورة هنا هي بسهولة استنساخ والبيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الأدوات تكشف باستمرار الاختلافات في نقل البكتيريا المتحركة وغير الروتيلية. ويمكن الاستعاضة عن موزع السائل الذاتي ببدائل متاحة تجاريا. ومع ذلك، لأسباب براعة وفعالية التكلفة نوصي واحد هو موضح هنا. وتتعلق الخطوات الحاسمة في البروتوكول أساساً بالتعامل مع الأجهزة المائعة والخبرة في معالجة الصور. وتعتمد جودة البيانات التي يتم الحصول عليها من خلال تحليل الصور اعتماداً حاسماً على جودة الصورة (التي تحددها أساساً فترة التركيز والتعرض) وعلى استراتيجية مناسبة للعتبات. جودة البيانات التي تم الحصول عليها من خلال العد السيتري تدفق بشكل حاسم يعتمد على تحديد فعالة وتلطيخ الخلايا والخبرة في تفسير نتائج تدفق- cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نعترف بمساعدة أنطوان فيدر مع إعداد موزع الروبوتية وسيناريو dispenser.py.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
